矿物成分对矿物粉尘的细胞毒性和促炎作用的重要性

背景

可吸入矿物颗粒在职业环境和环境空气中具有潜在的健康危害。以往的研究表明，矿物颗粒在体外和体内均可诱导细胞毒性和炎症反应，且不同成分样品的效力不同。然而，造成这些差异的原因在很大程度上是未知的，矿物成分对矿物粉尘生物效应的影响仍有待确定。

方法

我们评估了10种不同成分的矿物颗粒样品在人支气管上皮细胞(HBEC3-KT)和thp -1来源的巨噬细胞中的细胞毒性和促炎作用，以及它们在红细胞中的膜溶解特性。此外，这些结果是根据最近发表的关于石粒暴露影响的实验结果编制的，并使用线性回归模型进行分析，以阐明哪些矿物成分对矿物粉尘的毒性贡献最大。

结果

虽然所有矿物颗粒样品对HBEC3-KT细胞的细胞毒性都高于THP-1巨噬细胞，但在两种细胞模型中，黑云母和石英的细胞毒性都最强。在HBEC3-KT细胞中，黑云母和石英似乎也是促炎细胞因子最有效的诱导物，而石英、钙长石、钠长石和黑云母样本在THP-1巨噬细胞中最有效。除石英以外的所有颗粒样品都诱导了低水平的膜分解。回归分析显示，颗粒生物活性与石英、白云母、斜长石、黑云母、钙长石、钠长石、微斜长石、方解石、绿泥石、正辉石、放线石和帘石含量之间存在相关性，这取决于细胞模型和终点。然而，在两种细胞模型中，白云母是唯一与细胞毒性增加和细胞因子释放一致相关的矿物质。

结论

本研究提供了进一步的证据，矿物颗粒可诱导人体气道细胞的细胞毒性和炎症，不同矿物成分的颗粒样品的效力不同。结果表明，石英虽然是最有效的样本之一，但并不能完全预测矿物粉尘的毒性，这突出了其他颗粒成分的重要性。此外，结果表明层状硅酸盐、白云母和黑云母可能比研究中评估的其他矿物更有效，这表明这组片状矿物可能值得进一步关注。

矿物是一组无机固体化合物，可能以纯形式存在，也可能以岩石中的集合体形式存在[1］．最大的一类矿物是硅酸盐，它以长石、石英、辉石、角闪石、云母和粘土矿物的形式构成了地壳的大部分[1］．许多矿物已被商业开发，并广泛应用于建筑、陶瓷、油漆、填料、塑料、电子和磨料[2］．因此，在开采、加工和处理岩石和矿物的工业和职业中，吸入矿物颗粒是一种潜在的健康危害[3.，4，5，6］．此外，地壳物质是可吸入环境颗粒物的常见成分，是一般人群的接触来源[7，8，9，10］．在市区，交通会因路面磨损而产生粗大的富含矿物质的颗粒，并使累积的道路尘埃重新悬浮。[11，12］．这在北欧国家尤其是个问题，在那里，由于冬季和春季普遍使用钉钉轮胎，路面磨损颗粒的贡献可能很高[11，13，14，15］．然而，虽然接触石英和石棉颗粒是一种典型的健康危害，与进行性纤维化肺病和癌症有关[16，17，18]，其他矿物质的潜在毒性在职业和环境环境中受到的关注要少得多。

肺部炎症的诱导被认为是吸入颗粒对健康产生不良影响的一个关键事件，可能涉及颗粒诱导的氧化应激、与细胞膜的相互作用、细胞表面受体的激活以及与细胞内分子靶标的直接相互作用[19］．我们小组先前的研究表明，不同矿物学和金属成分的石粒样品在体外和体内诱导炎症细胞因子的能力不同[20.，21，22，23，24，25，26，27］．然而，这些差异的原因仍有待澄清，样品的促炎效力不能归因于颗粒表面积、颗粒诱导的活性氧(ROS)或可溶性金属成分的差异[21，22，26］．虽然早期的研究没有确定哪些颗粒特征与促炎特性有关，但结果似乎表明，含有高含量长石矿物的颗粒样品的促炎活性最低[20.，23，24，25，27］．相反，我们最近的研究表明，一些富含长石的石头颗粒样品可能会诱导细胞毒性和急性促炎反应，其程度与石英相似或更大[21］．

在本研究中，进一步研究了矿物成分对矿物粉尘炎症潜能的作用。在人支气管上皮细胞和巨噬细胞样细胞中评估了暴露于10种矿物颗粒样品的促炎作用和细胞毒性作用。此外，还评估了颗粒诱导人红细胞裂解的能力，以探索膜溶解特性。最后，将本研究的数据与Grytting等人的结果进行汇编。[21]，其中评估了对几种具有不同矿物成分的石质颗粒样品的反应，并使用线性回归模型进行分析，以评估矿物成分与不同细胞端点之间的潜在关联。该结果进一步证明，矿物颗粒可诱导人体呼吸道细胞的细胞毒性和炎症。此外，还强调了某些矿物成分的可能参与。

颗粒样品特征

本研究选择了10种不同的矿物样品，以包括最常见的硅酸盐成岩类别，并代表Grytting等人研究的颗粒样品的主要矿物成分。[21(图。1，附加文件1:表S1)。矿物样品按其主要矿物成分分类1)．包括4个构造硅酸盐样品;一份石英样品和三份长石矿物样品，分别称为n长石、Ca长石和k长石，分别代表钠长石、Ca长石和k端元、钠长石、钙长石和微斜长石(附加文件2:图S1)。研究中还包括四种ino硅酸盐样品;角闪石和放线石属于硅晶岩中的角闪石族，辉石和正辉石属于辉石族。黑云母是一种云母矿物，是一种代表性的层状硅酸盐，是一组以片状形态为特征的矿物。研究还包括一种硅帘石样品。

矿物的组成

矿物样品的x射线衍射(XRD)分析表明，矿物成分的纯度不同(图2)。1，附加文件1:表S1)。石英、黑云母和帘石为纯矿物样品，而放线石样品中还含有少量方解石和滑石。在长石样本中，钙长石样本是最纯的，由99%的钙长石组成，而钠长石和钾长石样本分别由69%的钠长石和71%的微斜长石组成，此外还有少量的石英和高达26%的其他长石矿物。角闪石样品中含有少量石英、钠长石、黑云母、方解石和绿泥石，而菱辉石样品中也含有10%石英、14%角闪石和少量方解石。正辉石样品中含有15%的钙长石，以及少量的石英、方解石和绿泥石。

以下统计分析的石英岩、斜长岩、菱形斑岩、英安岩、石英闪长岩、角岩和α-石英样品的矿物组成已在前面描述[21]，但也包含在本研究的在线补充中(附加文件1:表S1)。所有的石粒样品都是由不同矿物组合而成的碎石材料产生的，而α-石英样品(Min-U-Sil 5)是一种高纯度的商业石英样品[21］．石英和长石矿物是最常见的矿物成分，而少量的黑云母、绿帘石、角闪石、菱辉石、方解石、绿泥石和白云母在一个或多个样品中被检测到。长石有微斜长石，也有斜长石。术语斜长石是用来描述钠长石和钙长石的固溶体。需要注意的是，菱形斑岩样品中的钾长石是微斜长石还是正长石存在一定的不确定性，矿物的高度相似性使其难以区分。为了本研究的统计分析目的，与其他颗粒样品一样，假设k长石的含量由微斜长石组成(附加文件1:表S1)。

元素组成

矿物颗粒样品的元素组成由x射线荧光(XRF)分析确定，见表2．元素组成与样品的矿物学相一致(附加文件1:表S2)，石英样品几乎全部由硅组成，而铝、钙、钠和钾是长石样品的主要成分。黑云母、绿帘石、放线石、绿辉石、角闪石和正辉石样品中也含有大量的铁和镁。在一个或多个颗粒样品中检测到少量的钒、铬、钡、钴、镍、铅、锌和锆。与测试矿物为硅酸盐一致，硅是所有样品中的主要成分。

内毒素污染

黏附内毒素已被证明是环境颗粒炎症效应的重要因素[28，29]并且可能会混淆矿物颗粒暴露的结果。因此，采用鲎试剂(LAL)法测定细菌内毒素含量。任何矿物颗粒样品的内毒素浓度均不超过1 EU/mg(表2)3.)．重要的是，在内毒素浓度和后续章节中给出的终点之间没有发现统计学意义上的关联，这表明样品的内毒素含量的影响可以忽略不计(数据未显示)。

粒径分布

颗粒样品的尺寸分布由coulter counter分析确定，如图所示。2．对于除黑云母外的所有颗粒样品，超过95%的颗粒直径小于10µm。在黑云母样品中检测到的大颗粒数量最高，约55%的颗粒超过5µm, 15%的颗粒超过10µm。相反，角闪石样品的小颗粒含量最高，超过75%的样品小于2.5µm, 31%的样品小于1µm。正氧苯样品中还含有大量的小颗粒，其中约55%的颗粒小于2.5微米，14%的颗粒小于1微米。石英、钠长石、钾长石、钙长石、绿帘石、放线石和辉长石样品粒径分布中等，绿帘石和辉长石样品粒径略小。

细胞生存能力

颗粒诱导的细胞毒性在不同样品和细胞模型之间差异很大(图2)。3.)．在HBEC3-KT细胞中，除帘石外的所有颗粒样品都将细胞活力降低到与对照组显著不同的水平(图2)。3.A).黑云母样品的细胞毒性最强，在100µg/mL时，细胞活力显著降低，在400µg/mL时，细胞活力总降低约40%(图4)。3.A).其余颗粒样品对细胞活力造成了类似的降低，但在不同浓度下达到统计学显著性。在比较基于曲线下面积(AUC)值的颗粒样品时，暴露于黑云母样品的细胞存活率明显低于暴露于钠长石、钙长石、绿石和正氧石的细胞(图2)。3.C)。

与HBEC3-KT细胞相比，颗粒暴露对THP-1巨噬细胞存活率的影响明显低于HBEC3-KT细胞。3.B).只有黑云母和石英样品使THP-1巨噬细胞的细胞活力显著降低，在300-400µg/mL时达到统计学意义。在最高浓度为400µg/mL时，黑云母和石英样品的细胞存活率均降低了约30%(图2)。3.B).在比较AUC值时，黑云母对细胞活力的降低明显大于除石英外的所有其他颗粒样品。石英的细胞毒性明显高于钠长石、钾长石、钙长石、绿帘石和放线石样品(图2)。3.D).长石样品似乎增加了活力，可能是由于增加了细胞的代谢活性(图。3.B)，这可能解释了这些颗粒样品与其他低效力样品之间的显著差异(图。3.D)。

促炎细胞因子的释放

我们之前的工作表明，不同的石头颗粒样本可能以浓度依赖的方式诱导促炎细胞因子的分泌[21］．因此，我们接下来评估了不同的矿物样品，代表之前测试的石粒样品的单个矿物成分[21]，可以以类似的方式诱导促炎反应。

所有颗粒样品均诱导HBEC3-KT细胞中CXCL8、IL-1β和IL-1α的浓度依赖性升高(图2)。4)．黑云母样本在最低浓度下引起了所有细胞因子的显著增加，从100µg/mL开始。钠长石、钾长石、钙长石、角闪石、放线石和辉长石诱导了类似的反应，所有细胞因子在200µg/mL时均达到统计学意义。绿石和正氧苯是最弱的颗粒样品，在300µg/mL时诱导CXCL8和IL-1β分泌显著增加，在200µg/mL时诱导IL-1α分泌显著增加。与其他矿物质相比，石英诱导所有细胞因子的最高水平，CXCL8和IL-1β在200µg/mL时具有统计学意义，IL-1α在100µg/mL时具有统计学意义。

由于在最高浓度下细胞毒性的差异(图。3.一个和C)，选择0-200µg/mL的浓度范围进行样品间AUC值的比较，以避免低估大多数细胞毒性颗粒样品的促炎反应。然而，应该注意的是，黑云母在200µg/mL时仍能诱导细胞活力显著降低(图2)。3.A)。当比较该浓度范围内的AUC值时，尽管所有细胞因子的效力顺序相似，但样品之间的大多数明显差异并不显著(图2)。4D-F)。虽然黑云母和石英样品诱导的反应略有升高，但CXCL8和IL-1β颗粒诱导的反应之间没有统计学上的显著差异(图2)。4D和E)．对于IL-1α，黑云母诱导的反应明显高于石英以外的所有其他颗粒样品，而石英诱导的反应明显高于正辉石(图2)。4F).值得注意的是，如果考虑到整个浓度范围，石英和其他颗粒样品之间的差异会更大。石英诱导的所有细胞因子的最大水平明显高于其他矿物样品(图。4a - c)。然而，这种影响主要与300和400µg/mL的最高浓度有关，这在计算AUC值时不包括在内。

如图所示。2，部分矿物颗粒样品的粒度分布存在明显差异。为了评估这是否可能影响结果，颗粒大小与颗粒诱导的细胞因子释放之间的相关性，表示为平均AUC值(图2)。4)，使用Pearson相关进行评估。颗粒大小与IL-1β释放量呈显著正相关(r= 0.6483,p= 0.0426)和IL-1α (r= 0.8393,p= 0.0024)，表明含有最大颗粒的矿物颗粒样品是这些细胞因子最有效的诱导剂。然而，CXCL8的粒径与释放量之间并没有发现明显的相关性(r= 0.5317,p= 0.1137)(附加文件3:图S2a)。

所有颗粒样品诱导THP-1巨噬细胞CXCL8、IL-1β和TNFα浓度依赖性升高(图。5)．然而，与HBEC3-KT细胞相比，颗粒样本表现出不同的效力顺序。钙长石和石英样品诱导的CXCL8反应最高，其次是钠长石和黑云母，与100µg/mL的对照组相比有显著差异。钾长石、绿辉石、角闪石和辉石样品诱导了相似水平的CXCL8，在200µg/mL时达到统计显著性，而正辉石是最弱的颗粒样品，在300µg/mL之前没有达到统计显著性。就最高浓度下的响应幅度而言，石英样品诱导了最强的IL-1β响应，但在200µg/mL之前的影响不显著。相反，钠长石、钙长石和黑云母样品诱导了类似的IL-1β反应，在100µg/mL时与对照显著不同，但在最高浓度时没有达到石英那样高的水平。相比之下，钾长石、角闪石和辉石样品诱导的IL-1β水平较低，在200µg/mL时达到统计显著性，而绿石、放线石和正辉石是最强的样品，在300µg/mL时诱导显著性水平。钙长石和石英是最有效的TNFα分泌样品，并诱导相似的水平，分别在100-200µg/mL时具有统计学意义(图2)。5C).钠长石和黑云母是第二强的样品，与对照相比，在200µg/mL时诱导了显著水平的TNFα，而k长石、绿玉和角辉石样品诱导了相似水平的TNFα，在200 - 300µg/mL时显著(图2)。5C).放线石、绿辉石和正辉石是TNFα最弱的诱导剂(图。5C)。

在比较矿物颗粒诱导反应的AUC值时，发现了类似的效力顺序，尽管并非所有的比较都达到了统计显著性(图2)。5D-F)。根据细胞毒性试验的结果(图;3.B和D)，计算AUC值时采用0-200µg/mL，以避免低估大多数细胞毒样品的作用。在此浓度范围内，石英和钙长石样品是CXCL8最有效的诱导物，诱导的CXCL8浓度相似(图2)。5D).石英诱导的CXCL8水平显著高于帘石、放线石和正辉石，而钙长石诱导的CXCL8水平显著高于钾长石、帘石、放线石和正辉石(图)。5D).黑云母样品诱导的响应也明显大于放线石和正辉石(图。5D).钠长石样品诱导了类似于黑云母的中间反应，与其他颗粒样品相比没有显著差异(图。5D).对于IL-1β，石英是最有效的颗粒样品，其诱导的响应明显高于钾长石、绿帘石、角闪石、放线石、辉绿石和正辉石(图2)。5E).钙长石和黑云母样品诱导了类似的反应，显著高于钾长石和绿帘石(图。5E)。对于CXCL8, na -长石诱导的中间响应与其他颗粒样品相比没有达到统计学意义(图。5E)。钙长石样品诱导的TNFα水平也明显高于钾长石、绿帘石、放线石和正辉石(图2)。5F)。

与HBEC3-KT细胞相比，THP-1巨噬细胞的颗粒大小与颗粒诱导的细胞因子释放之间没有明显的相关性(附加文件3:图S2b)。

溶血

为了评估膜溶解特性的差异是否可以解释矿物颗粒样品之间效力的差异，在溶血试验中评估了它们溶解人类红细胞的能力。在本实验中，颗粒诱导的溶血作为与细胞膜相互作用的模型系统，并已被证明可以预测二氧化硅颗粒的毒性[30.，31］．石英引起的溶血程度最大，在最高浓度时达到约15%，与100µg/mL时的对照有显著差异(图2)。6A).然而，除了钾长石引起的少量增加外，其余颗粒样品均未检测到溶血明显增加。出乎意料的是，与对照组相比，几个样品造成了微小但显著的吸光度降低。与对照相比，矿物颗粒似乎不太可能降低基础溶血，这可能表明颗粒样品的成分干扰了测定。因此，目前的方法可能略微低估了矿物样品的溶血作用。在比较AUC值时，石英引起的溶血水平明显高于所有其他颗粒样品(图2)。6B)。

矿物组成与生物活性的关系

为了评估不同颗粒成分在观察到的细胞毒性和促炎作用中的作用，前几节中提出的结果与最近发表的实验结果相结合，在该实验中，在与本研究相同的细胞模型中评估了六个不同矿质成分的石头颗粒样品和一个α-石英样品的细胞毒性和促炎作用[21]，并采用线性回归模型进行分析。不同矿物的含量由本研究和Grytting等人的XRD分析结果得出。[21(附加文件1:表S1)。在单变量模型中，使用加权线性回归评估不同细胞反应和单个颗粒成分之间的关联。在多变量模型中，采用最小绝对收缩和选择算子(LASSO)惩罚回归，从包含所有颗粒成分的多个线性回归模型中筛选出最佳拟合变量。效果估计值反映了该组件每增加一个单位，端点变化的百分比。在本研究和我们之前的研究中，溶血几乎都是由石英引起的[21]，对矿物学组成与溶血之间的统计学关联的进一步分析被省略。

细胞生存能力

颗粒组分与细胞活力之间的关系如图所示。7．在HBEC3-KT细胞中，石英和白云母在单变量和多变量模型中都与细胞活力呈负相关，而黑云母仅在多变量模型中呈负相关。莫斯科云母的负面影响估计最大，其次是石英和黑云母，这表明这些矿物质含量高的矿物粉尘可能具有更强的细胞毒性。在单变量模型中，微斜石、钠长石、钙长石、绿帘石、正辉石、方解石和绿泥石与细胞活力呈正相关，其中方解石的影响估计最高。因此，这些矿物质含量较高的矿物粉尘似乎具有较低的细胞毒性。然而，在多变量模型中，只有细胞活力与钠长石和帘石之间的关系保持正相关(图。7)．

在THP-1巨噬细胞中，单变量模型中石英、斜长石、黑云母和白云母与细胞活力呈负相关，微斜长石、钠长石、钙长石和方解石与细胞活力呈正相关。至于HBEC3-KT，白云石和方解石分别有最大的负面和积极影响估计。在多变量模型中，石英、黑云母和白云母与细胞活力呈负相关，其中白云母的影响估计最高，而钠长石和钙长石则呈正相关(图2)。7)．

细胞因子释放

在HBEC3-KT细胞中，CXCL8、IL-1β和IL-1α也检测到类似的模式(图2)。8)．在单变量和多变量模型中，石英和白云母是唯一与所有细胞因子呈正相关的矿物成分，在所有情况下，白云母的影响估计最大。斜长石与CXCL8和IL-1β之间以及黑云母与IL-1α之间也检测到正相关。在单变量模型中，方解石是与细胞因子释放负相关最强的颗粒成分，表明该矿物含量高的矿物粉尘炎症作用较小。然而，在CXCL8和IL-1α的多变量模型中，该颗粒成分的效应估计严重减弱，并且从IL-1β模型中消失。此外，方解石仅在少数颗粒样品中存在少量(< 5%)(图。1和附加文件1:表S1)，表明方解石含量对细胞反应的影响较低。钠长石、微斜石、绿帘石、正绿石和绿泥石在单变量模型中也与一种或多种细胞因子呈负相关，但其影响估计低于方解石，这表明这些矿物成分的重要性较低。在多变量模型中，正绿石和绿泥石也分别与CXCL8和IL-1α呈负相关。

与HBEC3-KT相比，THP-1巨噬细胞中不同细胞因子的差异更大，单变量模型与多变量模型之间的差异也更大。9)．然而，与HBEC3-KT相似，在两个模型中，白云母与所有细胞因子呈正相关，并且具有最高的效应估计。斜长石、钙长石、黑云母、钠长石、绿泥石和石英也与较低的效应估计呈正相关，这取决于细胞因子和模型。然而，与HBEC3-KT细胞相比，石英在THP-1巨噬细胞中与细胞因子释放的关联较弱且不一致。虽然滑石粉是与所有细胞因子负相关最强的成分，但这种矿物质在放线石样本中只存在少量(3%)，导致单变量模型的置信区间宽，多变量模型的影响估计低。因此，滑石粉可能不是矿物粉尘毒性的强有力预测指标。与HBEC3-KT一样，在THP-1巨噬细胞的单变量模型中，方解石与所有细胞因子表现出强烈的负相关。CXCL8和IL-1β的相关性在多变量模型中仍然存在，尽管减少了，但TNFα没有。微斜石、放线石、绿帘石、角闪石和正辉石也被检测出负相关，这取决于细胞因子和模型，但其效应估计低于方解石。

先前的研究表明，不同的石头和矿物颗粒诱导细胞毒性和炎症反应的能力不同[20.，23，24，25，27］．然而，造成这些差异的原因仍然没有解决。在本研究中，我们通过体外评估10个矿物颗粒样品的细胞毒、促炎和溶膜作用，并通过分析不同矿物成分与矿物粉尘生物活性之间的统计关联，探索了矿物成分的作用。总的来说，研究结果表明，矿物粉尘中常见的几种矿物质可能有助于诱导人体呼吸道细胞的急性炎症反应。重要的是，矿物质的效力不同，有些矿物质的诱导作用与石英相当，特别是在较低浓度下诱导细胞因子反应。

以前关于石头和矿物颗粒毒性的研究提供了一些相互矛盾的结果。本小组较早的研究结果表明，长石矿物含量高的样品，无论是斜长石还是微斜长石，在人A549细胞、大鼠2型细胞和巨噬细胞中，以及在体内的大鼠中，都是炎症细胞因子最弱的诱导物之一[20.，23，24，25，26，27］．此外，在大鼠2型细胞中，斜长石含量与MIP-2的产生呈较强的负相关[27］．长石粉尘的低毒也得到其他小组研究结果的支持[32，33，34］．相反，我们实验室最近的发现表明，富含长石的颗粒样品具有更多样的生物活性，样品主要由长石诱导的细胞毒性和HBEC3-KT细胞和THP-1巨噬细胞中促炎细胞因子的释放组成，其程度与α-石英相似或更高[21］．对于新旧研究之间的差异，一个可能的解释可能是不同长石矿物的存在。长石是一组矿物，根据元素K, Na和Ca的含量进一步分类，通常根据各自的端元进行分类。在矿物学中，端元是指在纯度方面代表矿物系列末端的矿物。斜长石由Na长石和ca长石的固溶体组成，钠长石和钙长石分别形成Na和ca端元，而钠长石和k长石端元之间的固溶体微斜长石被称为碱长石(附加文件2:图S1)。我们先前研究评估的斜长岩主要由斜长石组成，而较弱的菱形斑岩除斜长石外，还含有大量的微斜长石[21]，这表明这些颗粒样品之间效力的差异可能是由于存在不同的长石矿物。为了支持这一观点，本研究的结果表明，主要由微斜长石组成的k长石样品比主要由钠长石和钙长石组成的na长石和ca长石样品在THP-1巨噬细胞中表现出更低的促炎潜能。此外，回归分析显示，微斜石含量与THP-1中CXCL8和IL-1β的释放呈负相关，而钙长石含量与所有细胞因子的释放呈正相关。此外，在单变量模型中，由Na长石和ca长石组成的斜长石含量与CXCL8和IL-1β释放增加有关。相反，在HBEC3-KT中，长石样品之间没有检测到炎症潜能的差异，尽管斜长石含量与CXCL8分泌增加有关，而微长石和钠长石仅在单变量模型中与IL-1β分泌呈负相关。此外，气管内灌注主要由钙长石组成的斜长石粉尘对大鼠肺毒性和炎症标志物没有影响[33，34］．然而，Damby等人。35]报告称，暴露于拉布拉多石(一种含有50-70%钙长石的中间斜长石)后，小鼠巨噬细胞中IL-1β的释放增加，尽管与石英方石沸石相比效果温和。综上所述，结果表明长石诱导促炎反应的能力可能因长石矿物而异，钙长石和钠长石比微斜长石具有更高的效力。然而，这种效应似乎取决于模式系统。因此，长石矿物对矿物粉尘毒性的贡献的全部程度仍然不确定。

除长石外，以往研究中使用的富含长石的石粒样品还含有不同数量的其他矿物，如绿泥石、方解石、黑云母、角闪石、云母、绿帘石、黑云母、白云母和石英[21，23，27］．有趣的是，在本研究的回归分析中，白云母是唯一与所有终点一致相关的颗粒成分，这表明这种矿物质含量高的颗粒样品可能具有更强的细胞毒性和促炎作用。白云母属于层状硅酸盐的云母组，这是一组以片状形态为特征的矿物。白云母主要存在于Grytting等人研究的斜长岩样品中。[21]，可能以绢云母的形式出现，绢云母是一种细粒云母，类似于白云母、伊利石和paragonite，由长石矿物降解形成[36］．黑云母也是层状硅酸盐云母组的一员，与白云母有相似之处，但含铁量更高。在HBEC3-KT细胞和THP-1巨噬细胞中，黑云母是最具细胞毒性的矿物，在HBEC3-KT细胞中，黑云母诱导的细胞因子浓度最低。然而，在回归分析中，仅检测到与两种细胞类型的细胞毒性以及与THP-1中的CXCL8和IL-1β的微弱关联。这可能是因为，除了纯黑云母样品外，该矿物只在分析中包括的其他颗粒样品中少量存在(图2)。1和附加文件1:表S1)。几种层状硅酸盐，包括云母矿物白云母和云母，具有巨大的商业价值，可用于各种不同的应用领域，如造纸、塑料、橡胶、陶瓷、建筑材料、电子产品和化妆品[2］．如Skulberg等人所述。[6]研究显示，从事采矿、碾磨或包装云母的职业接触，可能会增加患上尘肺病的风险。然而，由于接触云母或其他层状硅酸盐而导致尘肺病的发展似乎需要长期接触非常高浓度的灰尘，而接触其他职业危害物，如石英和石棉，往往会混淆这种疾病的关系[6，37］．然而，数宗个案报告显示，在没有其他职业危害的情况下，大量接触云母粉尘可引致不同于矽肺的尘肺病[38，39，40，41，42，43，44］．虽然实验研究的数量很少，但暴露于云母的毒性已被报道。Sahu等人的研究表明，气管内灌注云母粉尘可在大鼠和小鼠中引起肺部炎症和轻度纤维性反应，尽管作者指出，小鼠的病变与人类的病变不同[45，46］．同样，Rosmanith等人发现气管内灌注白云母可引起大鼠的纤维化反应，其中最细的尘埃组分引起的反应最大[47］．一项评估不同制备的燃锌矿样品毒性的体外研究发现，矿物以浓度依赖的方式诱导小鼠RAW 264.7巨噬细胞的细胞毒性和细胞因子分泌，其程度与石英相似或更大[48］．云母镁也被称为镁云母，是黑云母系列矿物的镁端元。鉴于本研究中云母与颗粒毒性之间的联系，人们很容易推测云母的片状结构可能代表了另一种有助于颗粒毒性的特征，类似于从石棉和纳米纤维研究中获得的明确的纤维致病性范式[49］．根据这一概念，Holopainen等人。[48]提出，更大的完整云母片的存在是其水洗脱样品毒性增加的原因[48］．薄的矿物薄片可能比相同直径的球形或不规则颗粒具有更大的表面积，这可能是毒性增加的原因。遗憾的是，在本研究中，可用的样品材料数量有限，无法测量矿物样品的表面积。综上所述，我们目前的发现支持了之前的研究，并表明云母矿物对健康的影响可能值得进一步关注。

石英是一种已知的致病性矿物，吸入后可导致矽肺和肺癌[16，18］．在本研究中，纯石英样品是两种细胞类型中细胞毒性和促炎颗粒样品中最强的。这与Grytting等人的结果一致。[21]，表明以石英为主的α-石英和石质颗粒样品具有较高的生物活性。在回归分析中，石英含量与两种细胞模型的细胞毒性增加有关。在HBEC3-KT细胞中，石英含量与CXCL8、IL-1β和IL-1α呈正相关;在THP-1巨噬细胞中，石英含量与IL-1β和CXCL8呈正相关。然而，对THP-1巨噬细胞中CXCL8释放的影响估计相对较低，并且没有检测到石英含量与TNFα之间的关联。这可能是由Grytting等人评估的一些富石英颗粒样品的低生物活性所解释的。[21]，并被纳入本研究的回归分析。此外，本研究中石英样品的影响主要是在最高浓度下观察到的，该浓度被排除在细胞因子AUC计算之外，因此也被排除在回归分析之外，以最小化细胞毒性的影响。在较低的浓度下，其他几种矿物样品似乎同样或甚至更有效。然而，这些发现强调，即使石英颗粒可以诱导HBEC3-KT细胞和THP-1巨噬细胞强烈的炎症反应和细胞毒性，石英含量本身可能不能完全预测矿物粉尘的毒性。

重要的是要记住，对石英的研究表明，即使是单一的矿物，其生物反应活性也可能有很大差异。如Donaldson和Borm所述[50)”石英构成的危害不是一个恒定的实体，而是根据二氧化硅样品的来源或其与复杂结构中的其他化学物质/矿物的接触而发生巨大变化。”如果石英的毒性取决于样品的来源或特定的颗粒性质，那么似乎可以合理地假设类似的因素可能会影响其他矿物颗粒的毒性。因此，粒子毒理学中关于石英危害的陈述是“一个可变实体可能会延伸到大多数其他生物活性矿物。某一矿物毒性的任何这种变化必然会影响矿物成分与生物效应之间关系的统计分析。

虽然目前的研究支持石英以外的矿物质可以在巨噬细胞和肺上皮细胞中诱导急性炎症反应的观点，但其机制仍然难以捉摸。石英的毒性假设是由断裂颗粒的反应表面引起的，这导致溶酶体膜的不稳定，随后通过溶酶体内容物的泄漏激活包含pyrin结构域3 (NLRP3)的核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体[51］．红细胞膜已被用作细胞膜的模型，在实验研究中，颗粒诱导的溶血已被证明与石英颗粒的毒性有很好的相关性[30.，31］．然而，除了石英之外，本研究中的矿物样品引起的溶血程度可以忽略不计，这表明颗粒通过不同的机制发挥作用。石英的反应性源于粒子表面的贝壳状裂缝中产生的硅烷醇等几乎游离的组分[52］．然而，石英是目前研究中评估的唯一显示这种解理模式的矿物。因此，贝壳状裂缝的缺失可能解释了其他矿物样品以及Grytting等人评估的石粒样品的膜溶解潜力较差。[21］．然而，我们小组之前的研究表明，不含石英和低溶血电位的石头颗粒样品仍然能够激活THP-1巨噬细胞中的NLRP3炎症小体途径，这表明本研究评估的矿物质也可能是这种情况[21］．

本研究中使用的几种矿物样品中含有金属，据报道这些金属可诱导肺细胞中的ROS、炎症和细胞毒性，这表明在本研究中报道的颗粒诱导效应中具有潜在作用[53，54，55，56，57］．存在于矿物颗粒和环境PM中的金属均可溶于生理溶液，在低pH值环境中，如溶酶体中，溶解程度可能会增加[26，58，59，60]，表明这些金属可能与细胞相互作用。本研究中评估的几个颗粒样本含有相当数量的铁，铁是一种过渡金属，已知通过Fenton和Haber-Weiss反应促进ROS的形成和氧化应激。在所有的颗粒样品中，黑云母含铁量最大，含铁量为25%₂O_3.其次是正辉石(17%)，角闪石和绿帘石(13-14%)，放线石和辉石(7-8%)。研究表明，破碎的石头和矿物颗粒可以在无细胞溶液中产生活性氧，如羟基自由基和过氧化氢[26，61，62，63]，而含铁量高的矿物颗粒氧化潜能更强[61，62，64，65］．此外，Costa等人的研究表明，黑云母具有较高的产生ROS的能力[64，65］．然而，铁含量与颗粒诱导的炎症和细胞毒性之间的相关性并不明确，因为本研究评估的黑云母、绿石、角铀矿和正辉石样品都含有大量的铁，但效力差异很大。与此一致，Øvrevik等。[26]未检测到总铁或可溶性铁含量、ROS生成与mylonite、辉长岩、玄武岩、长石、碧玉、橄榄石、抗尖晶石和石英颗粒诱导A549细胞炎症细胞因子和细胞毒性的能力之间存在任何相关性。类似地，Hetland等人。[22]检测到产生细胞和非细胞ROS的能力与糜棱岩、辉长岩、玄武岩和长石颗粒诱导的细胞因子分泌之间没有相关性。有趣的是，挪威地质调查局的一份报告显示，与包括绿帘石在内的其他几种矿物相比，黑云母更容易溶于盐酸和硝酸[66]，这表明这种矿物质中的铁可能更容易与细胞相互作用。据此，对温石棉、椰云石和绒云石纤维的实验表明，金属在模拟生物流体中的溶解取决于矿物的溶解度，不一定由金属总含量反映[58］．同样，据报道，糜棱岩、辉长岩、长石、碧玉、橄榄石、反尖晶石和石英颗粒中的总铁和可溶性铁含量存在差异[26］．由于本研究没有尝试评估在生理相关溶液中不同颗粒样品中金属的生物利用度，因此很难辨别它们在所观察到的颗粒诱导效应中的作用。然而，本研究不能排除金属和ROS可能导致某些矿物样品(如黑云母)的毒性。

应该指出的是，在本研究中使用的一些样品之间的颗粒大小有显著差异。特别是，角闪石和黑云母样品之间存在很大的差异，它们分别含有最多的小颗粒和大颗粒。黑云母样品中较大的颗粒尺寸可能是由于这种矿物的片状形态，这导致颗粒在提取< 10微米颗粒部分时在水中沉降得更慢。然而，角闪石样品尺寸较小的原因尚不确定。在HBEC3-KT细胞中，颗粒大小与颗粒诱导的IL-1α和IL-1β释放之间检测到显著的相关性，这表明矿物样品之间的一些差异可能是由于颗粒大小而不是矿物本身的特性。然而，这一结果与一般认为在质量相等的基础上，较小的粒子比较大的粒子更有效的观点不一致，因为每质量的表面积更大[67，68，69，70］．因此，我们怀疑在本研究中观察到的颗粒大小和细胞因子释放之间的明显联系是偶然的，而不是颗粒大小是潜在原因的证据。这也被THP-1巨噬细胞中缺乏类似的关联所支持。但是，应该考虑到，由于颗粒大小可能会影响相同成分的颗粒的效价，因此在当前的研究中，具有较小颗粒的样品的效价可能在一定程度上被高估了。相反，粒径较大的样品的效力可能被低估了。一个可能的例外是黑云母样本，因为之前对云母促炎作用的研究报告称，最大和最完整的云母样本是最强的[48］．然而，由于我们没有比较相同矿物的不同尺寸样品的影响，因此无法得出关于粒径对不同矿物样品的影响的确切结论。

本研究的结果进一步证明，石英以外的矿物质可以诱导人体呼吸道细胞的炎症反应。所有矿物质都在一定程度上诱导了生物效应，但其效力差异很大。与以往长石矿物效价低的研究相反，本研究表明长石矿物的生物活性更加多变，钙长石和钠长石比微斜长石的生物活性更强。在回归分析中，黑云母样品的高促炎潜力以及生物活性与白云母含量之间的一致关联特别令人感兴趣，因为这表明含有高含量片状云母矿物的灰尘可能更危险。片状结构是否可以代表一种影响粒子毒性的特性，例如通过提供更大的表面质量比，这是一个值得进一步关注的有趣问题。

颗粒制备及表征

生成颗粒< 10µm

钠长石、钾长石、钙长石、黑云母、绿帘石、角闪石、放线石、辉长石、石英和正辉石的样品是挪威地质调查局以手工标本的形式购买或收集的。在目视检查材料并去除杂质后，样品在装有低铬钢板的颚式破碎机中破碎。钠长石、钾长石、钙长石和黑云母样品在交付时已被粉碎。接下来，将破碎的钠长石、钾长石、钙长石、绿帘石、角闪石、放线石、辉长石、石英和正辉石样品在振动玛瑙圆盘磨机中研磨。黑云母样品在玛瑙球磨机中研磨，因为纯云母颗粒会润滑玛瑙圆盘磨机的腔室，产生不充分的结果。制备方法的差异预计不会影响所得到的颗粒的效力。最后，在去离子水中通过重力沉降分离出直径< 10 μ m的颗粒，并按照Grytting等人的描述进行提取。[21］．

地球化学和矿物学特征

粒子样品的表征是使用x射线衍射(XRD)和x射线荧光(XRF)光谱进行的，如前所述[21］．样品的地球化学成分用PANalytical Axios序列波长色散x射线光谱仪分析，该x射线光谱仪使用4千瓦rh管。矿物学分析使用Bruker D8 Advance衍射仪进行(Cu Kα辐射在3-75°2θ范围内)。矿物鉴定使用布鲁克衍射EVA V4.1软件的自动/手动峰搜索和匹配功能，使用Crystallographic Open数据库和来自国际衍射数据中心的PDF4矿物数据库，并使用TOPAS 5软件中的Rietveld建模进行量化。

粒径分布

粒径分布由贝克曼库尔特LS13320激光粒度分析仪测定，如前所述[21］．样品悬浮液在5%焦磷酸钠的水中制备，用MSE超声分解器在振幅为14的情况下超声5分钟。黑云母、角闪石、正辉石样品从粉末中分析，但其他处理方法与悬浮液样品相同。

内毒素污染

颗粒样品中的细菌内毒素浓度使用Pierce™显色内毒素定量试剂盒(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)进行测量，并在Grytting等人中进行了微小修改。[21］．

细胞培养和暴露

THP-1

THP-1细胞在RPMI 1640细胞培养液中培养，加入l -谷氨酰胺(Gibco, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)，并辅以丙酮酸钠(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)、肝杆菌(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)、庆大霉素(Gibco, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)和10%胎牛血清(FCS;Biochrom，柏林，德国)。细胞在含有5% CO的潮湿气氛中保持在37°C₂并每隔2-3天传代一次，以保持约5 × 10的密度⁵细胞/毫升。在实验过程中，这些细胞在6孔康宁(Corning)中进行播种^®配角^®细胞培养板(Merck, Darmstadt, Germany)在2 mL细胞培养基中以50万个细胞/mL的密度培养，经64 nM肉豆汤酸乙酸phorbol myristate acetate (PMA;默克，达姆施塔特，德国)在37°C的气氛中含有5% CO 48小时₂．在向THP-1巨噬细胞分化后，去除培养基，用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞一次，然后用无血清RPMI替换培养基。

HBEC3-KT

人支气管上皮细胞(HBEC3-KT)在LHC-9培养基(Lonza, Basel, Switzerland)中，在胶原蛋白涂层的T75烧瓶中培养，并在含5% CO的潮湿气氛中保持37°C₂．每周两次将细胞培养物从烧瓶中取出并传代以保持适当的条件。实验前，将细胞以2.2 × 10的浓度接种在胶原蛋白包被的6孔细胞培养板上⁵每孔细胞在1ml LHC-9培养基中。24小时后，更换LHC-9培养基，细胞再孵育24小时。然后，暴露前24小时，每个孔用1 mL PBS清洗，然后加入1 mL无血清DMEM (Gibco, Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA, MA)，并辅以青霉素-链霉素(Lonza, Basel, Switzerland)、氨苄青霉素(New York, NY, USA)和双霉素B (Sigma, St. Louis, MO, USA)。

颗粒原液的曝光制度和制备

在无血清细胞培养基中制备颗粒原液。为了确保颗粒的均匀悬浮，使用Vibra-Cell™探头超声波仪(sonic & Materials Inc.， Newtown, CT, USA)对原液进行5分钟的超声处理。初级颗粒原液浓度为2 mg/mL，并在孔中进一步稀释，以产生最终浓度为50、100、200、300和400µg/mL。HBEC3-KT细胞和THP-1巨噬细胞分别暴露于1ml无血清DMEM和RPMI中。暴露后，细胞在37°C含5% CO的气氛中孵育24小时₂．24 h后，细胞培养基转移至1.5 mL Eppendorf管中，290 × g离心10 min，去除细胞和碎片。上清液转移到新的Eppendorf管中，以1200 × g离心10 min去除颗粒。离心后，将上清液转移到新的Eppendorf管中，并保存在−80°C下等待分析。

酶联免疫吸附试验

细胞培养上清液中的细胞因子浓度使用Cytoset (TNFα和CXCL8, Invitrogen由Thermo Fischer Scientific和Novex由Life Technologies)或Duoset (IL-1α和IL-1β，研发系统，Minneapolis, MN, USA)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行测量，两者均按照制造商说明书使用。ELISA在Nunc Maxisorb板上进行(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)。使用Tecan Sunrise平板阅读器(Tecan, Männedorf，瑞士)测量吸光度。

细胞毒性

根据制造商说明书，使用alamarBlue法(Invitrogen公司，Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)评估细胞毒性。细胞在37℃、含5% CO的气氛中用1:10稀释的alamarBlue溶液在细胞培养基中孵育60分钟₂．荧光测量使用Clariostar平板阅读器(BMG LABTECH, Ortenberg，德国)。

溶血试验

溶血试验改编自Pavan等人[71]并按照Grytting等人的描述执行。[21］．获得所有志愿者的知情同意(n= 3)，并获得挪威医学和健康研究伦理区域委员会的伦理批准(REC,2015/1322)。简单地说，供体血液在含K的10ml真空容器中取样₂EDTA (BD，富兰克林湖，新泽西州，美国)。然后离心分离血样，用0.9%生理盐水冲洗稀释红细胞。将红细胞悬液与0-400µg/mL颗粒在96孔细胞培养板中孵育30 min。孵育后，将平板离心去除颗粒和完整的红细胞。然后将上清液转移到一个新的96孔板上，使用Sunrise平板读数仪(Tecan, Männedorf，瑞士)在540 nm处测量吸光度，以检测游离血红蛋白。结果以阳性对照的百分比(0.1% triton X-100;Thermofischer, Waltham, MA, USA)。

统计分析

使用Graphpad Prism 8(版本8.0.1)或R(版本3.5.0)软件进行统计分析。

微粒暴露的影响

采用双因素方差分析(two-way ANOVA)和邓尼特后验(Dunnett’s post test)确定暴露在颗粒下的细胞与对照组之间有统计学意义的差异。对于粒子间比较，曲线下面积(AUC)计算浓度响应数据为每个实验使用梯形规则。AUC值采用单因素方差分析和Tukey后验进行比较。在计算AUC值以解释基线值的差异之前，将细胞活力数据标准化以反映活力百分比。基于残差图和QQ图的评价，由于非正态性和异方差性，在分析前对几个数据集进行了对数转换。使用为每个颗粒样本计算的平均AUC值，通过Pearson相关评估不同细胞终点与颗粒大小和内毒素含量之间的相关性。在所有情况下，p值低于0.05被认为有统计学意义。

矿物成分与生物活性之间的关系

矿物成分和生物活性之间的关系是用线性回归模型评估的。评估QQ图和残差图以评估模型假设。以XRD分析中检测到的不同矿物成分的含量(附加文件1:表S1)为自变量，细胞因子反应和细胞活力的AUC值见图。3.，4而且5在本文和图中。2，3.而且4在Grytting等人。[21]作为因变量。在单变量模型中，使用加权线性回归模型评估单个矿物成分含量与不同细胞端点的AUC值之间的关联。权重被应用到每个单独的模型根据Eq。1因为违反了同方差假设。

在多变量分析中，将LASSO惩罚应用于包含所有不同矿物成分的多个线性回归模型，以选出预测每个细胞端点的最佳拟合参数。LASSO惩罚通过创建多个可能的回归模型拟合来执行变量选择和正则化，然后通过交叉验证程序进行评估[72］．在本研究中，采用省略交叉验证来评估回归模型的拟合。在单变量和多变量模型中，由于非正态性，因变量都进行了对数转换。因此，回归系数根据式进行变换。2反映因变量中由于自变量中一个单位的变化而产生的百分比变化。

采用Bonferroni校正法对单变量模型中的多重检验进行校正并进行校正p数值低于0.05被认为有统计学意义。对于多变量模型，所选模型(即通过LASSO选择的模型)中的参数被认为具有统计学意义。

本研究中使用的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

AUC:

曲线下面积

CXCL:

趋化因子cxc基序配体

DMSO溶液:

二甲亚砜

ELISA:

酶联免疫吸附试验

HBEC3-KT:

人支气管上皮细胞

IL:

白介素

拉尔:

鲎变形细胞裂解液

套索:

最小绝对收缩和选择算子

NLRP3:

核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体含有pyrin结构域3

ASC:

含有一个CARD的与凋亡相关的斑点样蛋白

下午:

可吸入颗粒物

PMA:

肉豆蔻酸酯浮波

ROS:

活性氧

肿瘤坏死因子:

肿瘤坏死因子

XRD:

x射线衍射

光谱仪:

x射线荧光

我们感谢T.S. Skuland, L.J. Ekeren和E.M. Lilleaas对维持细胞培养的协助。我们也感谢J. Schönenberger, R. van der Lelij和M.S. Halle在制备和表征矿物样品方面的工作。

这项工作是PrevenTAP项目的一部分，由挪威研究委员会通过改善健康方案(第260381号赠款)资助。

作者及隶属关系

1. 挪威公共卫生研究所气候与环境卫生学部空气质量与噪声部，挪威奥斯陆，PO Box 222, 0213

   Vegard Sæter Grytting, Magne Refsnes & Marit Låg

2. 挪威地质调查局，特隆赫姆，挪威

   Eyolf Erichsen & Torkil Sørlie Røhr

3. 挪威公共道路管理局，特隆赫姆，挪威

   布琳希尔德Snilsberg

4. 挪威公共卫生研究所感染控制和环境卫生司，方法开发和分析部，挪威奥斯陆

   理查德·奥布里·怀特

5. 挪威公共卫生研究所气候和环境卫生司，挪威奥斯陆

   约翰Øvrevik

6. 奥斯陆大学数学与自然科学学院生物科学系，挪威奥斯陆

   约翰Øvrevik

贡献

JØ在ML、MR和BS的支持下构思并协调了这项研究。VSG、JØ、ML和MR共同策划并设计了实验。VSG完成了所有体外实验，分析了数据，并在ML, MR和JØ的支持下起草了手稿。RAW协助了数据的统计分析和结果的解释。EE和TSR获得、制备和分析了矿物样品，并对相关方法进行了描述。所有作者阅读、评论并批准最终稿。

相应的作者

对应到Vegard Sæter Grytting或玛莉特•滞后．

伦理为认可和同意参与

获得了挪威医学和健康研究伦理区域委员会(REC;2015/1322)。所有志愿者均获得知情同意。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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