体外消化氧化锌纳米颗粒对肠道模型系统的影响gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

氧化锌纳米颗粒(ZnO NP)具有许多有益的应用，特别是在食品领域。因此，作为人类食物链的一部分，它们被口服。口服氧化锌NP的毒理学评价仍有争议。此外，它们的物理化学性质可以在消化过程中发生变化，从而导致生物行为的改变。因此，我们的研究目的是研究两种不同尺寸的ZnO NP (< 50 nm和< 100 nm)在过程中的命运gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba消化及其对肠屏障模型系统的影响。分化后的Caco-2细胞与产生黏液的HT29-MTX细胞进行单培养和共培养。研究了123-614 μ M ZnO NP暴露24 h后细胞摄取、对单层屏障完整性的影响和细胞毒性作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

体外消化的ZnO NP在肠期后发生形态和化学转化，游离锌离子约为70%。消化氧化锌NP处理后，细胞锌含量在单培养中增加了3倍，在共培养中增加了4倍。这导致活性氧的产生，但对细胞器、代谢活性和线粒体膜电位没有影响。只有非常少量的锌(< 0.7%)到达基底外侧区域，这是由于未修饰的经上皮电阻、渗透性和细胞骨架形态。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究结果表明，消化和修饰的ZnO NP与完整肠屏障的细胞相互作用。但这与严重的细胞损伤无关。gydF4y2Ba

由于其优越的性质，每年大量的纳米颗粒(NP)被生产和广泛应用，导致向生态系统的排放量稳步上升[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．特别是食品行业为NP提供了全面的应用领域，例如食品包装材料、纳米农药和其他食品相关产品[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．因此，NP在人类食物链中的含量不断增加，而口服摄入是人类接触NP的主要途径之一[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

氧化锌(ZnO) NP具有较高的热、化学和机械稳定性，以及抗菌和光催化活性[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．因此，它们被用于与消费者相关的领域，例如在食品储存容器中，用于食品加工或食品保存，作为膳食补充剂代替锌盐，以及作为食品添加剂。它们也可以添加到牛奶、乳制品、谷物和饮料中[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．ZnO NP的广泛生产和应用，不可避免地导致这些粒子释放到环境中[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

近年来，NP特别是ZnO NP的环境行为和生物毒性越来越受到人们的关注。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．与此同时，人们对食品行业中使用的壬基酚可能引起的毒性表示担忧[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．因此，迫切需要了解NP与生物系统的相互作用，以找到预测NP反应性和纳米毒性的关键参数[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

先前发表的关于口服氧化锌NP对肠道模型的毒性作用的数据仍然不一致。一些研究发现了氧化锌NP处理引起的负面生物学后果，例如肠道炎症增加、细胞活力降低和线粒体膜去极化[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．另一些实验则显示出相当不确定的结果，在某些实验中不能证明ZnO NP毒性，例如未修饰的单层渗透性，但破坏的刷状边界膜[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，或得出ZnO NP暴露的无害性[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．毒性似乎取决于所使用的细胞模型，以及其他因素[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

众所周知，当NP被用作食品添加剂时，其物理化学性质会发生变化[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，特别是在口服摄入和消化之后，由于人体消化系统的生理环境(其特征是pH值变化和盐和酶的不同混合物)，NP特性及其行为、团聚、去团聚和溶解能力，以及因此对人类和生态健康的毒理学潜力可能受到影响[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．还应考虑所摄入食物的成分，因为它也会影响消化过程中的NP性质[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．从逻辑上讲，为了评估肠道摄取对ZnO NP特性和潜在毒性的影响，模拟消化过程是有用的。这是必要的，因为未消化和消化的ZnO NP的性质不同，因此它们对肠细胞的影响也不同[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．关于消解过程对ZnO NP物理化学性质和生物行为影响的现有数据不足[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．但是，对摄入NP后的命运的理解与NP在胃肠道中的影响有关[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

因此，得到了两种不同尺寸的ZnO NPgydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba消化的为接近生理环境而消化的对消化后的氧化锌NP进行表征，取相应浓度进行细胞培养实验。为此，分化Caco-2细胞，其形态和功能类似于肠细胞gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba，作为单一培养。此外，加入产生黏液的杯状细胞HT29-MTX共培养，使其更接近胃肠道的复杂结构。细胞在Transwell插入物上生长，该插入物允许分离成根尖和基底外侧隔室。用消化过的氧化锌NP处理细胞后，研究了锌的吸收及其对屏障完整性、通透性、代谢活性、活性氧(ROS)生成和线粒体膜电位(MMP)的影响。gydF4y2Ba

ZnO NP的表征gydF4y2Ba

采用ICP-OES模拟口腔、胃、肠相，研究人工肠液中游离锌离子和结合锌的比例。纯肠液中锌的总量(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)上清液为0.8±0.1 mg/l，沉淀物为0.1±0.1 mg/l。随着ZnO NP和ZnCl用量的增加，肠液中锌含量增加gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba数量。经过体外消化614 μ M ZnO NP和ZnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，上清液中锌的含量增加了200多倍(白色条;ZnO NP < 50 nm为192.0±25.2 mg/l, ZnO NP < 100 nm为187.5±15.8 mg/l, ZnCl为209.7±72.2 mg/lgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)，在沉淀物中高出600多倍(黑条;ZnO NP < 50 nm时为82.3±18.7 mg/l, ZnO NP < 100 nm时为139.6±65.6 mg/l, ZnCl为87.4±14.0 mg/lgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)与纯肠液相比。大约70%的锌在上清液中被发现，只有30%的锌在沉淀物中被检测到(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab). ZnO NP与ZnCl之间只有微小的差异gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba关于游离锌离子和结合锌离子的比例。gydF4y2Ba

利用透射电镜观察了ZnO NP (< 50 nm和< 100 nm)在氧化过程中的变化规律gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba消化步骤(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在唾液和胃液中，由于氧化锌NP浓度较高(3.34 mg/ml)，出现了复杂的结构，对比度较高。氧化锌NP < 50 nm与氧化锌NP < 100 nm的聚集体形貌不同。经过肠期和最后的细胞培养基稀释，结构发生变化。NP从口腔阶段(唾液)到细胞培养基稀释有明显的结构转移。gydF4y2Ba

锌的定量gydF4y2Ba

用ICP-MS研究了消化后的ZnO NP的细胞摄取。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．因此，计算锌的细胞量为1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞。未处理组和溶剂组的锌含量相似(单培养组:未处理组9.2±3.1 ng，溶剂组10.1±2.5 ng;共培养:未处理对照组10.5±2.3 ng锌，溶剂对照组11.2±2.1 ng锌)。在307 μ M和614 μ M ZnO NP < 50 nm、ZnO NP < 100 nm和ZnCl处理后，两种培养物的锌含量均显著增加gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．在单一培养中(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa)， 614 μ M ZnO NP < 100 nm孵育可使锌含量增加2.7倍，从而达到最高水平(27.4±7.1 ng)。在共培养中(图;gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab)，在614 μ M ZnCl处理后，增加了4倍，因此增加幅度最大gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(44.7±7.9 ng锌)。gydF4y2Ba

用ICP-MS研究了消化氧化锌NP处理后，锌通过单细胞和共培养细胞单层的渗透情况。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．因此，在根尖和基底外侧细胞处理前后，分别测定了培养培养基中的锌含量。对肠液溶剂对照(用细胞培养基1:10稀释)的基础锌含量数据进行校正。随着ZnO NP和ZnCl用量的增加，培养液中锌含量增加gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba数量。在614 μ M ZnO NP和ZnCl处理后，基底外侧区室中锌含量较少，锌含量最高gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(单一培养中0.1±0.0µg/ml锌;共培养0.2±0.0µg/ml锌)。根尖和基底侧分散的总和之间的差异反映了细胞对锌的吸收。在单一培养中(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Baa)，用123µM ZnO NP < 50 nm处理后(原液:7.3±0.3µg/ml锌;顶端:6.5±0.3µg/ml锌;底侧:0.03±0.0µg/ml锌)，307µM ZnO NP < 50 nm(原液:18.2±0.2µg/ml锌;顶端:锌16.5±0.6µg/ml;基底侧:0.1±0.0µg/ml锌)，123µM ZnO NP < 100 nm(原液:8.4±0.4µg/ml锌;顶端:锌6.9±0.2µg/ml;基底侧:0.02±0.0 μ g/ml锌)和307 μ M ZnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(原液:锌18.5±0.4µg/ml;顶端:锌17.0±0.2µg/ml;基底外侧:0.1±0.0µg/ml锌)。共培养细胞(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)用123µM ZnCl处理后差异显著gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(原液:锌7.6±0.3µg/ml;顶端:6.7±0.5µg/ml锌;底侧:0.03±0.0 μ g/ml锌)和307 μ M ZnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(原液:锌18.4±0.3µg/ml;顶端:锌16.7±0.7µg/ml;基底外侧:0.1±0.0µg/ml锌)。gydF4y2Ba

透射电镜评价gydF4y2Ba

用透射电镜观察消化氧化锌NP处理后的细胞器和细胞超微结构(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．分化后的Caco-2细胞与HT29-MTX细胞形成上皮极化多层。两种细胞类型都有微绒毛;有清晰可见的细胞膜、细胞核，还有细胞与细胞之间的接触。用消化后的ZnO NP和ZnCl处理细胞gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与未处理的细胞和溶剂对照相比，未见异常。gydF4y2Ba

屏障完整性调查gydF4y2Ba

通过测定TEER，研究了消化后的ZnO NP对单层阻挡功能的影响。因此，测定孵育24 h前后的TEER值，通过将孵育前的上皮耐药归一化为孵育后的上皮耐药，计算相对TEER值。Caco-2单培养细胞的处理(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)阳性对照组triton X-100/EGTA的TEER值明显低于未处理对照组(94.2±2.5%);阳性对照组为39.8±0.4%)。在Caco-2/HT29-MTX共培养中也观察到类似的结果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB:未处理对照组105.4±11.6%;阳性对照组为37.4±4.6%)。肠液溶剂控制、ZnO NP和ZnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba对TEER无影响，单培养时相对值大于94%，共培养时相对值大于101%。gydF4y2Ba

消化后的ZnO NP对单分子渗透性的影响是通过在基底外侧室中测量顶端给药的fitc -右旋糖酐来检验的(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．fitc -葡聚糖在细胞旁通过细胞膜。细胞旁通透性的增加导致基底外侧区域的fitc -葡聚糖含量增加。我们的结果显示，在两种培养物中，随着处理时间的增加，基底外侧区室中的fitc -右旋糖酐浓度升高。此外，共培养细胞的fitc -葡聚糖浓度基本高于单培养细胞。阳性对照triton X-100/EGTA在所有时间点均导致基底外侧区室中fitc -右旋糖酐浓度显著升高(单培养:0.5 h后9.5±2.3µg/ml, 1 h后12.1±4.9µg/ml, 6 h后65.0±2.4µg/ml;共培养:0.5 h后10.7±2.3µg/ml, 1 h后14.1±5.4µg/ml, 6 h后66.2±10.3µg/ml)与未处理对照(单培养:0.5 h后0.01±0.02µg/ml, 1 h后0.01±0.01µg/ml, 6 h后0.16±0.04µg/ml;共培养:0.5 h后0.02±0.03µg/ml, 1 h后0.03±0.03µg/ml, 6 h后0.42±0.06µg/ml)。溶剂处理控制肠液、ZnO NP和ZnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba对单层渗透性无影响。gydF4y2Ba

通过phalloidin-iFluor 488和DAPI染色观察消化后的ZnO NP对单层形态的影响(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．Caco-2单培养细胞和Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的单分子层形态特征相似。细胞生长密集，细胞核和细胞骨架清晰可见。阳性对照triton X-100/EGTA处理后，细胞呈圆形，单层与Transwell插入物明显分离。用溶剂培养控制肠液、ZnO NP和ZnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba对细胞骨架和核形态无影响。gydF4y2Ba

细胞毒性检测gydF4y2Ba

用MTT法研究Caco-2单培养和Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的代谢活性。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．数据归一化为未经处理的对照组。阳性对照triton X-100/EGTA处理后，单培养和共培养细胞的代谢活性均显著降低(单培养的残余代谢活性为5.5±0.6%;共培养5.9±0.1%)。以肠液溶剂控制及氧化锌NP和氯化锌处理gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与未处理的对照组相比没有显著变化。614 μ M ZnCl孵育24 h后代谢活性最低gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(88.8±4.3%);共培养92.3±7.2%)。gydF4y2Ba

为了研究ZnO np在单培养和共培养细胞中诱导的ROS，使用荧光氧化还原活性探针DCFH-DA(图2)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．数据归一化为未经处理的对照组。与未处理的对照组相比，阳性对照过氧化氢处理导致两个模型的荧光强度增加了两倍以上(单一培养的224.6±37.0%;共培养为237.2±32.4%)。与人工肠液孵育后，单个培养菌的荧光强度略有增加(121.9±25.4%)，共培养菌的荧光强度略有下降(89.5±11.0%)。用ZnO NP和ZnCl处理Caco-2单培养细胞后，DCF荧光强度无明显变化gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与溶剂对照比较。相比之下，Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的类似处理导致明显的细胞ROS (ZnO NP < 50 nm时为152.6±24.5%;ZnO NP < 100 nm时为186.6±5.3%;ZnCl为183.3±13.9%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)与肠液溶剂对照进行比较。gydF4y2Ba

通过JC-1染色研究消化氧化锌NP对Caco-2单培养和Caco-2-/HT29-MTX共培养细胞MMP的影响。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)．数据归一化为未经处理的对照组。与未处理对照组相比，阳性对照CCCP导致MMP受损(单一培养中30.7±7.2%;共培养为21.7±2.7%)。与未处理的对照组相比，两个模型用人工肠液处理后的红/绿荧光强度比相似，反映MMP没有变化。用消化后的ZnO NP和ZnCl孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba结果与肠液相似。它们既不增加也不减少单培养和共培养细胞的MMP。gydF4y2Ba

由于其优越的性能，ZnO NP得到了广泛的应用。食品部门是这些重要领域之一，因此ZnO NP可以进入人类食物链[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．不断增加的口服暴露会带来潜在的毒性。此外，消化过程可以改变ZnO NP的物理化学性质，导致其在细胞或生物分子上的不同行为[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．然而，到目前为止，人们对消化过程中ZnO NP的命运以及消化后的ZnO NP对人体胃肠道的影响知之甚少。因此，本研究的目的是在过程中表征两种不同尺寸的ZnO NPgydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba消化和研究它们对两种肠道模型系统的影响。为了接近生理条件，分化的Caco-2细胞被用于单独培养，并与在Transwell系统中生长的产生黏液的HT29-MTX细胞共培养。gydF4y2Ba

对所研究的ZnO NP进行表征对于评价其生物学效应以及更好地与文献数据进行比较至关重要[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．TEM和ICP-OES分析均显示gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba消化后，大部分原始ZnO NP的形态结构发生了变化，其化学成分可能发生了变化。约70%的锌以游离离子形式存在，约30%的锌明显成键。ZnO NP和ZnCl之间只有微小的差异gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba关于游离锌离子和结合锌离子的比例。消化后的ZnO NP与我们已经描述过的原始大棒状颗粒在结构上没有相似之处[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

氧化锌NP后的可比性生物转化gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba消化已经在其他研究中被发现。氧化锌NP溶解过程中gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba消化过程中，锌离子与来自不同消化液的酶和盐的有机化合物络合[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．与我们的研究相反，氧化锌NP完全溶解在胃液中，并有一个gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba肠液中磷酸盐形成颗粒[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．然而，Yu和Choi [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]检查gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba不同粒径ZnO颗粒(< 100 nm和< 5 μ M初级粒径)在大鼠胃液中的溶解度。口服给药后，两种颗粒类型的锌溶解量约为12%。这表明ZnO的溶解性较低，受生物环境的影响比粒径更大，这与我们的结果相当。Chia等研究表明ZnO NP的溶解行为也取决于其涂层性能[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．消化过程是复杂的pH值变化和不同的酶和离子的影响。这甚至会影响不溶性氧化锌NP，使其发生物理化学变化。氧化锌很可能不是以纳米颗粒的形式进入肠道。基于此，我们必须承认，到目前为止，氧化锌NP在细胞系统中的通讯效应并不能真正或只是部分反映氧化锌NP在体内暴露的后果。gydF4y2Ba

第一种方法是用消化氧化锌NP处理Caco-2单培养细胞和Caco-2/HT29-MTX共培养细胞后，研究锌在单分子膜中的吸收和渗透。ICP-MS测定结果表明，ZnO NP浓度越高，锌的细胞含量越高。但基底外侧区室锌含量较低(0.1 ~ 0.4µg/ml)。透射电镜图像显示，细胞成分和细胞器未因锌含量增加而出现异常。gydF4y2Ba

ZnO NP和ZnCl的结果相当gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba处理单细胞和共培养细胞。李等人。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]检测了消化后的ZnO NP对分化的Caco-2细胞的生物利用度。他们分析了顶端和基底外侧隔室的锌含量以及细胞锌含量。锌的生物利用度随ZnO NP用量的增加而增加。与我们的研究相反，他们的培养培养基含有较低的锌含量(0.198-0.665 μ M)比我们的(123-614 μ M)。尽管如此，他们在消化过的ZnO NP处理后检测到细胞变化。Caco-2细胞线粒体中微绒毛较少，液泡较多。细胞脱水，但含有更多的脂肪颗粒，内质网的大小增加。有趣的是，没有溶剂控制来排除肠液引起的影响[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．Moreno-Olivas等人的研究发现，消化后的ZnO NP处理肠道细胞后，也发生了类似的形态学变化。[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．消化氧化锌NP (~ 1190 μ M)处理4 h后，分化的Caco-2/HT29-MTX细胞的刷状边界膜被破坏。较低浓度的ZnO NP (0.12 μ M和11.9 μ M)对单层形貌无影响。为了进行电子显微镜分析，细胞在6孔板中仅生长了两周，在顶端和基底外侧室中没有分裂。已经可以证明，小于21天的分化期导致转运蛋白系统和蛋白表达的代数较低，并且单层的融合性和分化性较差[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．但锌是人体必需的微量元素，主要由小肠内的肠细胞吸收[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．因此，Caco-2单培养细胞和Caco-2/HT29-MTX共培养细胞对锌的吸收增加是一个合理的结果。gydF4y2Ba

基底外侧隔室中锌含量低表明单层的屏障功能完整，这是后来研究的结果。Caco-2单培养和Caco-2/HT29-MTX与消化后的ZnO NP和ZnCl共培养细胞孵育24 h后，TEER、渗透性、细胞骨架和核形态均无变化gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Moreno-Olivas等。[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]发现，与溶剂对照相比，用消化后的ZnO NP (1190 μ M)处理4小时后，Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的TEER值增加，这与锌暴露导致的紧密连接增强有关。较低浓度的ZnO NP (0.12 μ M和11.9 μ M)的TEER值与溶剂对照相似。众所周知，补锌可以改善肠道上皮屏障功能[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．有趣的是，Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的通透性基本高于Caco-2单培养细胞。这可能是由于HT29-MTX共培养模型中的紧密连接不是那么牢固[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．与Caco-2细胞相比，它们表达的紧密连接较少，共培养时亲水化合物的胞旁渗透性更高[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．然而，与溶剂对照相比，消化氧化锌NP处理单一和共培养的细胞并没有导致渗透性增加。gydF4y2Ba

虽然没有细胞形态学改变，但锌的摄取可能导致细胞毒性损伤，这在我们的研究中也有研究。消化氧化锌NP和ZnCl处理对Caco-2单培养细胞和Caco-2/HT29-MTX共培养细胞的代谢活性和线粒体膜电位无影响gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．然而，在与ZnO NP和ZnCl共培养24 h后，细胞内氧化应激的增加导致DCF荧光显著增加gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

李等人。[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]用MTT和乳酸脱氢酶法检测了消化后的ZnO NP对分化的Caco-2细胞的细胞毒作用。用消化过的氧化锌NP(消化物中锌含量为0.198-0.665 μ M)处理后，代谢活性降低了50%，乳酸脱氢酶释放量提高了三倍。ROS水平随浓度增加而增加[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．值得注意的是，在所有的测定中都没有阳性和消化控制，这阻碍了结果的有效性。在Moreno-Olivas等人的研究中[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，经消化氧化锌NP处理4 h后，用钙黄素AM/碘化丙啶对已分化的Caco-2/HT29-MTX共培养细胞进行活/死染色。在ZnO NP最高剂量(1190 μ M)时，死亡细胞数量没有变化，但活细胞数量显著增加。作者对此没有找到合理的解释。他们只是得出结论，细胞死亡更可能是由消化成分引起的，而不是NP [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ROS的产生通常被假定为氧化锌NP诱导毒性的起源[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．例如，这涉及到丙二醛、亚硝酸盐和过氧化氢/羟基自由基的增加，以及谷胱甘肽、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶含量的降低[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．一般来说，锌具有抗氧化作用，缺锌与氧化应激有关[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．然而，锌在细胞氧化/抗氧化平衡中的影响是复杂的[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．在体外研究中，用ZnO NP处理细胞会导致细胞锌稳态的破坏，从而导致ROS和氧化应激的产生[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

研究已经表明，未消化的ZnO NP可以改变各种细胞类型的MMP [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．但据我们所知，这是第一个研究消化氧化锌NP对肠道细胞MMP的影响的研究。总的来说，消化氧化锌NP处理Caco-2单培养细胞和Caco-2/HT29-MTX共培养细胞后，未修饰的MMP在生理相关浓度下保持消化氧化锌NP的无毒性。gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba消化，化学，生物和物理条件的变化取决于pH值的变化和不同酶和盐的参与。氧化锌NP经过转变，其物理化学性质和锌离子释放发生改变，从而改变其生物利用度和对生物体的毒理学行为[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．锌离子可以被配体结合，但锌离子的结合是可逆和动态的[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．有几项体内动物研究，研究了口服氧化锌NP后的毒性。在Liu等人的一项研究中[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，以每kg 2000 mg氧化锌NP喂养小鼠270 d。肠道对ZnO NP的吸收仅为边际;因此，在组织和器官中没有堆积。ZnO NP的结果与我们的结果相似，ZnO颗粒更大，锌离子更大。其他研究也证实了口服生理氧化锌NP浓度后没有动物毒性[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了进一步改善我们所使用的体外肠道模型，共培养的肠道细胞可以与THP-1等免疫细胞互补，从而达到更好的近似gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba的情况。在这种情况下，进一步特别是免疫终点，例如细胞因子或抗氧化标记物的释放，应该包括在内。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba氧化锌NP的消化导致了从口相到肠相的物理化学转变，并具有较高的锌溶解性。用消化过的氧化锌NP处理单个和共培养的细胞会导致锌的剂量依赖性吸收。但内化锌对细胞形态和细胞器无影响，代谢活性和MMP不受影响。TEER、通透性、细胞骨架和细胞核的形态没有改变。总体而言，体外消化的ZnO NP在浓度为123-614 μ M时对分化的Caco-2单培养细胞和Caco-2/HT29-MTX共培养细胞无毒性作用，其完整的单层屏障可防止锌以不受控制的方式到达基底外侧区域。锌很可能不是以纳米颗粒的形式进入肠道，而且可能与其他成分结合，这应该在口服ZnO NP后的影响调查中得到考虑。gydF4y2Ba

材料gydF4y2Ba

阿尔法淀粉酶是CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba∙2 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 4 '，6 ' -二氨基-2-苯吲哚(DAPI)， 2 '，7 ' -二氯荧光素-二乙酸(DCFH-DA)， MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba∙6小时gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO，黏蛋白，牛胆汁，胰酶，多聚甲醛，胃蛋白酶，胰蛋白酶和氧化锌纳米粉(#677450和#544906)购自德国Taufkirchen Sigma-Aldrich Chemie GmbH。Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM)、胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和胰蛋白酶/EDTA来自于德国Aidenbach的pan生物技术有限公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化铵(MTT)、二甲亚砜、异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖、过氧化氢(30%)、硝酸(Suprapur)和triton X-100来自于德国Darmstadt的Merck KGaA。德国。2-((3-氯苯基)肼基)丙腈(CCCP)和氯化锌gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba从美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司采购。尿素，乙二醇四乙酸，KCl, KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， NaCl, NaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba∙2 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO从卡尔罗斯公司购买，卡尔斯鲁厄，德国KG。癸酸和戊二醛购自德国海德堡Serva电泳有限公司，5,5 '，6,6 ' -四氯-1,1 '，3,3 ' -四乙基苯并咪唑基碳氰碘化物(JC-1)购自德国恩佐生命科学有限公司，Lörrach。Phalloidin-iFlour 488试剂采用Abcam plc。英国剑桥。gydF4y2Ba

ZnO NP分散体的制备及体外消化过程gydF4y2Ba

ZnO纳米粉体分散在8.5 g/l NaCl中(ZnO靶浓度为3.34 mg/ml)。分散体被填充在玻璃莲座细胞(RZ2;Bandelin electronic GmbH & Co. KG，柏林，德国)，被淹没在冰浴中以避免产生热量。将超声均质器(Bandelin Sonopuls HD 2070)插入分散体1厘米深处。以720 J/ml的临界超声能量对NP进行1小时的超声处理，以打破NP团聚体和聚集体。体外消化按照DIN 19738进行[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]和斯坦因等人。[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．用合成唾液(8.5 g/l NaCl, 41.55 U α-淀粉酶)进一步稀释超声分散物，得到15 ml三种不同浓度的ZnO NP(3.34、1.67和0.67 mg/ml)。另外添加脱脂奶粉作为食物基质。为了模拟口腔消化阶段，将所有样品置于摇晃水浴(GFL Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel, Germany)中，在37°C和120 rpm下浸泡5分钟。然后，加入35 ml胃液(0.7 g/l KCl, 0.27 g/l KH)模拟胃相gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 2.9 g/l NaCl, 3 g/l黏蛋白，1 g/l胃蛋白酶，pH 2)。再次将样品置于37℃、120 rpm的震荡水浴中2 h。随后，加入50 ml肠液(0.5 g/l氯化钙)模拟肠相gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba∙2 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.3 g/l KCl, 0.2 g/l MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba∙6小时gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 1克/升NaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba9 g/l牛胆，0.3 g/l尿素，9 g/l胰酶，0.3 g/l胰蛋白酶，pH 7.5)。所有样品在37°C和120 rpm的震动水浴中放置3小时。对于细胞培养实验，最后将消化后的分散液与细胞培养基1:10混合，以获得10、25和50µg/ml(相当于123、307和614µM)的浓度。gydF4y2Ba

消化后ZnO NP分散体的表征gydF4y2Ba

采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定肠液中游离锌离子和结合锌的含量。为此目的，消化分散液在5250×下离心60分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba(爱兰歌娜X-15R;Beckman Coulter GmbH, Krefeld，德国)。上清液转移到新的容器中。沉淀物在95°C下干燥6小时，直到质量恒定。用额外纯硝酸按1:10的比例进一步稀释和酸化上清液。沉淀物悬浮在1ml 65%额外纯硝酸和0.5 ml过氧化氢中，并置于超声浴中(Transsonic 460/H;Elma Schmidbauer GmbH, Singen, Germany)在50°C下放置30分钟。沉淀物用超纯水填充至50毫升。将稀释的钇溶液作为内标元素加入所有样品。采用ICP-OES (iCAP™7000，配备CETAC ASX-520自动采样器，均来自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞雪科学公司)，使用206.2和334.502 nm两种不同波长测量上清液和沉淀物中的总锌含量。质检样品2个(QC; certified reference material) within the concentration range of the analytical results were chosen and measured regularly after about 20 samples. The minimum number as well as the acceptance criteria for evaluating the QC are in accordance with the Food and Drug Administration guidelines [50gydF4y2Ba］．定量限度的计算符合DIN 32645 [gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]为0.3±0.1 mg/l。不确定度的测量是根据DIN ISO 11352:2013-03用两种经认证的参考物质确定的[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba为2.3%。数据处理和质量管理由内部开发的程序(来自化学分析，德国环境署，巴德埃尔斯特，德国)和Qtegra™(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)进行。gydF4y2Ba

此外，研究了ZnO NP过程中的命运gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba透射电镜观察消化过程。在每个消化步骤后，取样品，每个样品4µl放置在formvar碳膜400目网格上(Quantifoil Micro Tools GmbH, Großlöbichau，德国)。使用蔡司CEM 902 a电子显微镜(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)对样品进行干燥和分析。使用广角双速2 k - ccd相机(TRS, Moorenweis, Germany)获取图像。gydF4y2Ba

细胞培养和ZnO NP处理gydF4y2Ba

考虑到肠细胞和杯状细胞代表两种主要的肠道细胞类型，采用单培养和共培养条件来模拟人类肠道[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．人类上皮细胞系Caco-2起源于结肠癌，通常被用作肠屏障的模型。Caco-2细胞表现出分化能力，因此，它们在形态和功能上与小肠中的吸收性肠细胞相似。它们形成了具有刷状边界的特征性极化，其中包含肠细胞特异性酶和细胞-细胞接触[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．此外，还使用了人结肠腺癌细胞系HT29。HT29细胞具有成熟肠细胞的特征，因此可用于研究食物消化和生物利用度。它们还可以分化以获得其他形态和功能特性。在细胞培养基中加入甲氨蝶呤(MTX)诱导HT29-MTX细胞分化。它们类似于小肠的杯状细胞，能够产生粘液[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Caco-2和HT29-MTX细胞在添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养，培养箱温度37°C、湿度95%、CO 5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba；赛默飞世尔科技有限公司，美国)。每隔一段时间，对细胞进行支原体污染检测。两种细胞系均经短串联重复分析验证。在所有实验中，细胞都被种在12孔板(孔径为3 μm;Greiner Bio-One International GmbH，德国)。Caco-2细胞用于单培养，也用于与HT29-MTX细胞共培养(比例为3:1;共3.3 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba每孔细胞)。细胞培养23天，以获得分化稳定的单培养和共培养。细胞培养基每2-3天更换一次。用123-614 μ M消化后的ZnO NP分散在细胞培养基中处理分化的细胞。浓度的选择基于Sohal等人的研究。[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．他们计算了生理相关性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba剂量取决于人体对NP的每日摄入量。没有关于每日氧化锌NP摄入量的信息。然而,TiOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba适用于可比领域，特别是在食品部门。因此，假定TiOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和ZnO NP的摄取量相似(5.4 mg/kg体重/天)。这将导致一个估计gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba剂量约246 μ M [gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．氯化锌作为游离锌离子的来源，在等摩尔浓度下应用于氧化锌。以细胞培养基为未处理对照组。溶剂对照为用细胞培养基(1:10)稀释的肠液，以排除溶剂可能造成的影响。阳性对照采用0.1% triton X-100，根尖侧10 mM EGTA，底侧10 mM EGTA稀释细胞培养基。gydF4y2Ba

锌的定量gydF4y2Ba

采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)研究了消化后ZnO NP在单分子膜中的吸收和渗透。为了检测细胞中锌的含量，在ZnO NP暴露24小时后采集细胞。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞，胰酶/EDTA在37°C下添加5分钟。然后，加入含10% FBS的DMEM，清洗Transwell插入物，直至细胞分离。分离细胞在600xg下离心5 min;离心机5810 r;Eppendorf AG，汉堡，德国)。去除上清液，用PBS冲洗细胞。使用CASY TT (OLS OMNI Life Science GmbH & Co. KG, Bremen, Germany)测定细胞活力和数量，再次离心(600× 5 min)gydF4y2BaggydF4y2Ba)．用65%的额外纯硝酸稀释细胞颗粒，并在夜间消化。为了支持细胞消化，将样品置于超声浴中(Transsonic 310/H;Elma Schmidbauer GmbH, Singen, Germany)在50°C下放置1小时。随后，用纯净水将样品稀释至2%硝酸。离子锌含量的测量使用ICP-MS iCAP™RQ(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)，配备4DX prepFAST自动进样器(ESI元素服务和仪器公司，美因茨，德国)。测定了质量信号m/z = 66，对应于质量为66amu的锌同位素。铑作为内标，在2%硝酸中浓度为2ppb。连续加入样品，同时定量。在测量范围内选择3个QC，在20个左右样品后定期测量。 The minimum number and acceptance criteria for evaluating the QC were in agreement with the FDA guidelines [50gydF4y2Ba］．定量极限按DIN 32645计算[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]为0.3±0.3µg/l，测量不确定度按DIN ISO 11352:2013-03计算[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]，其中三种认证参考物质为6.9%。数据处理使用内部开发的程序(来自化学分析，德国环境署，巴德埃尔斯特，德国)进行质量管理，以及Qtegra™(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)。gydF4y2Ba

此外，还测定了锌通过单层的渗透，这可以间接地得出细胞锌摄取的结论。在单独培养和共培养细胞处理前，在根尖和基底外侧隔室处理后，测量孵育分散。所有样品均用超纯硝酸酸化，在相同条件下测定离子锌总含量。定量限为1.4±0.7µg/l。gydF4y2Ba

透射电镜评价gydF4y2Ba

利用透射电镜研究消化后的ZnO NP对细胞可能产生的影响。为此，用614 μ M ZnO NP和ZnCl处理细胞gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba24小时后，用PBS清洗细胞两次，以去除细胞表面的NP残留。初次固定时，在室温下加入2.5%戊二醛1小时。用碳酸酯酸钠盐缓冲液(100 mM, pH 7.2)洗涤细胞两次15分钟。最后，切除Transwell插入膜，并按上述方法进一步处理[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

屏障完整性调查gydF4y2Ba

采用不同的方法研究了ZnO NP对单层屏障完整性的影响。通过测量经上皮电阻(TEER)，可以得出上皮单层内单层完整性、紧密连接完整性以及细胞旁通路离子电导的结论[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．利用筷子电极和上皮伏/欧姆计(EVOM2;世界精密仪器有限公司，弗里德伯格，德国)。gydF4y2Ba

此外，利用fitc -葡聚糖研究了ZnO NP处理后单层渗透性的变化。右旋糖酐将通过单分子膜通过细胞运输，这取决于其渗透性。由于连接的FITC标记物，右旋糖酐可以通过光度法定量。氧化锌NP暴露24 h后，用无酚红的DMEM在根尖和基底外侧隔室中孵育10 min，对细胞进行清洗。再次去除DMEM，在根尖侧加500 μ l 1 mg/ml FITC-dextran，在基底侧室加1000 μ l无酚红DMEM。细胞在37°C下在摇轨器上孵育6小时。30分钟、60分钟和6小时后，将基底外侧DMEM一式三份移液到96孔板上。荧光测量用微孔板阅读器(激发:485 nm，发射:528 nm;协同2;BioTek Instruments, Inc.， Bad Friedrichshall, Germany)， fitc -葡聚糖浓度使用标准系列(0.001-1000µg/ml)计算。gydF4y2Ba

用phalloidin-iFluor 488和DAPI染色观察ZnO NP处理后细胞的形态变化，观察细胞骨架和细胞核中的肌动蛋白丝。为此，用消化后的ZnO NP和ZnCl处理单培养和共培养的细胞gydF4y2Ba_2gydF4y2BaPBS洗涤两步后，用4%多聚甲醛固定20分钟。再次洗涤，用0.1% triton-X 100渗透10分钟。再次洗涤，用0.1µg/ml DAPI和0.1% phalloidin-iFluor 488染色1小时。为了分析样品，切除Transwell插入膜，转移到显微镜载玻片上。使用激光扫描显微镜进行评估(激发:488 nm，发射:DAPI为445 nm, phalloidin-iFluor 488为525 nm;LSM 780;卡尔蔡司公司)。gydF4y2Ba

细胞毒性检测gydF4y2Ba

通过不同的研究评估了消化后的ZnO NP的潜在细胞毒作用。为了确定细胞代谢活性，MTT试验作为一种公认和常见的细胞毒性试验被使用[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．用ZnO NP处理24 h后，除去细胞培养基，将0.5 mg/ml MTT加入根尖和基底外侧隔室(原液:50 mg MTT粉加入10 ml PBS;DMEM稀释的工作溶液)。细胞在37°C下孵育2 h。去除MTT，在根尖和底外侧隔室中加入二甲亚砜(≥99.8%)使得到的甲马甲溶解，将平板放在摇轨器上10分钟。最后，将根尖和底外侧二甲亚砜混合，将样品一式三份放置在96孔透明板上。在570 nm处使用微孔板阅读器测量吸光度(参考波长:630 nm;协同2;BioTek仪器公司，德国)。gydF4y2Ba

采用DCFH-DA法检测ROS。用消化过的氧化锌NP培养24小时后，按上述方法收集细胞。细胞在600×下离心5 mingydF4y2BaggydF4y2Ba)，细胞球与1µM DCFH-DA混合。细胞在37°C下孵育30分钟。DCFH-DA处理后，以过氧化氢(5 mM, 30 min)为阳性对照。采用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany)测量1 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba每个样品的活细胞(激发:488 nm，发射:525 nm)。数据处理使用CytExpert软件(Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany)进行。gydF4y2Ba

采用膜渗透JC-1染料对MMP进行了研究。在消化过的ZnO NP中浸泡24小时后，按照上述方法收集细胞。细胞在600×下离心5 mingydF4y2BaggydF4y2Ba)，去除上清液。阳性对照用100µM CCCP孵育5分钟。所有样品用8µM JC-1在37℃下处理15分钟。PBS冲洗细胞后，1 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany)测量每个样品的活细胞。激发波长为488 nm。使用两种不同的波长测量发射，以区分JC-1单体(525 nm)和聚集物(585 nm)。MMP由单体和聚集体的比例得出，使用CytExpert软件(Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany)进行评估。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

每个实验至少进行三个独立实验。IBM SPSS统计(版本26;IBM公司，Armonk, NY, USA)用于数据处理。为检测显著性差异，采用Ryan-Einot-Gabriel-Welsh事后检验或非配对t检验进行单向方差分析。这些数字是使用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)生成的。图中显示的结果代表平均值和标准差。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

由Projekt DEAL启动和组织的开放获取资金。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 德国耶拿弗里德里希·席勒大学营养科学研究所应用营养毒理学研究室gydF4y2Ba

   安娜·米塔格，阿丽娜·辛格和迈克尔·格雷gydF4y2Ba

2. 游泳和沐浴池水，化学分析，德国环境署，巴德埃尔斯特，德国gydF4y2Ba

   克里斯蒂安·霍拉和亚历山大KämpfegydF4y2Ba

3. 德国耶拿弗里德里希·席勒大学医院电子显微镜中心gydF4y2Ba

   马丁·韦斯gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

概念化:AM, MG;方法:AM, CH, MW, AK, MG;形式分析与调查:AM, AS, CH, MW;写作-初稿准备:AM;写作-审稿及编辑:AM, AS, CH, MW, AK, MG;资金获取及资源:MW、AK、MG;监督:MG。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba安娜MittaggydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba