二氧化钛和炭黑纳米颗粒通过过度激活细胞朊蛋白信号来破坏神经元内稳态

背景

流行病学新出现的证据表明，人类暴露于环境中存在的一些纳米材料将有助于阿尔茨海默病(AD)的发病和/或进展。然而，纳米颗粒对神经元产生不良影响并参与AD病理的细胞和分子机制尚不清楚。

结果

在这里，我们提供了二氧化钛(TiO₂)和炭黑(CB)纳米颗粒(NPs)结合细胞形式的朊病毒蛋白(PrP^C)，是一种质膜蛋白，因其在朊病毒疾病和朊病毒样疾病(如AD)中的作用而闻名。TiO之间的相互作用₂-或CB-NPs和PrP^C在培养物中生长的神经元细胞表面会腐蚀PrP^C信号的功能。这会触发PrP^C依赖于NADPH氧化酶的激活，随后产生改变氧化还原平衡的活性氧(ROS)。透过PrP^C相互作用，NPs还促进3-磷酸肌醇依赖性激酶1 (PDK1)的激活，这反过来刺激神经保护TACE α-分泌酶的内化。这转移了TACE切割活性，使其远离(i) TNFα受体(TNFR)，其在质膜上的积累增加了np暴露的神经元细胞对TNFα相关炎症的脆弱性，和(ii)淀粉样前体蛋白APP，导致神经毒性淀粉样Aβ40/42多肽的过度生产。PrP的沉默^C或者对PDK1的药理学抑制可以保护神经元细胞免受TiO的侵害₂-和CB-NPs对ROS产生、TNFα超敏性和Aβ的影响上升。最后，我们证明了PrP的失调^C-PDK1-TACE通路可能发生在注射TiO的小鼠大脑中₂当我们监测位于不同大脑区域的几组神经元细胞表面TNFR的升高时，脑室内通路的-NPs。

结论

因此，我们的体外和体内研究首次确定了正常细胞朊病毒蛋白PrP^C作为TiO的神经元受体₂-和CB-NPs并识别PrP^C通过这些纳米颗粒改变氧化还原平衡，增强神经元对神经炎症的内在敏感性，并引发a β肽的上升。通过识别TiO失调的信号级联₂-和CB-NPs，我们的数据阐明了人类接触某些NPs可能与AD有关。

世界范围内神经退行性疾病发病率的增加被怀疑与人类接触各种污染物的增加有关。这包括一些纳米尺寸的材料，即所谓的纳米粒子(NPs)，它们显示出容易跨越生理障碍和与生物系统高度反应的能力(有关综述，请参阅[1]及其中的参考资料)。掺入的NPs是存在于空气中的超细颗粒物，但也有制造的NPs，如银，无定形二氧化硅，二氧化钛(TiO₂)和炭黑(CB)纳米颗粒，市场上的炭黑数量每年都在增加，这对工人和消费者都有影响([2]，如欲查阅，请参阅[3.]及其中的参考资料)。鉴于NP在日常产品(如食品、化妆品、颜料工业等)中的应用多样性以及这些产品释放的NPs，人类经常通过吸入、摄入和/或皮肤途径暴露于这些纳米颗粒。长期接触NPs，即使是低剂量，也会增加NPs转移到大脑的频率，从而增加NPs参与大脑疾病，包括神经退行性疾病的可能性(回顾，见[1]及其中的参考资料)。

根据经济合作与发展组织的数据，阿尔茨海默病(AD)是人类最常见的痴呆症，其负担自1990年以来不断增加，目前全球有5000万人受到影响[4］．这种神经退行性疾病由于神经毒性淀粉样蛋白Aβ肽在大脑中以老年斑的形式积累和沉积，慢慢破坏记忆和思维能力。Aβ肽起源于淀粉样前体蛋白(APP)的淀粉样β-和γ-分泌酶的蛋白水解过程[5］．在AD受试者中，Aβ肽的过量产生取决于几个事件或多或少同时发生，即。， APP表达增加，淀粉样APP加工增加[6，7]， α-分泌酶减少保护性APP切割[8，9]，和/或a β降解酶的损伤[10］．例如，流行病学和实验研究表明，人类接触环境化学污染物，如农药或金属，与痴呆症和痴呆的风险增加有关特发性晚年AD(回顾，见[11]及其中的参考文献，[12，13，14])。这主要与这些化学物质增加Aβ水平、促进Aβ42的聚集和原纤维以及破坏Aβ清除的能力有关[14］．最近，空气中的纳米颗粒物质也被认为与阿尔茨海默病有关，因为生活在空气污染的墨西哥城的年轻人在他们的脑干中表现出阿尔茨海默病的病理迹象[15］．然而，环境超细颗粒物(空气动力学直径< 100纳米)的复杂组成使空气中的纳米颗粒影响神经系统的机制分析变得困难。由于空气中的纳米颗粒主要由碳质材料构成，因此工程炭黑纳米颗粒(CB-NPs)有时被用作空气中的纳米颗粒的替代品[16］．这种工程的CB-NPs显示出比空气中的纳米颗粒更均匀和更明确的物理化学成分和类似的形态。这意味着，在职业或环境人类暴露的背景下，工程NPs也会刺激AD的发病和/或促进AD的进展[1］．

其中产量最大的工程NPs(所有外部尺寸< 100nm)是炭黑(CB-NPs)和二氧化钛(TiO₂-NPs)纳米粒子[17］．人造CB-NPs广泛用于橡胶和黑色颜料。尽管吸入的CB-NPs在小鼠体内具有有害作用，但CB-NPs对脑功能的影响和CB-NPs的神经毒性仍然没有明确的特征，值得进行更多的研究。据报道，在给药后，成年小鼠单次暴露于纯CB-NPs不会改变中枢神经系统(CNS)中IL-1β促炎细胞因子的水平[18］．当怀孕小鼠通过气道暴露于CB-NPs时，子代小鼠会出现神经毒理学症状，包括反应性星形胶质细胞增生[19]以及血管周围富含β-sheet蛋白的增加[20.］．关于纳米TiO₂粒子,TiO₂-NPs是金属氧化物纳米颗粒，广泛应用于食品和化妆品行业，由于其光催化活性，可作为白色颜料的改性剂/增强剂，紫外线阻断剂或抗微生物剂。至于其他金属NPs可以通过嗅觉和/或三叉神经以及体循环到达小鼠和人类的中枢神经系统[21，22，23), TiO₂-NPs可以穿过血脑屏障并在大脑中积聚[24，25]，尤其是在海马体中[26]，这是一种参与记忆过程的大脑结构，在AD中受到早期和严重的影响[27］．在海马体中，不同形式的TiO₂-NPs被证明会产生一些不良影响，如氧化应激、线粒体功能障碍、胶质细胞增生，并引发神经元损伤[1，28，29，30.］．利用重构神经元网络，TiO₂-NPs也被报道严重损害神经元的电活动[31］．然而，CB-和TiO₂-NPs影响神经元内稳态并将神经元置于退化路径尚不清楚。

细胞朊病毒蛋白(PrP^C)，因其不仅可用于朊病毒疾病而闻名(有关综述，请参阅[32]和其中的参考文献)，还有阿尔茨海默病[9，30.，33］．PrP^C是一种普遍存在的蛋白质，主要在神经元中表达，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)部分连接到质膜的外叶，分布在耐洗涤剂的微域，即。脂筏或脂囊[34］．在1C11神经元干细胞系的帮助下，可以分化成血清素能(1C11^{−5 HT})或去甲肾上腺素能(1C11 .^不)神经元经适当诱导后[35]，我们为gpi锚定的PrP分配了一个信令功能^C，作为细胞表面受体或辅助受体[36]并控制不同的信号效应器[37］．这包括NADPH氧化酶和随后产生的有助于氧化还原敏感靶标活化的无毒ROS [38，39］．我们进一步证明了PrP^C与淀粉样朊病毒肽106-126的相互作用破坏PrP^CNADPH氧化酶的过度刺激和氧化应激条件的发生在神经元细胞中的信号传导[40］．最近，我们证明了PrP^C与神经毒性朊病毒(PrP^Sc)或Aβ肽和随后的PrP调节异常^C信号分别在朊病毒感染或阿尔茨海默氏症神经元的质膜上取消了TACE α-分泌酶(ADAM17)的神经保护性切割活性[9，41］．这种TACE失调使患病神经元对tnf α相关炎症高度敏感，并放大PrP的产生^ScAβ肽在AD中的作用以及在朊病毒疾病中的作用[9，42］．因为PrP^C结合PrP的寡聚物、聚集物和/或原纤维^Sc朊病毒疾病[43]，以及AD中Aβ肽的寡聚物[33，44，45]，细胞朊病毒蛋白被怀疑在更广泛的意义上作为一种广泛的传感器，用于检测各种淀粉样蛋白的聚合体[46］．值得注意的是，许多NPs的物理化学性质使它们能够在生物流体中形成聚集物/团聚体[17］．专注于TiO₂-和CB-NPs，本研究调查PrP^C也将是神经元细胞表面受体的聚集/凝聚这些纳米颗粒。TiO之间的相互作用₂-或CB-NPs和PrP^C会腐败人民党^C-偶联信号效应，导致神经元细胞功能障碍和阿尔茨海默病分子体征的诱导。

TiO₂和CB纳米颗粒结合重组细胞朊蛋白PrP^C

首先要评估TiO₂- (P25)或CB- (FW2) NPs与细胞朊病毒蛋白PrP相互作用^C，我们使用商业全长重组小鼠PrP折叠成PrP进行体外结合试验^C．PrP^C(2 μ M)在4°C下孵育2 h，增加TiO浓度₂-或CB-NPs(0-80µg ml⁻¹)(附加文件1:表S1)在轻度搅拌下。然后将混合物以13,523 g离心30分钟，并保留PrP^C利用PrP的本征荧光对上清液中的游离分子进行滴定^C(λ_exc= 280 nm;λ_新兴市场= 340 nm)。PrP的数量^C通过减去滴定后游离PrP的荧光水平，推导出与纳米颗粒的结合^C到PrP的荧光水平^C(2µM)在不含纳米颗粒的情况下测量(图。1一)。1b表示两个TiO₂-和CB-NPs与重组全长PrP相互作用^C．PrP的数量^C与纳米颗粒结合的纳米颗粒浓度随纳米颗粒浓度的变化呈现符合相互作用平衡的双曲曲线^C= PrP^C(NP)。滴定数据的双曲拟合表明PrP亲和^CCB (K)_D12.4±2.2µg ml⁻¹)比用TiO测量的高₂(K_D30.4±10.9 μ g ml⁻¹)．

为了排除游离纳米颗粒，PrP会被淬火^C荧光导致高估与PrP结合的纳米颗粒的数量^CWestern blotting检测重组游离PrP水平^C离心后存在于上清液中。PrP的定量^C水平证实了TiO₂-和CB- nps都与蛋白质相互作用，对CB的亲和力比对TiO强₂(无花果。1c)。

这些体外实验数据表明TiO₂CB纳米颗粒是两种化学成分和物理化学性质不同的NPs [17，47]，两者都绑定PrP^C．

PrP^C促进TiO的绑定₂和炭黑纳米颗粒到1C11前体和血清素能1C11的质膜^{−5 HT}神经细胞

对下一步探测是否TiO₂-和CB-NPs会与PrP相互作用^C在细胞表面，我们开发了1C11神经外胚层细胞系，这是一种神经干细胞，具有分化为血清素能1C11的能力^{−5 HT}神经元细胞经适当诱导[48］．无论微分状态是什么^{−5 HT}细胞内源性表达PrP^C在细胞表面相似的水平[49］．在第一组实验中，1C11和1C11^{−5 HT}细胞暴露于TiO₂-或CB-NPs(10µg cm⁻²24 h后，透射电镜(TEM)分析纳米颗粒的细胞分布。对于这两种类型的纳米颗粒，透射电镜分析显示存在大量的TiO聚集物₂-和1C11和1C11内的CB-NPs^{−5 HT}细胞，可能反映了纳米颗粒的内吞作用(图;2a). TiO的小聚集体₂-和CB-NPs也附着在1C11和1C11的质膜上^{−5 HT}区域内的细胞类似网格蛋白包被的凹坑和包被的小穴(图。2b)，其中PrP .^C显著分布[34，48］．

探讨PrP^C将有助于纳米颗粒与1C11细胞质膜的相互作用，我们利用了TiO₂-NPs和PrP^零-1C11细胞是慢性PrP抑制的1C11细胞^C至少95%的表达[50］．为了避免纳米颗粒被细胞内吞，PrP^零-1C11细胞及其PrP^C表达的小鼠暴露在不断增加的TiO浓度中₂-NPs(0-10µg cm⁻²)在PBS加叠氮化物(0.05%)中4°C浸泡15分钟。TiO₂用流式细胞仪滴定质膜上吸附的-NPs [51］．由于该方法灵敏度低，有明显的TiO相互作用₂-NPs与PrP^C-表达的1C11细胞开始被TiO检测到₂-NP浓度高于1µg cm⁻²．TiO的量₂-NPs附着在1C11细胞表面的数量随着TiO的增加而增加₂-NP暴露浓度(图;2c).值得注意的是，TiO大团聚体的形成₂-NPs浓度大于10µg cm⁻²使得用流式细胞仪探测纳米颗粒与细胞的相互作用成为不可能。由于这种技术限制，TiO₂1C11细胞表面的-NP结合从未达到一个平台，尽管膜有饱和的趋势(图11)。2c).与PrP^零-1C11细胞，我们显示TiO减少~ 25-30%₂-NP与质膜结合，无论测试的纳米颗粒浓度与PrP相比^C-表达1C11细胞(图;2c)，表示PrP^C参与TiO的交互作用₂-NPs与1C11细胞。

TiO₂和CB纳米颗粒选择性结合全长PrP^C

在质膜上存在多种PrP异构体^C，即全长PrP^C和截断的PrP^C残基111/112之间(也称为PrP^CC1片段)。全长和截短PrP^C可以是非糖基化，单糖基化，或双糖基化(回顾，见[52]及其中的参考资料)。以评估哪些PrP^CTiO的目标是异构体₂-或CB-NPs，细胞暴露于0-10µg cm⁻²纳米颗粒(附加文件)2:图S1)，在37°C下，从15到60分钟溶解。细胞裂解液在21,130 g离心分离游离可溶性PrP^C在PrP的上清液(S部分)中^C被颗粒中的纳米颗粒捕获(P部分)。对两个组分进行PrP检测^CPNGase处理后Western-blotting去除糖基化(图。3.一个)。

对于1C11前体细胞，我们观察到全长(FL) PrP的耗竭^C在暴露15分钟时，S分数从1µg cm开始⁻²TiO₂-或CB-NPs(图;3.b,左)。FL - PrP下降^CS分数的含量取决于纳米颗粒的浓度:TiO的浓度较高₂-和CB-NPs，更明显的是FL PrP的降低^C(图。3.b,左)。用10µg cm⁻²TiO₂-或CB-NPs, FL PrP^C在暴露于纳米颗粒15分钟后，在S分数中几乎检测不到(图;3.b,左)。相比之下，无论NPs的浓度如何，C1片段的水平保持不变。3.b,对吧)。这表示TiO₂-和CB-NPs与全长PrP特异性相互作用^C．

值得注意的是，随着质膜FL PrP的耗竭^CTiO诱导₂-和CB-NPs在5µg cm时非常强⁻²和较高的纳米颗粒浓度，可能会影响PrP的鉴定^C-耦合信号通路被纳米颗粒失调。在接下来的实验中，我们决定固定使用的TiO浓度₂-和CB-NPs至1µg cm⁻²．在这些条件下，FL-PrP的消耗^C由1C11细胞暴露于TiO诱导₂-NPs(1µg cm⁻²)在15和30分钟时，比CB-NPs观察到的更明显(图。3.c).相反，FL PrP的量^C与TiO相比，CB-NPs对1C11细胞P部分的积累更为重要₂nps(无花果。3.c).这表明PrP^C在1C11细胞的质膜上，对CB-的亲和力高于对TiO的亲和力₂-NPs，与微分K一致_D用重组PrP测量的值^C(无花果。1b)。

1 c11^{−5 HT}暴露于1µg cm的神经元细胞⁻²TiO₂-或CB-NPs，我们还在FL PrP的S分数中显示了特异性消耗^CC1片段水平的不变性(图。3.d).相反，FL PrP^C发现在P片段中积累，而C1片段几乎检测不到(图。3.d).与1C11前体细胞相比(图;3.c)，我们观察到纳米颗粒与FL PrP相互作用的时滞^C由1C11表示^{−5 HT}神经元细胞:FL PrP^CS分数的消耗和FL PrP的相互积累^CP分数(图;3.d)在暴露于TiO 30 - 60分钟之间开始₂-或CB-NPsvs。15分钟1C11前体(图;3.c). 1C11祖细胞与1C11的差异^{−5 HT}神经元细胞可能反映了全长PrP的一些神经特异性^C这可能是在近端细胞区域化水平(somavs。神经突)和质膜亚定位(筏vs。非筏)，糖基化，和/或PrP的相互作用组^C［34，52］．

综上所述，这些数据支持了全长PrP^C由1C11前体细胞及其血清素能神经元子代表达，是TiO的候选受体₂-和CB-NPs。

TiO的相互作用₂CB纳米颗粒与PrP^C促进1C11细胞系中NADPH氧化酶依赖性活性氧的产生

因为纳米颗粒暴露会引起上皮细胞的氧化应激条件[17]并引发小鼠大脑的氧化损伤[28，30.]，我们检测了纳米颗粒是否与全长PrP相互作用^C会打扰PrP吗^C-NADPH氧化酶的功能关系[38]，促进ROS的积累。

1C11前体细胞及其血清素能1C11^{−5 HT}神经元后代暴露于1µg cm⁻²TiO₂-或CB-NPs在37°C下放置15分钟至24小时。用荧光探针CM-H测定细胞ROS水平₂DCFDA检测超氧阴离子和过氧化氢。曝光1C11或1C11^{−5 HT}cell to TiO₂-或CB-NPs触发的ROS生成随时间而变化(图。4a).无论哪种纳米颗粒，在1C11细胞暴露1小时后开始产生ROS，在1C11细胞暴露2小时后开始产生ROS^{−5 HT}神经元细胞和峰值在6小时在两种细胞类型。与细胞分化阶段无关，TiO诱导的ROS反应最大₂- nps是基础水平的2.5- 3倍。使用CB-NPs时，ROS产生的强度不如使用TiO时重要₂-在1C11和1C11中，最大ROS反应比基础水平高1.5- 1.8倍^{−5 HT}细胞,分别。

对于两个TiO₂炭黑纳米颗粒(1µg cm⁻²)，诱导的ROS生成在1C11和1C11被猝灭^{−5 HT}当使用药理抑制剂罗布麻苷(500µM)抑制NADPH氧化酶时，细胞(图;4b)，表明np诱导的ROS生成依赖于NADPH氧化酶的募集。我们还监测到np诱导的ROS生成在PrP沉默的1C11细胞中被取消^C表达式(无花果。4c)支持人民党的腐败^C通过TiO与NADPH氧化酶偶联₂-和CB-NPs。

最后，我们探讨了在1C11和1C11中纳米颗粒是否会引起ROS水平的升高^{−5 HT}通过使用CellTracker Green CMFDA荧光探针测量还原性谷胱甘肽(GSH)水平，细胞将与氧化应激条件的发生相关。无论暴露时间(6或24小时)，1C11或1C11的治疗^{−5 HT}带有TiO的电池₂-或CB-NPs(1µg cm⁻²)不影响谷胱甘肽水平(图;4d)，表明暴露于TiO的这种条件₂-或CB-NPs不会促进1C11前体细胞及其血清素能神经元衍生物的氧化应激。

总的来说，这些数据表明急性暴露于TiO₂- CB-NPs激发PrP^C依赖于NADPH氧化酶的激活和短暂的ROS积累，这改变了细胞的氧化还原状态，而不会在1C11细胞系中引发氧化应激条件。

TiO的相互作用₂CB纳米颗粒与PrP^C渲染1C11和1C11^{−5 HT}通过中和TACE α分泌酶活性对促炎TNFα细胞因子高度敏感的细胞

我们接下来评估了TiO₂- CB-NPs也会干扰PrP^C-PDK1-TACE信号通路[9，53］．致病朊病毒PrP对这一途径的调控异常^Sc或Aβ肽下调TACE脱落活性，从而导致1型TNFα受体(TNFR1)在质膜上的积累，从而使朊病毒感染和阿尔茨海默氏神经元对TNFα毒性高度敏感[9，41］．

1C11前体急性暴露于TiO₂-或CB-NPs(1µg cm⁻²30min至6 h)可促进质膜上TNFR1免疫染色1 h的增加。细胞表面TNFR1水平的上升最大(增加~ 50%)vs。在纳米颗粒暴露6小时后，TNFR1水平恢复到基础水平(图2)。5a).用血清素1C11^{−5 HT}暴露于1µg cm的神经元细胞⁻²TiO₂-或CB-NPs时，质膜TNFR1水平在4 h时记录到最大的增加(附加文件3.:图S2a)。细胞表面TNFR1的增加本身不影响暴露于TiO的细胞的活力₂-或CB-NPs(1µg cm⁻²)长达24小时，但使np暴露的细胞对外源性TNFα的毒性非常脆弱(图。5b),即。，启动np暴露细胞TNFα炎症应激。用TiO处理1C11细胞24 h₂-或CB-NPs(1µg cm⁻²)与TNFα (200 ng ml⁻¹)，我们确实测量到细胞活力降低了60 - 70%，而仅用TNFα处理1C11细胞的活力降低了40%(图。5b). np暴露的细胞对TNFα敏感性的增加与增强TNFα介导的caspase-3激活有关(图。5c)， TNFR1死亡信号的下游效应因子[54］．在np暴露的细胞中，TNFR1在质膜上的过度暴露并不是由于TiO诱导TNFR1基因转录或翻译的增强₂-或CB-NPs(图;5d)来源于TNFR1的α-分泌酶TACE下脱落。免疫荧光实验显示，暴露于TiO的细胞表面的TACE信号降低(25-35%)₂-或CB-NPsvs。未暴露细胞(图;6a，附加文件3.:图S2b)。

然而，在mRNA上没有记录到TACE表达的显著变化(图。6b)和蛋白质(图。6C)暴露于或未暴露于纳米颗粒的细胞之间的水平。用皂苷(0.05%)渗透细胞时，在np暴露的细胞内发现TACE(图5)。6a)，表示np诱导的TACE内化。

至于朊病毒感染和阿尔茨海默氏症神经元[9，41]，我们发现在np暴露的细胞中TACE内化和随后的TNFR1脱落缺陷依赖于PrP^C-介导的PDK1激酶的激活。TiO₂-和CB-NPs引起了PDK1活性的上升，根据暴露于纳米颗粒(1µg cm)的1C11细胞中Ser241上磷酸化的PDK1分子数量增加了约1.3倍⁻²， 1 h)(图6d). sirna介导的PrP沉默^C或药理抑制剂BX912抑制PDK1(在NP暴露前1µM抑制30 min)阻止了TACE的内化(图。6a，附加文件3.:图S2b)和TNFR1的质膜积累(图S2b)6e、附加文件3.:图S2a) TiO诱导₂-或1C11和1C11中的CB-NPs^{−5 HT}神经细胞。

总之，这些数据证明了交互作用TiO₂-或CB-NPs与PrP^C腐败PrP^C-PDK1信号通路导致TACE α-分泌酶内化。这使得TACE切割活性远离质膜，从而导致细胞表面TNFR1的积累，这是np暴露的1C11和1C11过敏的根源^{−5 HT}细胞对TNFα炎症应激的影响。

人民党的腐败^C-PDK1-TACE通路₂CB纳米颗粒触发Aβ肽在1C11和1C11的积累^{−5 HT}细胞

在朊病毒和阿尔茨海默病中，我们之前证明了PrP^Sc-或a β诱导的TACE α-分泌酶在神经元中的内化也维持了APP转化为神经毒性Aβ40/42肽的淀粉样变性过程[9，42］．因此，我们试图确定人民革命党是否腐败^C-PDK1-TACE通路可引起a β生成的增加。

免疫荧光实验(图;7a)和elisa定量(图;7b、附加文件4:图S3a)显示1C11和1C11急性暴露^{−5 HT}cell to TiO₂-或CB-NPs(1µg cm⁻²)作用2 ~ 24 h，促进了Aβ40和Aβ42肽在细胞内的瞬时上升。在1C11和1C11中，Aβ40/42多肽的积累开始于纳米颗粒暴露2 - 4小时之间^{−5 HT}a β肽在4 - 6小时内达到最大值，1C11细胞的a β肽水平是基础水平的1.5- 1.8倍，神经元细胞的a β肽水平是基础水平的2.0- 2.5倍。我们排除了纳米颗粒诱导的Aβ肽的增加源于APP和/或β-分泌酶(BACE1)表达的增加，因为在暴露于TiO的细胞中，APP或BACE1 mrna和蛋白质没有显著变化₂-或CB-NPs 4小时与未暴露的单元格(附加文件4:图S3b)。值得注意的是，PrP的沉默^CBX912抑制PDK1(1µM)可抑制TiO诱导的Aβ40/42肽的积累₂-或CB-NPs(图;7c、附加文件4:图S3c)。这显示了TiO的容量₂-和CB-NPs通过与PrP相互作用增强阿尔茨海默病神经毒性Aβ肽的产生^C颠覆PrP^C与PDK1-TACE-APP通路耦合。

大脑暴露于TiO₂纳米颗粒触发TNFR1在小鼠体内的积累

为了评估我们与1C11神经元细胞系获得的数据的体内相关性，我们利用了来自先前概念证明研究的小鼠大脑材料，在该研究中，雌性C57Bl/6 J小鼠的大脑暴露于单剂量的TiO₂(P25)纳米颗粒(10µg)经脑室内(ICV)途径[55］．与未暴露或假手术的小鼠相比，注射TiO的小鼠₂-NPs在8周内表现出显著的、进行性的、严重的运动退化。根据TiO整个大脑的微胶质细胞激活，这些行为异常与神经炎症过程相关₂-NPs注射小鼠[55］．因此，我们试图评估TNFR1水平的升高，即。，一种启动TNFα毒性的细胞，将伴随TiO诱导的神经炎症状态₂nps。TNFR1在两个具有代表性的脑切片上的免疫组化分析显示，TNFR1的基础水平非常微弱，在未注射的小鼠大脑中基本检测不到(图2)。8a).在假手术小鼠中，TNFR1免疫染色在不同脑区均有升高，包括皮层、中隔、纹状体、海马体、丘脑和黑质，提示术后效果(图;8a).小鼠ICV-注入TiO₂在相同的大脑结构中，-NPs比假手术小鼠表现出更高的TNFR1水平。8a)，表明TiO₂-NPs促进TNFR1在体内的增强。如图所示，皮质的亚矢区。8b)，对大脑进行高倍检查，发现TiO诱导TNFR1升高₂-NPs主要发生在细胞中，其形状和位置(灰质核)是神经元的唤起。对于1C11细胞系，暴露于TiO的小鼠大脑中TNFR1的积累₂-NPs反映TACE向TNFR1的脱落活性不足。因为NPs刺激TNFα的产生[55]，在TiO的大脑中TNFR1的这种增强₂-NPs注射小鼠会使神经元对神经炎症高度脆弱。

我们的工作证实了TiO₂-和CB-NPs对神经元细胞产生不良影响，并通过与非病理性细胞朊蛋白PrP相互作用引发阿尔茨海默病的分子体征^C人民党腐败^C神经保护信号功能。TiO的相互作用₂-和CB-NPs与质膜PrP^C促进(i)通过NADPH氧化酶产生ROS和(ii) TACE α-分泌酶的内化，TACE α-分泌酶是一种细胞事件，不仅使神经元对TNFα炎症应激进行准备，而且还刺激APP的淀粉样加工，导致神经毒性a β肽的积累。最后，我们证明了脑室内注射TiO₂-NPs在C57Bl/6 J小鼠中引发TNFα受体在几个大脑区域的积累，这将使中枢神经系统更容易受到神经炎症的影响。

在抗洗涤剂微域中，即。质膜上的脂筏或脂囊，PrP^C在生理上表现为参与神经元和非神经元细胞内稳态的受体或辅受体[36，37］．PrP之外^C结合致病朊病毒PrP的能力^Sc朊病毒疾病[43]， Aβ淀粉样肽在阿尔茨海默病中的作用[33]，或α-突触核蛋白在帕金森病中的作用[56]，我们的数据表明，PrP^C也可高亲和力固定(10 ~ 30 μ g ml⁻¹)两种类型的纳米颗粒聚集体，TiO₂-和CB-NPs，尽管大小、化学成分和反应性质不同[47］．这为PrP识别分子谱提供了主要证据^C不局限于错误折叠蛋白质的聚集物。值得注意的是，个人TiO₂-和CB-NPs小于15 nm，但在生物介质中自发聚集/团聚成复杂的多分散结构，平均水动力学直径为100-600 nm，这取决于NPs的浓度(附加文件1和2:表S1和图S1) [17］．此外，Aβ多肽的体外生化研究表明，PrP^C结合直径在6 - 120nm之间的球形Aβ低聚物，可能对应于Aβ肽的六聚体或十二聚体，最小的低聚物和5-10 × 10的组装⁴Aβ分子最大，而Aβ单体不与PrP相互作用^C［57］．人们很容易推测，组装物体的大小和形状是PrP识别它们的关键参数^C．

这PrP^C区域与TiO相互作用₂-还是CB-NPs?对于Aβ肽，在全长PrP上鉴定出三个结合域^C，主要位于PrP的n端23-110柔性部分^C［57，58］．这PrP^C区域由八重基序组成，结合铜等二价离子(氨基酸51-90)[59，60也可能吸引纳米颗粒。为了支持这一假设，我们证明了TiO₂-和CB-NPs结合全长PrP^C(氨基酸23-230)在质膜上，但不与PrP的C1片段相互作用^C(氨基酸111-230)，即PrP的截断形式^C缺乏与全长PrP共存的八重母题^C在细胞表面。

与PrP一样^Sc或Aβ肽[9，33，44，61，62]，我们提供了TiO结合的证据₂-或CB-NPs在PrP上^C在神经元细胞的细胞表面参与和腐蚀PrP^C信令功能(附加文件5:图S4)。这些纳米粒子/ PrP^C互动显著招募PrP^C偶联到NADPH氧化酶/ROS的产生[38］．神经细胞急性暴露于TiO₂-或CB-NPs激发NADPH氧化酶的瞬时激活，随后产生ROS。在1C11细胞系中，纳米颗粒诱导的ROS产生不会促进氧化应激条件，这与暴露于TiO的动物大脑中的氧化损伤形成对比₂nps (28，30.］．这些差异可能首先反映了急性与神经元长期暴露在纳米颗粒下。在动物中，神经元与纳米颗粒的重复接触可能会发生，这反过来可能促进NADPH氧化酶的持续激活并产生氧化应激。另外，在接受纳米颗粒处理的动物大脑中观察到的氧化损伤可能反映了与TiO内化相关的纳米颗粒诱导的不良反应的晚期事件₂-及CB-NPs [63]以及它们靶向线粒体上的溶酶体隔室或NP作用[64，65]在严重的ROS产生的根源(有关综述，请参阅[66]及其中的参考文献，[17])。在任何情况下，明显的PrP^C我们在神经元细胞中发现的依赖纳米颗粒诱导的无毒ROS产生将通过改变PrP的状态来改变神经元表型^C-控制的氧化还原敏感靶点，如(i)应激激活的ERK1/2 MAP激酶[38]， (ii) CREB转录因子[67]，或(iii) 5 -羟色胺合成酶色氨酸羟化酶[68]，所有这些都涉及神经元功能的微调和可塑性。

最重要的是PrP的失调^C-PDK1-TACE α分泌酶通路[9，41，42，53] by TiO₂-和CB-NPs(附加文件5:图S4)。首先，纳米颗粒诱导的PDK1过度激活和随后的TACE内化取消了TACE介导的TNFR1脱落，从而促进TNFR1在神经元细胞质膜上的积累，增加了纳米颗粒暴露的神经元对外源性TNFα毒性的固有敏感性。这种由纳米颗粒引起的TNFR1水平的增加并不局限于培养的神经元，因为我们在体内监测了注射纳米TiO的小鼠大脑₂TNFR1在神经元群的质膜上的积累属于几个大脑区域，包括海马体，皮层，纹状体和黑质．与炎症应激条件的发生有关(有关综述，见[3.]和其中的参考文献)，这些纳米颗粒暴露的神经元对TNFα的脆弱性增强将导致神经退行性变，可能是运动能力丧失的原因[55以及其他大脑功能的改变，如记忆技能。在小鼠脑内接种TiO的体内实验₂纳米颗粒是一个概念证明，表明一旦TiO₂纳米颗粒已经到达中枢神经系统，它们会引起阿尔茨海默病的不良反应。需要进一步的体内实验来评估(i) CB-NPs是否也会促进TNFR1的升高并使神经元对小鼠大脑中的炎症应激敏感，以及(ii)更现实的TiO暴露₂或CB-NPs，特别是气道会在大脑中引发这种异常。二是TACE的内部化₂-和pb - nps转移了TACE α-切割神经保护活性，使APP远离。因此，APP参与了神经毒性Aβ40/42肽积累的根源β-淀粉样加工级联[691C11前体和血清素1C11^{−5 HT}神经元细胞暴露在纳米颗粒中。考虑到PrP^C与Aβ多肽相互作用继发Aβ毒性[33，44]并增加AD中Aβ的产生[9]，纳米颗粒通过刺激a β40/42多肽的产生，可能会导致a β产生/扩增的恶性循环，从而导致a β的发生特发性阿尔茨海默氏症。

这项体外和体内研究的主要发现是正常细胞朊病毒蛋白PrP^C作为两种TiO聚集物的结合受体₂和CB纳米颗粒进入神经元并转导np相关的毒性信号。尽管TiO₂-和CB-NPs被报道在肺上皮细胞中触发不同的毒性机制[47]， PrP失调^C这两种NPs的信号传递功能是神经元NP毒性的共同机制。PrP失真^C-耦合信号的TiO₂-和CB-NPs不仅能改变氧化还原平衡，还能使神经元对tnf α-炎症应激高度敏感，并促进神经毒性Aβ肽的过度产生。这种np诱导神经毒性的合理机制可以解释氧化应激、炎症环境和暴露于CB-NPs的小鼠大脑中富含β-sheet淀粉样蛋白的沉积[20.，70］．因此，我们的研究为人类如何暴露于某些纳米颗粒可能导致神经退行性疾病提供了新的见解，从而支持了一些工程和环境纳米颗粒在阿尔茨海默病症状发作中可能起因果作用的假设。最后，通过识别TiO₂-和CB-NPs破坏神经元中的信号级联并改变神经元稳态，本研究可能有助于现代毒理学了解中枢神经系统中纳米颗粒启动的不良结果通路。

纳米粒子，重组PrP^C和抗体

二氧化钛(TiO)₂， P25，西格玛-奥尔德里奇，圣昆汀法拉维尔，法国)和炭黑(CB, FW2, Evonik工业/德古萨，埃森，德国)由Sonja Boland博士(功能和适应生物学单位，Université巴黎Cité)提供。二氧化钛₂P25纯度99%，由球形颗粒组成，平均直径22 nm，混合结晶度85%锐钛矿和15%金红石。CB FW2的化学成分为97-99%的元素碳和1-2%的有机碳，平均直径为13 nm。冻干的全长重组小鼠PrP购自Alicon AG (Zürich，瑞士)，并重新折叠成PrP^C根据制造商的说明。小鼠Sha31 PrP单克隆抗体购自SPI-Bio公司(Montigny Le Bretonneux, France)。兔TNFR1多克隆抗体来自NeoBiotech (Nanterre, France)。兔TACE多克隆抗体来自Biovision (San Francisco, CA, USA)。兔APP多克隆抗体来自Novus Biologicals (Littleton, CO, USA)。兔BACE单克隆抗体来自Cell Signaling (Leiden, Netherlands)。兔PDK1多克隆抗体和Ser241磷酸化特异性PDK1抗体购自Cell Signaling (Leiden, Netherlands)，通过Western-blot检测PDK1水平和间接活性。为了标准化，使用了以下抗体:来自Proteintech (Rosemount, IL, USA)的小鼠单克隆α-管状蛋白抗体，来自Invitrogen (ThermoFisher Scientific, MA, USA)的小鼠单克隆β-肌动蛋白抗体，以及来自Merck (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的小鼠单克隆温库素抗体。单克隆β-淀粉样蛋白(D54D2) XP^®兔抗体来自Cell Signaling (Leiden, Netherlands)。

TiO的表征₂-和CB-NPs动态光散射(DLS)

二氧化钛团聚体的水动力直径₂-和CB-NPs用DLS测定。纳米颗粒原液悬浮液(2毫克ml⁻¹)用Bioruptor进行超声检测^®Plus超声系统(Diagenode公司，Denville, NJ, USA) (20khz, 320w)，每次30秒。超声处理后，将NPs按如下方式稀释:在22°C的PBS中以5、20、40和80µg ml稀释⁻¹在DMEM/F12 37°C中，5、10、25和50µg ml⁻¹(后一种浓度对应于0.1至10 μ g cm之间的NPs暴露剂量⁻²在细胞实验中)。NP悬浮液在2000克的浓度下离心2秒以去除大的团聚体。上清液进行DLS分析。值得注意的是，5µg ml⁻¹PBS和DMEM/F12中NPs的浓度太低，不能用DLS估计水动力直径。对于其他NPs浓度，使用Vasco Kin™粒度分析仪(Cordouan Technology, Pessac, France)结合NanoKin软件(V2.3.3.0)测量水动力直径。选择以下Vasco Kin粒度分析仪参数:温度(22°C或37°C)，激光功率(70 - 80%之间)，采集模式(连续)和分析模式(累积量)。散射角为170°。每次测量一式三份(附加文件1和2:表S1和图S1)。

PrP与PrP的体外结合实验^C和纳米粒子

在PBS中稀释的超声纳米颗粒浓度增加(高达80µg ml⁻¹)与重组PrP孵育^C(2 μ M)在PBS (100 μ l)中，在4°C下轻度搅拌2小时。然后将溶液在13523 g下离心30分钟，在4°C下制成颗粒状纳米颗粒并结合PrP^C．荧光与游离PrP相对应^C在上清液(λ_exc= 280 nm，狭缝宽度= 5 nm;λ_新兴市场= 340 nm，狭缝宽度= 10 nm)使用Cary Eclipse荧光计(Varian Inc.， Agilent Technology)。免费的PrP^C也通过Western-blotting进行量化。

细胞培养，1C11细胞的神经元分化和纳米颗粒暴露

1C11细胞在Dulbecco 's Modified Eagle培养基(DMEM高葡萄糖，GlutaMAX™补充剂，Gibco)中培养，并添加10%胎牛血清(FCS, Biochrom GmBH, Berlin, Germany)。在添加1 mM二丁基环AMP (dbcAMP, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)和0.05%环己基羧酸(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)后，几乎100%的1C11细胞在4天内获得了完整的血清素能表型(1C11^{−5 HT}) [35］．在细胞暴露于纳米颗粒之前，纳米颗粒原液(2 mg ml⁻¹)用Bioruptor进行超声检测^®Plus超声系统(Diagenode Inc.， Denville, NJ, USA) (20 kHz, 320 W)在3个周期中进行，每次30秒，然后在无血清DMEM/F-12中稀释到适当浓度，以2000 g离心2秒，并立即使用。将制备好的纳米颗粒应用于生长到90-95%合流的细胞上，使用剂量公制µg cm⁻²，是指分布在细胞培养板表面的纳米颗粒浓度。与其他细胞范式一样[17，31]，并确定NPs促进细胞内稳态丧失的分子途径，1C11细胞及其血清素能神经元子代急性暴露于几种浓度的TiO₂-或CB-NPs 0.1 - 10µg cm⁻²．

透射电子显微镜

细胞在24孔板中Aclar膜(EMS, Hatfield, PA, USA)上培养至约90%，在0.1 M磷酸盐缓冲液(PB)中冲洗两次。用1%磷酸盐缓冲的戊二醛(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)在室温(RT)下固定15分钟，并用PB漂洗两次。在室温下用0.5%四氧化锇在PB中固定30分钟后，细胞制剂分别用增加浓度的乙醇(50,70,95,2 *100%)浸泡8分钟，然后用环氧丙烷浸泡2次8分钟。在RT条件下进行1 / 2 Araldite/ 1 / 2环氧丙烷处理，然后在RT条件下进行2 h Araldite处理。在60℃下聚合48 h后，在超微切片机(Leica, Wetzlar, Germany)中切割70 μm超细切片。所用造影剂为柠檬酸铅。切片使用日立H7500透射电子显微镜(日本东京)，配备AMT滨松数字相机(滨松光子学，滨松市，日本)。

细胞提取物制备及western blot分析

细胞在PBS/Ca/Mg中洗涤，并在裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100，蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒[Roche, Basel, Switzerland])中4°C孵育30分钟。裂解液离心(14000 × g, 30分钟)后，用双辛酸法(Pierce, Rockford, IL, USA)测定上清液中蛋白质的浓度。

对于PNGase测定，15µg蛋白质提取物与500 U肽n -糖苷酶F (New England Biolabs, Ipswitch, MA, USA)在37℃下孵育1小时。用SDS/10% PAGE分离10微克蛋白质，并转移到硝化纤维膜(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)。用3%的脱脂干牛奶在0.1%吐温20的PBS中堵塞膜，RT下1小时，然后在4°C下用0.02µg ml孵育过夜⁻¹Sha31一抗prp抗体。结合抗体通过增强化学发光检测显示，使用小鼠二抗偶联HRP (GE Healthcare, UK)。

PrP^C沉默

我们利用1C11前体细胞稳定地向PrP表达shRNA^C，其中PrP^C表达被抑制95%以上(称为PrP^零-1C11单元格)[50，53］．1C11和1C11^{−5 HT}用针对PrP的siRNA瞬时转染神经元细胞(感觉序列5 ' -CAGUACAGCAACCAGAACAdTdT-3 ') [40]使用脂质体2000试剂，按照制造商的说明(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。

流式细胞术

1C11或PrP^零-1C11细胞胰化，用冷PBS冲洗，并在冰上暴露于纳米颗粒15分钟，用0.1%叠氮化钠防止纳米颗粒内化。在1200 g(4°C)离心5 min后，细胞在3.6%多聚甲醛-PBS溶液中固定15 min，然后用冷PBS洗涤两次。使用Amnis ImageStream对细胞进行分析^x平台(Amnis, Proteigene, Saint Marcel, France)和Inspire™系统软件(Amnis)。相机放大倍数为40倍。785 nm激发激光功率为0.03 mW。在正常景深下获取图像，提供4 μm聚焦深度的细胞横截面图像。通过明场图像定义代表整个细胞的掩膜，通过将整个细胞掩膜腐蚀6个像素(相当于3 μm，因为1个像素的大小为0.5 μm)来定义内部掩膜，以选择附着在细胞表面的纳米颗粒发出的信号。结果采用IDEAS软件(Amnis)进行分析。计算每个样品至少500个细胞的平均侧散射(SSC)强度和细胞面积。

荧光法检测ROS

ROS在1C11前体细胞中的产生，1C11^{−5 HT}神经元细胞和对应的PrP沉默^C用细胞内荧光试剂CM-H检测表达₂DCFDA根据制造商的说明(分子探针，尤金，OR，美国)。细胞暴露于纳米粒子后，荧光被记录(λ_exc= 507 nm，狭缝宽度= 10 nm;λ_新兴市场= 528 nm，狭缝宽度= 10 nm)使用Cary Eclipse荧光计(Varian Inc.， Agilent Technology)。

酶抑制

用罗布麻苷抑制NADPH氧化酶活性(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)。通过BX912切断PDK1活性(Axon Medchem BV, Groningen, Netherlands)。

细胞内还原性谷胱甘肽的荧光测定

使用谷胱甘肽敏感探针Celltracker Green CMFDA(分子探针，Eugene, OR, USA)测定谷胱甘肽水平。1C11和1C11^{−5 HT}细胞暴露于TiO₂或CB纳米颗粒(1µg cm⁻²然后用Hanks’平衡盐溶液(HBSS)缓冲液(Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA)洗涤细胞两次，并在HBSS中在1µM含氟试剂的37°C下进一步孵育30分钟。去除HBSS，细胞在DMEM、10% FCS中37°C重组30分钟，然后裂解。在λ处记录细胞裂解物的荧光强度_新兴市场λ激发后= 517 nm(狭缝宽度= 5 nm)_exc= 492 nm(狭缝宽度= 5 nm)，使用Cary Eclipse荧光计(Varian Inc.， Agilent Technology)。细胞内还原谷胱甘肽的参考水平(100%)是使用未暴露于纳米颗粒的细胞获得的。

免疫荧光实验

PrP的免疫荧光标记^C采用标准方案进行TNFR1、TACE和Aβ检测。简单地说，用于细胞表面检测PrP^C、TNFR1和TACE，培养于玻璃片上的细胞用冷PBS冲洗，用3.6%多聚甲醛固定。细胞在室温下与一抗(0.5µg ml⁻¹)注入阻断缓冲液(含2%胎牛血清的PBS)，然后用Alexa-Fluor 488或594偶联二次免疫球蛋白(1µg ml⁻¹；分子探针，尤金，OR，美国)。为了在细胞内检测TACE和Aβ，在TACE和Aβ免疫染色前，用0.05%皂角苷(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)在PBS中室温渗透3.6%甲醛固定的细胞15分钟。使用Fluoromount G (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)将细胞制剂安装在盖玻片下，并使用Leica DMI6000 B显微镜(Wetzlar, Germany)进行宽视野间接免疫荧光分析。对于所有图像，通过使用Autoquant X程序(Meyer Instruments, Houston, TX, USA)中的自适应盲反褶积，以0.3 μ m间隔记录的16组连续光学部分的数字反褶积来减少焦外雾霾。然后将每个焦平面上的所有像素值沿z轴求和，得到最终图像。用AQUA软件对反卷积图像进行图像分析[71］．

RNA分离和实时定量RT-PCR分析

根据制造商说明书(Life Technologies)，使用Trizol试剂分离总RNA。第一链cDNA合成使用Prime Script RT Master Mix kit (Takara Bio)进行。在ABI Prism 7900HT设备(Applied Biosystems)中使用SYBR Green kit (ABgene)在60°C进行实时定量PCR。使用的引物有:TNFR1转发5′-AGGGCACCTTTACGGCTTCC-3′和反向5′- ggttctccttacagccacacaca -3′，TACE转发5′- cggagagagcaggctctg -3′和反向5′-CCTTTGTTCGAACCCACATC-3′，BACE转发5′- accaccaaccttcgcttgcc -3′和反向5′- aaggggtcgtgccccccccccttgc -3′以及作为内部控制Rplp0转发5′- tacaccttcccacggcctg -3′和反向5′- tctgttcctccgactcttc -3′。

细胞活力测定

生存力~ 1 × 10⁵1C11或1C11^{−5 HT}细胞暴露于或不暴露于纳米颗粒1小时，然后暴露于重组小鼠TNFα (Biosource International, Camarillo, CA, USA)，通过四氮唑盐WST-1 (Roche, Hoffmann-La-Roche Ltd, CH4070, Basel, Switzerland)的裂解来评估。使用cleaved caspase-3 (Asp175)抗体(cell Signaling, Leiden, Netherlands)， Western-blotting方法评估细胞暴露于纳米颗粒和/或TNFα时caspase-3的激活情况。

Aβ40/42的ELISA测定

酶联免疫吸附试验(ELISA)使用小鼠Aβ40和Aβ42酶联免疫吸附试验试剂盒(Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA)，按照制造商说明进行测量。Aβ42试剂盒检测范围为3.12 ~ 200 pg ml⁻¹Aβ40试剂盒在7.81 - 500 pg ml之间⁻¹．5 × 10⁷1C11或1C11^{−5 HT}细胞在暴露于或不暴露于1µg cm的PBS中洗涤⁻²TiO的₂-或CB-NPs在无血清DMEM/F-12培养基中培养24小时。孵育后，细胞在PBS中洗涤并溶解。然后对裂解物进行超声(Diagenode Inc.， Denville, NJ, USA) 10个周期，每次30秒，然后离心(16000 × g, 30分钟)。ELISA法测定上清中Aβ40和Aβ42的含量。

伦理语句

所有动物实验均根据法国和欧洲关于实验动物护理和保护的法规(2013年2月1日法国法令2013 - 118和2010年9月22日指令2010/63/EU)进行。实验方案已由动物伦理委员会(国家动物实验伦理委员会(ANSES/ENVA/UPEC))和国家教育、高等教育和研究部评估和批准(11-0042)。体内实验是在ANSES-Lyon实验室的动物设施中进行的，该实验室拥有相关的动物工作批准(C 69 387 0801)，由在动物实验单元(许可编号AB: 69 387 531)工作的持牌人员进行。每组动物被安置在一个温度控制的房间里的强化笼子里，光照/黑暗周期为12小时，自由取水和食物。

活体大脑暴露于TiO₂纳米粒子

每组15只雌性C57Bl/6J小鼠(Charles River, L’arbresle, France)， 6周龄(平均体重19 g)，深度麻醉(100 μl Ketamin, 50 μl Xylazin, 400 μl水稀释溶液150 μl腹腔注射)，然后采用独特的急性给药TiO₂NPs (P25)直接在大脑内使用立体定向设备。这种暴露方式允许直接评估TiO₂纳米粒子神经毒性与控制纳米粒子的递送量的好处。脑室被选为NPs传递的部位，因为它带来的优势是在短时间内缓解NPs向整个大脑的传播。一位TiO₂-NP溶液(5 μg μl⁻¹)是根据nanogentox联合行动制定的标准化分散方案，由原液混悬液配制而成(www.nanogenotox.eu)，以协调和规范纳米颗粒的分散，用于体外和体内毒性测试。简单地说，NPs悬浮在无菌过滤的0.05% w/v bsa水中，浓度为2.56 mg ml⁻¹使用4°C的高能探头超声波。用DLS测量了悬浮液的水动力直径，平均直径为350 nm。使用10 μ l Hamilton注射器，2 μ l新超声TiO₂在电动微注射泵的控制下，将纳米颗粒悬浮体立体定向注入侧脑室右侧(立体定向坐标:前后:−0,22中侧:+ 1背腹侧:−2,25)，持续10分钟。假性实验将相同体积(2 μl)的溶剂(无菌过滤0.05% w/v BSA-water)注入对照组C57Bl/6J小鼠右侧侧脑室。在NPs注射时，没有一只小鼠表现出明显的神经损伤。在首次接触后的1、2、3、4和8周，用戊巴比妥致命注射对3只小鼠实施安乐死。放血后取脑，在10%缓冲福尔马林溶液中固定，经经典石蜡包埋后进行组织化学分析。在暴露后8周，观察到的最大神经影响是运动能力的改变和神经炎症。在本研究中，我们选择了暴露后8周牺牲的小鼠脑石蜡包埋切片。

TNFR1免疫组织化学

评估TiO在体内的影响₂在5µm厚的福尔马林固定的脑切片上进行免疫组织化学分析，使用特定的兔多克隆TNFα受体1抗体(abcam, ab19139)按照常规程序制备的石蜡包埋组织。简单地说，根据制造商的说明，在自动免疫染色仪(Ventana Discovery XT, Roche, Meylan, France)上使用Omnimap DAB Kit进行免疫组化(包括脱亲和化、抗原检索、内源性过氧化物酶活性的猝灭)。切片用兔TNFR1抗体(按1:1000稀释)孵育。在切片上应用抗兔hrp。用DAB显色底物可见，染色呈典型的棕色。切片用吉尔苏木精反染色。最后，用全景扫描II (3D Histech, Budapest, Hungary)扫描20X的大脑切片。

统计分析

使用NIH ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij/)．对于两组实验，未配对样本采用Student 's t检验。对于3组或3组以上的实验，独立样本分别采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验和Dunnett's或Tukey's post hoc检验比较对照均值和对照均值。所有图上的误差条代表s.e.m.a假定值< 0.05%被认为是显著的(样本量和p数值在图形图例中表示)。

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本文及其补充信息文件中。

1 c11:

神经外胚层干细胞

1 c11^5−HT：

血清素能神经元细胞

广告:

阿尔茨海默病

应用:

淀粉样前体蛋白

一个β:

β淀粉样肽

BACE1:

β -位点APP裂解酶1

CB:

炭黑

DLS:

动态光散射

NADPH氧化酶:

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

NP (s):

纳米颗粒聚集

基因:

3-磷酸肌醇依赖激酶

PNGase:

Peptide-N-glycosidase

PrP^C：

细胞朊病毒蛋白

ROS:

活性氧

别说话:

肿瘤坏死因子α转化酶(ADAM17)

TiO₂：

二氧化钛

TNFR:

肿瘤坏死因子-α受体

肿瘤坏死因子α:

肿瘤坏死因子-α

成像实验、mRNA/蛋白研究和DLS分析分别在生物医学技术设施INSERM US36/CNRS UMS2009/Université Paris Cité的SCM、Cyto2BM和AMS核心设施进行。我们感谢Jacques Monod研究所的ImagoSeine核心设施，法国生物成像(ANR-10-INBS-04)的成员，以及区域Île-de-France (E539)的支持。作者感谢“解剖病理研究平台，Université克劳德·伯纳德·里昂1号，中心Léon Bérard，里昂研究中心cancérologie (CRCL)”的成员，感谢他们出色的组织学技术援助。

这项工作得到了INSERM的支持。ZAA是法国国家研究机构(欧洲神经退行性疾病联合项目和国家研究机构，«PrP^C&PDK1»，n°ANR-14-JPCD-0003-01)。

作者及隶属关系

1. INSERM, UMR-S 1124,75006，法国巴黎

   Luiz W. Ribeiro, Mathéa Pietri, Hector Ardila-Osorio, Anne Baudry, François Boudet-Devaud, Chloé Bizingre, Zaira E. Arellano-Anaya, Odile Kellermann & Benoit Schneider

2. UMR-S 1124, Université巴黎Cité， 75006，法国巴黎

   Luiz W. Ribeiro, Mathéa Pietri, Hector Ardila-Osorio, Anne Baudry, François Boudet-Devaud, Chloé Bizingre, Zaira E. Arellano-Anaya, Odile Kellermann & Benoit Schneider

3. 神经细胞研究所Intégratives, CNRS UPR 3212, Université斯特拉斯堡，67084，斯特拉斯堡，法国

   Anne-Marie Haeberlé & Yannick Bailly

4. 解剖病理研究平台，INSERM 1052, CNRS 5286，中心Léon Bérard，研究中心Cancérologie里昂(CRCL)， Université克劳德·伯纳德·里昂1,Université里昂，69373，里昂，法国里昂

   尼古拉斯Gadot

5. CNRS UMR 8251, Unité de生物功能和适应，Université巴黎Cité， 75013，巴黎，法国

   Sonja Boland & Stéphanie Devineau

6. 里昂ANSES实验室，法国食品、环境和职业健康与安全机构(ANSES)， Université克劳德·伯纳德·里昂1,69364，法国里昂

   安娜Bencsik

贡献

构思设计实验:MP, AB, AB, YB, BS。进行实验:LWR、MP、HAO、FBD、CB、ZAA、AMH、NG、SD。分析数据:LWR、MP、AB、SB、SD、YB、AB、BS。写稿子:好，AB, BS。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Benoit施耐德．

伦理批准并同意参与

所有动物实验均根据法国和欧洲关于实验动物护理和保护的法规(2013年2月1日法国法令2013 - 118和2010年9月22日指令2010/63/EU)进行。实验方案已由动物伦理委员会(国家动物实验伦理委员会(ANSES/ENVA/UPEC))和国家教育、高等教育和研究部评估和批准(11-0042)。体内实验是在ANSES-Lyon实验室的动物设施中进行的，该实验室拥有相关的动物工作批准(C 69 387 0801)，由在动物实验单元(许可编号AB: 69 387 531)工作的持牌人员进行。每组动物被安置在一个温度控制的房间里的强化笼子里，光照/黑暗周期为12小时，自由取水和食物。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

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