bZIP转录因子UvbZIP6介导真菌生长，胁迫反应和假黑穗病的形成gydF4y2BaUstilaginoidea液对gydF4y2Ba

水稻假黑穗病，由gydF4y2BaUstilaginoidea液对gydF4y2Ba它是世界主要水稻产区最具破坏性的疾病之一。碱性亮氨酸拉链(bZIP)蛋白属于进化保守的转录因子家族，在真核生物的各种生物过程中发挥着关键作用，此前已在真核生物中被发现gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba；但是，它们的功能还有待进一步阐明。因此，我们旨在分析UvbZIP6的生物学作用gydF4y2Ba,gydF4y2Ba中的bZIP家族的成员gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．在这项研究中，我们发现gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在接种后第7天高度上调。删除gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba导致真菌生长和对刚果红和氟钙白的敏感性增加，而对高渗透、氧化和十二烷基硫酸钠胁迫的敏感性降低。分生能力降低gydF4y2BaUvbZIP6 -gydF4y2Ba敲除突变体，但分生孢子形态和萌发不受影响。虽然gydF4y2BaUvbZIP6 -gydF4y2Ba敲除突变体在水稻植株中引起侵染，不能形成假黑穗病球。我们的研究表明，UvbZIP6是真菌生长、分生、胁迫反应和假黑穗病球形成所必需的gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

转录因子(TFs)是一种蛋白质，它与目标基因的特定DNA序列结合，调节基因的转录，因此在调节生长、发育和抗应激能力中发挥重要作用(Lambert等。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)是tf的一个超家族，在真核生物中都有发现。bZIP蛋白参与各种生物过程，如抵抗非生物和生物胁迫、种子萌发和发育、形态发生和激素调节(Zhang et al。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba；Droge-Laser et al。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba；Droge-Laser和WeistegydF4y2Ba2018gydF4y2Ba；郝et al。gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在植物中，bZIP蛋白发挥多种功能，包括种子和花的发育、激素合成和信号转导，以及对非生物和生物胁迫的响应。过度的gydF4y2BaZmbZIP4gydF4y2Ba在玉米中促进根系发育和增强脱落酸的合成，从而提高植物对非生物胁迫的耐受性(Ma et al。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．苹果bZIP蛋白MdHY5调控转录gydF4y2BaMdMYB10gydF4y2Ba和花青素生物合成基因，促进硝酸盐还原酶基因和硝酸盐摄取基因的表达，从而在花青素积累和硝酸盐同化中发挥重要作用(An et al.)。gydF4y2Ba2017gydF4y2Ba)．bZIP蛋白OsABF1通过调控水稻抗旱性gydF4y2BaCOR413-TM1gydF4y2Ba它编码一种假定的类囊体膜蛋白。此外，OsABF1直接调控各种基因的表达，在干旱或脱落酸信号通路中形成复杂的反馈回路(Zhang et al.)。gydF4y2Ba2017gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba粳稻gydF4y2Ba大米、bZIP73 (bZIP73gydF4y2Ba^{日本gydF4y2Ba})与bZIP71相互作用，调节脱落酸和活性氧(ROS)的稳态，从而增强水稻对寒冷气候的适应能力(Liu et al.)。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．水稻内质网(ER)膜相关TF OsbZIP74在热应激诱导的蛋白质展开中起着重要作用(Lu et al。gydF4y2Ba2012gydF4y2Ba)．质膜相关的NAC转录因子OsNTL3调控了gydF4y2BaOsbZIP74gydF4y2Ba通过在热应激下与其启动子结合，反过来，OsbZIP74也调节gydF4y2BaOsNTL3gydF4y2Ba．因此，OsbZIP74和OsNTL3可以通过调节内质网、质膜和细胞核之间的相互作用形成适应热应激的回路(Liu et al.)。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在丝状真菌和卵菌中已经发现了许多bZIP蛋白，其中一些参与发育、营养利用和应激反应。过度的gydF4y2BaRsmAgydF4y2Ba，一个bZIP的tf编码基因gydF4y2Ba曲霉属真菌nidulansgydF4y2Ba，显著增加次生代谢产物的产生，并增强对捕食者的抵抗力。此外，RsmA结合于的启动子区域gydF4y2BaaflRgydF4y2Ba在窄尾半胱氨酸基因簇中gydF4y2Ba,gydF4y2Ba它编码C6 TF (Yin et al。gydF4y2Ba2012gydF4y2Ba)．MetR调节硫同化和影响铁的平衡，因此它对致病性是必要的gydF4y2Ba来自烟曲霉属真菌gydF4y2Ba(一种人类病原体)gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba)．在HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba应激条件下，裂变酵母增加bZIP TF基因的表达水平gydF4y2BaATF1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaPCR1gydF4y2Ba以成功适应氧化应激(Fernández-Vázquez等。gydF4y2Ba2013gydF4y2Ba)．bZIP蛋白HapXgydF4y2Ba尖孢镰刀菌gydF4y2Ba在铁稳态、毒力和根际能力中起着主要作用(López-Berges等。gydF4y2Ba2012gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba镰刀菌素graminearumgydF4y2BaFpo1是包皮发育的负调控因子，对营养生长、无性产孢和毒力起着至关重要的作用。删除gydF4y2BaFpo1gydF4y2Ba导致碳代谢的重新编程，包括脂肪酸的产生，这是有性繁殖必不可少的(Shin等。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．Mrap1调节真菌形态、毒力和微菌核的形成gydF4y2Ba绿僵菌属rileyigydF4y2Ba(歌等。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．VdAtf1是穿透性聚乙二醇形成的必要条件，并通过调节一氧化氮(NO)抗性和无机氮代谢促进致病性gydF4y2Ba黄萎病dahliaegydF4y2Ba(唐et al。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．中的bzip的系统描述gydF4y2BaMagnaporthe oryzaegydF4y2Ba揭示了真菌生长、分生、环境胁迫、宿主渗透和致病性的调节机制(Kong等。gydF4y2Ba2015gydF4y2Ba；唐等。gydF4y2Ba2015gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Ustilaginoidea液对gydF4y2Ba水稻稻曲病是世界水稻产区危害最大的水稻病害之一。典型症状是出现黄橙色或深绿色的黑穗病球。除产量损失外，菌痢菌素的产生受到影响gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba对人和动物有害(Hu et al。gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba)．随着基因组数据的发布和高效的CRISPR-Cas9敲除基因系统的开发，包括tf编码基因在内的基因功能的研究已经在加速gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba(Zhang et al。gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba；梁等。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．保守的真菌特异性转录因子UvPRO1在菌丝生长、分生、胁迫耐受和发病机制中是必不可少的。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba)．同源体转录因子UvHOX2有助于衣原体孢子的形成、分生和致病性(Yu等。gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在此之前，我们已经确定了bZIP基因gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba(阴等。gydF4y2Ba2017gydF4y2Ba)，但它们的功能仍不清楚。在这项研究中，通过敲除UvbZIP6的基因来评估其生物学作用gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．结果表明，UvbZIP6参与了真菌的生长、分生和胁迫反应gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．此外，我们还发现gydF4y2BaUvbZIP6 -gydF4y2Ba敲除突变体能够在水稻植株中成功建立侵染，但不能产生假黑穗病球，说明UvbZIP6参与了假黑穗病的形成。gydF4y2Ba

UvbZIP6的序列分析gydF4y2Ba

目的:探讨bZIP蛋白的功能gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba，我们选择了一个含有254个氨基酸(aa)的UvbZIP6蛋白(GenBank: KDB14749.1)作为进一步研究的参考。我们放大了相应的序列gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba从gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba应变JS60-2。结果表明，它编码265-aa蛋白(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。另外，UvbZIP6含有一个bZIP结构域，17号氨基酸是谷氨酸而不是谷氨酰胺。UvbZIP6的同源物也在gydF4y2BaPochonia chlamydosporiagydF4y2Ba和三个gydF4y2Ba绿僵菌属gydF4y2Ba物种;序列比对分析表明，它们在这些物种中是保守的，特别是在bZIP域(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).以UvAP1 (GenBank: KDB19098.1)为外群进行系统发育分析gydF4y2Bam . oryzaegydF4y2BabZIP TF MoAP1，与UvbZIP6相似度低。结果进一步表明UvbZIP6在这5种真菌中具有一定的保守性(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).此外，UvbZIP6的同源物在真菌中分布并不广泛，这表明它们在少数物种中具有潜在的独特作用。gydF4y2Ba

表达谱的gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在不同的阶段gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba感染gydF4y2Ba

深入了解…可能的功能gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba我们采用实时荧光定量PCR (qPCR)方法分析其在不同感染阶段的表达情况。结果表明gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Badpi在接种7 d时达到峰值(图5)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，与when的时间点相吻合gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba显示感染成功，这反映在水稻小穗中产生大量菌丝(Song et al。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba)．这表明UvbZIP6可能在gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba感染。gydF4y2Ba

UvbZIP6gydF4y2Ba基因缺失和ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba突变体互补gydF4y2Ba

描述…的生物功能gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba，我们用之前描述的方法敲除了该基因(Xie et al。gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba)．碎片两侧约1.5 kb的上游或下游gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2BaORF区与湿霉素B磷酸化转移酶基因部分(gydF4y2BahphgydF4y2Ba)．pCAS9:tRp-gRNA载体的构建如前所述(Liang et al。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．我们生成了gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba的ORF来删除突变体gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在野生型(WT)菌株JS60-2中，供体模板包含gydF4y2BahphgydF4y2Ba通过线性供体DNA片段和pCAS9:tRp-gRNA载体转化原生质体。利用不同的引物对，通过PCR扩增对转化子进行验证gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2a、b和附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。通过引入ORF序列得到补充菌株gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba包含本机启动子的区域，进入ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba-5突变(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3a, b)gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba用逆转录PCR (RT-PCR)检测突变株和补充株gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4)。这些结果表明gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba完全灭活在ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba而其在WT和补充株中的转录水平相似。gydF4y2Ba

UvbZIP6参与植物的营养生长和分生gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba

为了研究UvbZIP6在菌丝生长中的作用，我们培养了WT菌株ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在三种不同的培养基(PSA, YTD和PDA)上进行突变和补充菌株。与WT和补充菌株相比，ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba突变体在PSA和PDA培养基上生长速度较快;但在YTD培养基上，这三种菌株的生长速率没有显著差异(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, b)。另外，测定菌丝干重，ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba突变体表现出比WT和补充菌株更高的生物量(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).这些结果表明，UvbZIP6是营养生长的负调控因子。gydF4y2Ba

对分生孢子的生产也进行了检测，以研究UvbZIP6是否参与分生孢子的形成。结果表明，菌株Δ的分生孢子明显减少gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba突变体与WT和补充菌株的比较(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．而WT、Δ之间的分生孢子形态和萌发无明显差异gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba，以及补充菌株(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5)。这些结果表明，UvbZIP6参与了植物的分生gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

UvbZIP6参与了植物的应激反应gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba

为了研究UvbZIP6是否参与胁迫反应，将菌株培养在添加不同胁迫诱导剂的PSA培养基上。与WT和补充菌株相比，ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba突变体在高渗透和氧化胁迫下表现出较低的生长抑制率(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．相比之下，刚果红(CR)或氟钙白(CFW)培养皿的抑制率更高(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这些结果表明，UvbZIP6负向调控高渗、氧化和SDS胁迫反应，而正向调控CR和CFW胁迫反应，表明UvbZIP6参与了植物的胁迫反应gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

UvbZIP6有助于假黑穗病球的形成，而不是感染gydF4y2Ba

通过接种试验确定了UvbZIP6在致病性中的作用gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．虽然接种Δ的水稻小穗中未发现黑穗病球gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba突变体在21 dpi(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa, b)，突变体能够成功感染水稻植株，WT Δ引起的感染小穗数量无显著差异gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba，以及补充菌株(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).进一步观察发现，WT和Δ感染的小穗中发现了丰富的菌丝gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba11 dpi突变体;在15 dpi时，在wt感染菌中开始形成黑穗病球，而不是在Δ中gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba来华的小穗;在18 dpi时，WT产生典型的成熟黑穗病球。但在感染了Δ菌的植株中未观察到黑穗病球gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).此外，还对水稻植株的卵巢发育进行了研究。卵巢被Δ感染gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba保持绿色(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S6)。这些结果表明，UvbZIP6在黑穗病假球形成过程中起着重要作用。gydF4y2Ba

删除gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba是否影响水稻籽粒灌浆相关基因的表达gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba感染可以通过模拟卵巢受精诱导籽粒充盈相关基因的表达(Song et al。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba；风扇等。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．本研究选取了7个与籽粒填充相关的基因进行转录评价，以确定这些基因是否被诱导。结果表明，这些基因在WT-或Δ中均有诱导作用gydF4y2BaUvbZIP6 -gydF4y2Ba尽管它们的表达水平在不同的感染阶段有所不同(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．一般情况下，这些基因在接种WT或Δ后的表达谱gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba结果是相似的，这表明突变体仍然可以通过操纵水稻来获取营养。这些结果表明，ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba突变体不能形成假黑穗病可能是由于发育缺陷，而不是营养吸收能力不足。gydF4y2Ba

全基因组转录分析gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba缺失突变体gydF4y2Ba

tf是基因表达的重要调节因子。目的:探讨UvbZIP6调控的潜在基因gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba在美国，我们使用了WT的三个生物重复-或ΔgydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba-接种水稻小穗进行RNA序列(RNA seq)分析在11 dpi，这是黑穗病球形成的关键早期阶段。每个样本产生了超过4600万个唯一标识符读取(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S2);超过95%的读取映射在gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba或者水稻基因组，大部分都在gydF4y2Ba美国virengydF4y2Bas基因组(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S2)。共检测到565个差异表达基因(DEGs)gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba突变体和WT，包括207个上调基因和358个下调基因，使用阈值为>的两倍表达变化和agydF4y2BaPgydF4y2Ba-value < 0.05gydF4y2Ba8gydF4y2Baa, d;额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S3)。利用基因本体(GO)分析对这些DEGs进行了分类，主要与细胞外区域、质膜、液泡膜和细胞外周的组成部分相关。DEGs主要与氧化还原酶活性、铁离子结合、NADP结合和甲基转移酶活性的分子功能有关。此外，在生物过程中，它们主要与谷氨酰胺代谢过程、跨膜转运和甲基化有关(图1)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab, c).基于KEGG途径的DEGs功能富集gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba表明它们与代谢途径有关。对富集前20个KEGG通路的测定结果显示，代谢通路、次生代谢物生物合成和抗生素生物合成是富集前3个通路(图5)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bae, f).选择7个基因，通过qPCR分析确认RNA-seq揭示的基因表达模式。每个上调或下调基因的表达模式与RNA-seq数据一致(图1)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bag).这些结果表明gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba可能在次生代谢物和抗生素的代谢途径和生物合成中发挥重要作用。gydF4y2Ba

bZIP蛋白是广泛分布于真核生物中的转录因子，其中一些参与营养生长、发育、应激反应和激素调节。然而，UvbZIP6的同源序列仅在少数物种中发现，说明其具有潜在的特异性功能。在本研究中，我们发现UvbZIP6在植物的营养生长、分生孢子、胁迫反应和假黑穗病形成中起着重要作用gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

一些bZIP基因敲除突变体gydF4y2Bam . oryzaegydF4y2Ba表明它们是营养生长的调节因子(Tang et al。gydF4y2Ba2015gydF4y2Ba)．删除gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba导致营养菌丝生长和生物量增加，这在gydF4y2BaUvBI-1gydF4y2Ba敲除突变体(Xie et al。gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba疫霉突变gydF4y2Ba,沉默gydF4y2BaPsBZP32gydF4y2Ba导致囊肿萌发下降，但不影响菌丝生长、孢子囊形成和卵孢子的产生(Sheng等。gydF4y2Ba2021gydF4y2Ba)．在gydF4y2Bam . oryzaegydF4y2Ba，破坏bZIP基因gydF4y2BaMoAP1gydF4y2Ba导致分生孢子形态异常和分生孢子减少(Guo et al。gydF4y2Ba2011gydF4y2Ba)．在菌丝生长和分生孢子形成方面也有缺陷gydF4y2BaFpAda1gydF4y2Ba敲除突变体的gydF4y2Ba镰刀菌素pseudograminearumgydF4y2Ba(陈等。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．在本研究中，分生孢子产量降低gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba-敲除突变体，表明gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba调节分生孢子生产在gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相当数量的bzip参与真菌和卵菌的应激反应。在gydF4y2BaPeronophythora荔枝gydF4y2Ba,gydF4y2BaPlBZP32gydF4y2Ba-沉默突变体比WT菌株对氧化应激更敏感(Kong et al。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．在植物内生真菌中gydF4y2BaPestalotiopsis ficigydF4y2Ba，删除gydF4y2BaPfzipAgydF4y2Ba使其对氧化试剂叔丁基过氧化氢、双胺和甲二酮亚硫酸氢钠(MSB)具有抗性，并增加对HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba王(et al。gydF4y2Ba2015gydF4y2Ba)．植物中的bZIP蛋白也参与胁迫反应。gydF4y2BaZmbZIP4gydF4y2Ba是在非生物胁迫下诱导的，而过表达gydF4y2BaZmbZIP4gydF4y2Ba导致玉米脱落酸合成和抗非生物胁迫的能力增加(Ma et al。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．在本研究中，删除gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba增加了对高渗透、氧化和SDS应激的抵抗力;但对CR和CFW应力的敏感性增加。CR和CFW为细胞壁应力，SDS为膜稳定性应力。这些结果表明UvbZIP6在不同胁迫下的调控机制不同。gydF4y2Ba

接种后7 ~ 9天gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba已经被证明是假黑穗病最初形成的关键时期(Song et al。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba)．在我们的研究中,gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在7 dpi时表达量最高。这时，宿主被殖民化gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba已经完成，并且产生了大量的菌丝，这表明gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在调节菌丝过渡中。OverexpressinggydF4y2BaDKMgydF4y2Ba，一个bZIP基因gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，导致营养和生殖发育缺陷，而gydF4y2BaDKMgydF4y2Ba缺失突变体有更多的花蕾和更长的果实(Lozano-Sotomayor et al。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba)．除了减少营养生长，无性产孢，和毒力，删除gydF4y2BaFpo1gydF4y2Ba在gydF4y2BaFgydF4y2Ba．gydF4y2BagraminearumgydF4y2Ba增加包膜的产生和成熟(Shin et al。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．在这项研究中，尽管gydF4y2BaUvbZIP6 -gydF4y2Ba敲除突变体导致成功感染，它们失去了形成假黑穗病球的能力，这表明UvbZIP6在假黑穗病球的形成中起着关键作用。gydF4y2Ba

在本研究中，我们发现补充菌株不能形成假黑穗病球，但其他表型与WT菌株相似。补充菌株不能恢复WT的全部毒力的现象在之前的一项研究中也得到了证实(Zhang et al。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．这说明并不是所有的基因都能被完全补充gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

bZIP结构域包含一个基本的DNA结合区域和一个相邻的亮氨酸拉链，使bZIP二聚(Dröge-Laser等)。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．TubZIP28通过结合启动子和上调胞质agpase编码基因来促进小麦淀粉合成(Song et al。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．通过调节的表达gydF4y2BaVdNut1gydF4y2Ba， VdAtf1影响渗透栓的形成和营养缺乏性(Tang等。gydF4y2Ba2020gydF4y2Ba)．在本研究中，RNA-seq数据揭示了参与代谢途径、次生代谢物生物合成和抗生素生物合成的DEGs。这些结果表明，UvbZIP6通过参与代谢途径的调控促进了黑穗病的形成。因此，该bZIP蛋白的调控机制有待进一步研究。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们发现gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba是营养生长和抗应激的负调节因子gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．此外,删除gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba的能力gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba产生假黑穗病球，表明其在这一生物过程中的关键作用。然而，尽管在gydF4y2BaUvbZIP6 -gydF4y2Ba敲除突变体后，基因直接受gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba仍然是未知的。因此，UvbZIP6调控的基因有待于进一步研究，以揭示小麦假黑穗病形成的分子机制gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

序列分析gydF4y2Ba

本研究使用的基因和蛋白质的数据下载自gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba数据库(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JHTR00000000gydF4y2Ba)．使用BioEdit进行序列比对，使用基于邻居连接算法的MEGA 7.0进行系统发育分析(Kumar等。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

真菌菌株和培养基gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba液对gydF4y2BaWT菌株JS60-2和gydF4y2BaUvbZIP6 -gydF4y2Ba敲除突变体在马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基上培养27℃。在PSA(马铃薯200 g/L，蔗糖20 g/L，琼脂15 g/L)，马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)(马铃薯200 g/L, D-葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L)和酵母胰蛋白酶葡萄糖(YTD)(酵母提取物1 g/L，胰蛋白酶1 g/L, D(+) -葡萄糖10 g/L，琼脂15 g/L)培养基上培养，评估菌落生长速率。在生物量测定中，6个直径为3毫米的真菌菌塞在50 mL的PSB(无琼脂PSA)培养基中培养7天，转速为160转，温度为27°C;用两层棉纱过滤采集菌丝，50℃干燥3 d后测定重量。菌株在PSB培养基中孵育7天，转速160转，温度27°C。然后，对培养的混合物进行过滤，并用血细胞计测定分生孢子浓度。分生孢子在培养皿上进行萌发试验;在一个平板上选择三个区域，每个区域内观察到100个分生孢子。为了测试抗压能力，我们评估了gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba菌株在含0.5 M NaCl、0.9 M山梨醇、0.03% H的PSA培养基上生长14 dgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba、0.04% SDS、120 μg/mL CFW或200 μg/mL CR，抑菌率计算为:抑菌率(%)= [(PSA上的平均菌落直径-加胁迫剂后PSA上的平均菌落直径)/ PSA上的平均菌落直径]× 100。所有试验均重复3次，每次3个重复。gydF4y2Ba

基因表达分析gydF4y2Ba

使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA样本，使用Thermo scientific的RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher scientific)合成cDNA。将反应混合物稀释6倍作为模板。qPCR使用CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories Inc.)进行。基因的相对表达量用2gydF4y2Ba^{−ΔΔCtgydF4y2Ba}方法。使用三个生物重复的数据计算平均值和标准差。RT-PCR 30个循环，以确认该基因的缺失和重新引入gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba带有指示引物的基因。本试验中使用的所有引物都列在附加文件中gydF4y2Ba2gydF4y2BaS1:表。gydF4y2Ba

的建设与互补gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba缺失突变体gydF4y2Ba

对于CRISPR/Cas系统载体的构建，通过退火有意义(CRISPR_UvbZIP6-F)和反义(CRISPR_UvbZIP6-R)寡核苷酸生成一个短盒(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)，并插入两者之间gydF4y2BaEspgydF4y2BapCas9: tRp-gRNA载体的3I位点如前所述(Liang et al。gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．的gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba通过双联PCR方法生成基因置换结构(Yu et al。gydF4y2Ba2004gydF4y2Ba)．简单地说，上游1.8 kb序列的片段和下游1.9 kb序列的片段gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba被放大gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba用第一轮扩增引物扩增基因组DNA。接下来，5 '和3 '部分gydF4y2BahphgydF4y2Ba分别用引物HYG-F、H3和H2、HYG-R进行扩增。上游和下游的侧翼层序与5 '和3 '部分相连接gydF4y2BahphgydF4y2Ba基因,分别。利用原生质体介导的转化方法将CRISPR载体和重组片段导入原生质体中。产生互补的菌株gydF4y2BaUvbZIP6gydF4y2Ba在缺失突变体中，扩增该基因上游和下游分别有2.0 kb和0.5 kb侧面序列的全长基因组序列，并插入到含有遗传素抗性基因的pKNRG823载体中。然后，利用原生质体介导的转化将载体转化为突变体。gydF4y2Ba

致病性和植物感染分析gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba按照上述描述(Jia et al.)将菌株接种在易感水稻品种(Wanxian-98)上。gydF4y2Ba2015gydF4y2Ba；歌等。gydF4y2Ba2016gydF4y2Ba)．从14日龄真菌菌落上剪下菌丝插头，置于PSB培养基中，以160转/分、27°C振荡7天;收集菌丝并粉碎，测定分生孢子并调整至浓度为5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba与公安局/毫升。在孕穗期后期(抽穗前3-5天)，将含有分生孢子和菌丝的悬液大约2 mL注射到单个水稻穗中。接种后的植株在27°C、相对湿度90-100% (RH)的温室中保存7天，然后置于27°C、80% RH的环境中直至出现症状。接种21 d后测定黑穗病球数。至少进行3次独立生物学试验，每次试验至少12个重复。gydF4y2Ba

RNA序列gydF4y2Ba

RNA提取、文库制备和高通量测序数据分析由康思科技有限公司(中国武汉)完成。使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总rna。使用KC-DigitalTM Illumina®的链RNA文库准备试剂盒(目录NO. 2)制备2 μg总RNA用于链RNA测序文库制备。赛康科技股份有限公司武汉,中国)。对200-500 bp的产物进行富集、定量，最后在Illumina Novaseq 6000上测序。原始测序数据首先由Trimmomatic(0.36版本)过滤，然后用内部脚本进一步处理干净的读取，以消除在文库准备和测序过程中引入的重复偏差。它们被映射到参考基因组gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba粳稻集团(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10gydF4y2Ba),gydF4y2BaUgydF4y2Ba．gydF4y2Ba液对gydF4y2Ba（gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JHTR00000000.1gydF4y2Ba)，使用STAR软件(版本2.5.3a)及默认参数。每个基因外显子区域的Reads通过featucounts (Subread-1.5.1;Bioconductor)，然后计算每千基百万的读数(RPKM)。使用edgeR包(3.12.1版本)识别组间差异表达的基因。错误发现率(FDR)得到纠正gydF4y2BapgydF4y2Ba用0.05的-值截断和2的折叠变化截断来判断基因表达差异的统计学意义。基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)对DEGs的富集分析均采用KOBAS软件(版本:2.1.1)实现，并进行了修正gydF4y2BapgydF4y2Ba-值截断0.05确定富集有统计学意义。使用rMATS(3.2.5版本)检测备选剪接事件，FDR值截断值为0.05，Δψ绝对值为0.05。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用Microsoft Office 2016对数据进行统计分析。数据使用Microsoft Office 2016和GraphPad Prism 8.0制作。显著差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.05)基于单因素方差分析(ANOVA)和LSD检验(使用SPSS Statistics 21.0)确定。gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

bZIP:gydF4y2Ba

基本亮氨酸拉链gydF4y2Ba

CFW:gydF4y2Ba

Calcofluor白gydF4y2Ba

克雷格:gydF4y2Ba

刚果红gydF4y2Ba

dpi:gydF4y2Ba

天post-inoculationgydF4y2Ba

度:gydF4y2Ba

差异表达基因gydF4y2Ba

呃:gydF4y2Ba

内质网gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

最高有效位:gydF4y2Ba

甲萘醌亚硫酸氢钠gydF4y2Ba

没有:gydF4y2Ba

一氧化氮gydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开放阅读框gydF4y2Ba

RH:gydF4y2Ba

相对湿度gydF4y2Ba

RNA-seq:gydF4y2Ba

RNA序列gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

SDS:gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠gydF4y2Ba

TFs:gydF4y2Ba

转录因子gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

感谢西北农林科技大学、普渡大学徐金荣教授提供CRISPR-Cas9系统质粒。gydF4y2Ba

基金资助:湖北省重点研发计划项目(No. 2021BBA236)、国家自然科学基金项目(No. 31701736)和国家重点研发计划项目(No. 2016YFD0300700)资助。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 曲劲松和王玉福对这项工作都有贡献。gydF4y2Ba

作者和联系gydF4y2Ba

1. 华中农业大学植物科学技术学院，植物病理学湖北省重点实验室，湖北武汉430070gydF4y2Ba

   曲劲松，王玉福，蔡敏正，刘悦然，顾力帆，周鹏，杜玉林，徐成辉，王睿，尹卫晓，罗朝西gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

JQ、YW、WY、CL设计实验;JQ、YW、MC、YL、LG、YD、CX、RW分别进行实验;YW、MC、PZ、YL、WY、CL对数据进行分析;JQ, YW, WY和CL写了手稿。所有作者阅读并批准了最终稿件。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaWeixiao阴gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba