表征接触纳米材料对人类健康的潜在影响的原则:筛选战略的要素

许多不同的工程纳米材料(定义为设计和生产的材料具有至少一个维度为100纳米或更小的结构特征)的快速增殖给监管机构在危害识别方面带来了困境。国际生命科学研究所研究基金会/风险科学研究所召集了一个专家工作组，以制定工程纳米材料危害识别的筛选策略。工作组报告提出了元素一个筛选策略而不是一个详细的测试方案。在对现有有限数据进行评估的基础上，本报告提出了适用于纳米材料风险评估过程开发早期阶段的广泛数据收集策略。包括口服、皮肤、吸入和注射接触途径，认识到根据使用模式，可能通过任何这些途径接触纳米材料。毒性筛选策略的三个关键要素是:物理化学特征，在体外分析(细胞和非细胞)，和在活的有机体内化验。

纳米颗粒的生物活性很可能取决于毒性筛选研究中没有常规考虑的物理化学参数。物理化学性质对理解测试材料的毒性作用可能很重要，包括粒度和粒度分布、团聚状态、形状、晶体结构、化学成分、表面积、表面化学、表面电荷和孔隙率。

在体外技术允许在受控条件下分离和测试特定的生物和机械途径，以在现实生活中不可行的方式在活的有机体内测试。建议对肺、皮肤和粘膜进行入口毒性测试，对内皮、血液、脾脏、肝脏、神经系统、心脏和肾脏进行靶器官毒性测试。纳米颗粒耐久性、蛋白质相互作用、补体活化和促氧化活性的非细胞评估也被考虑在内。

一级在活的有机体内建议对肺部暴露、口腔暴露、皮肤暴露和注射暴露进行测定，还建议对肺部暴露进行第2级评估。第1级评估包括炎症标志物、氧化应激和细胞增殖在入口和选定的远端器官和组织。肺部暴露的第2级评估可包括沉积、易位、毒物动力学和生物持久性研究;多次暴露的影响;对生殖系统、胎盘和胎儿的潜在影响;替代动物模型;以及机械研究。

许多不同的工程纳米材料的迅速增殖给监管机构在危害识别方面带来了困境。由国际生命科学研究所研究基金会/风险科学研究所(ILSI RF/RSI)纳米材料毒性筛选工作组制定的筛选策略，旨在为纳米材料风险评估的初始危害识别过程做出重大贡献。

工程纳米材料通常被定义为设计和生产的材料，其结构特征至少有一个维度为100纳米或更小。这些材料通常具有纳米结构相关的特性(例如，化学、机械、电气、光学、磁性、生物)，这使它们成为商业或医疗应用的理想材料。然而，这些相同的性质可能会导致依赖于纳米结构的生物活性，这与组成化学物质和化合物的本体性质不同，也不能直接预测。本报告概述了作为风险评估过程中第一步(即危害识别)的纳米材料毒理学筛选策略的要素。这两个在体外而且在活的有机体内在制定筛选策略时考虑了方法学。

工程纳米材料包括多种形式，并来源于许多散装物质。纳米颗粒是许多工程纳米材料的基础，目前正在生产各种类型的纳米材料，用于各种应用;富勒烯(C₆₀或巴基球)，碳纳米管(CNT)，金属和金属氧化物颗粒，聚合物纳米颗粒和量子点是最常见的。

工程纳米材料为提高传统产品的性能和开发独特的新产品提供了新的机会。“创造不同寻常的纳米结构的能力，如束、片和管，为新的强大的药物输送系统、电子电路、催化剂和光收集材料带来了希望。”［1］

目前的许多工作主要集中在使用相对简单的纳米结构材料，如金属氧化物纳米颗粒和碳纳米管，用于高性能材料、能量存储和转换、自清洁表面涂层和耐污纺织品等应用。对更复杂纳米材料的研究预计将导致细胞级医疗诊断和治疗以及先进电子学等应用。然而，由于纳米技术模糊了科学学科之间传统上严格的界限，预计在未来几年和几十年里，意想不到的应用将迅速增长。

随着新的基于纳米技术的材料开始出现，建立一个评估其潜在毒性的框架将是至关重要的，特别是因为指标表明，传统的筛选方法可能对这些材料的纳米结构相关生物活性没有反应。

一些国家和国际组织目前正在制定纳米材料科学评论术语的标准定义，包括国际纳米技术协会的命名法和术语小组委员会和美国国家标准协会纳米技术标准小组(ANSI-NSP)。本文档使用了以下关键定义。

1.纳米颗粒

一种至少一个维度小于100纳米的粒子，包括工程纳米粒子、环境超细粒子(UFPs)和生物纳米粒子。

2.设计/制造的纳米颗粒

纳米粒子:由人类在纳米尺度上设计或制造的粒子，具有特定的物理化学成分和结构，以利用与其尺寸相关的特性和功能工程纳米颗粒包括具有均匀组成和结构的颗粒、成分和结构上不均匀的颗粒(例如，具有核壳结构的颗粒)和多功能纳米颗粒(例如，正在开发用于医疗诊断和治疗的“智能”纳米颗粒)。

3.纳米材料

具有比一般原子/分子尺寸大但小于100纳米(纳米结构)的物理化学结构的材料，其表现出与其纳米结构相关的物理、化学和/或生物特性。

4.纳米粒子

一种物理化学结构大于原子/分子尺寸但小于100纳米的粒子，表现出与其纳米结构相关的物理、化学和/或生物特征。纳米结构的粒子可能比100纳米大得多。例如，TiO的结块₂直径明显大于100纳米的纳米颗粒可能具有由其纳米级子结构决定的生物活性。其他例子包括沸石、介孔材料和多功能微粒探针。

5.集块岩/总

术语“聚集”和“聚合”在不同领域使用不同，甚至可以互换。在本报告的背景下，术语“团聚体”专门用于描述由弱力和强力(包括范德华力和静电力)和烧结键结合在一起的粒子集合。在本文档中，该术语与“aggregate”可互换使用。然而，人们注意到，理解团聚体的结合力如何影响不同条件下组成颗粒的分散性的重要性-本质上是团聚体脱团聚的难易程度。

6.纳米多孔材料

颗粒大于100纳米的材料可能在纳米尺度上具有显著的结构，从而提供基于这种较小结构的特性，可能与毒理学相关(例如，与本体相比，表面积显著增加)。纳米多孔材料，如沸石，是一类重要的材料，其孔隙率在100纳米以下的尺寸范围内，但其主要颗粒可能很大。

ILSI RSI纳米材料毒性筛选工作组于2005年2月召开，其目标是确定工程纳米材料毒性筛选策略的关键要素。该小组考虑了通过吸入、皮肤、口服和注射途径暴露于纳米材料的潜在影响;讨论了纳米颗粒的毒性机制可能与相同化学物质的较大颗粒所表现出的毒性有何不同;并确定了设计强有力的筛查策略所需的重要数据。

纳米材料毒性筛选工作组提出的纳米材料筛选策略的要素包括对物理化学特性和剂量指标的评估;非细胞化验;在体外肺、皮肤和粘膜检测;而且在活的有机体内用于肺，皮肤，口服和注射暴露。

该项目由美国环境保护署污染预防和有毒物质办公室通过与ILSI研究基金会/风险科学研究所的合作协议资助。这是在同一合作协议下的另一个项目的产物，该项目提出了纤维短期毒性测试的策略[2］．后一个项目的主要结论包括纤维的物理化学特性的重要性，亚慢性(1-3个月)大鼠吸入暴露研究的价值，以及吸入纤维在肺中的生物持久性和导致细胞增殖和间质纤维化的慢性炎症的纤维毒性的典型关键作用。

随着越来越多的纳米材料和产品被开发并投入商业使用，与纳米材料和超细颗粒相关的对人类和生态的潜在毒性是一个日益增长的研究领域。迄今为止，很少有纳米毒理学研究涉及纳米材料在各种生物和环境中的影响。然而，现有的研究引起了人们对纳米材料安全性的一些担忧，并导致人们对研究纳米材料毒性以用于风险评估和保护人类健康和环境的兴趣增加。一个新的纳米毒理学领域已被开发出来，以研究由于暴露于纳米材料而产生有害影响的可能性[3.］．纳米毒理学还包括毒性研究中使用的纳米材料的正确表征。表征对于区分天然存在的纳米材料形式、自然或化学过程的纳米级副产物和人造(工程)纳米材料非常重要。由于纳米材料之间的性质差异很大，每一种类型的纳米颗粒都能引起自己独特的生物或生态反应。因此，必须对不同类型的纳米材料进行分类、表征和单独研究，尽管基于小尺寸的某些纳米毒理学概念可能适用于所有纳米材料。

当材料达到纳米级时，它们通常不再表现出与本体化合物相同的反应活性。例如，即使是传统的惰性体化合物，如金，当它作为纳米材料引入时，也可能引起生物反应[4］．随着纳米材料和产品制造的增加，因此，纳米材料的暴露增加，为了提供安全的工作场所、产品和环境，必须采用新的测试方法和对当前材料的新思维方式。不同的接触途径，包括吸入、皮肤摄取、摄入和注射，可呈现独特的毒理学结果，这些毒理学结果随所述纳米颗粒的物理化学性质而变化。

研究纳米颗粒毒性的最早研究集中在人类和环境相关物种在大气中暴露于环境产生的超细颗粒物质(直径<100纳米)的异质混合物。这些研究检查了与目标生物呼吸道中颗粒物沉积相关的肺毒性[5- - - - - -15］．城市空气污染暴露影响的流行病学评估侧重于燃烧事件的副产物产生的颗粒物，如汽车尾气和其他城市空气污染源，结果显示，在测试人群中，发病率和死亡率与颗粒物数量之间存在联系[16- - - - - -19］．一些研究人员发现，儿童和成人患哮喘的风险增加与城市空气中超细颗粒物的环境暴露有关[20.- - - - - -22］．然而，其他研究并没有显示出同样的相关性[23- - - - - -25］．

基于实验室的研究已经调查了大范围超细材料通过的影响在活的有机体内使用各种动物模型以及基于细胞培养的暴露在体外实验。迄今为止，动物研究常规显示，呼吸暴露于吸入或植入的超细颗粒物后，肺部炎症、氧化应激和远端器官受累增加[7，11，26- - - - - -30.］．组织和细胞培养分析也支持在整个动物模型中看到的生理反应，并得出数据表明，暴露于超细颗粒后，氧化应激、炎症细胞因子产生和细胞凋亡的发生率增加[31- - - - - -37］．这些研究还提供了基因表达和细胞信号通路的信息，这些信号通路在暴露于各种超细颗粒物种(从碳基燃烧产物到过渡金属)时被激活。室内空气污染中的聚四氟乙烯烟雾是纳米大小的颗粒，对大鼠有剧毒[38］．它们在低吸入颗粒质量浓度时引发严重的炎症反应，提示氧化损伤[39- - - - - -41］．

与燃烧或摩擦产生的非均质超细材料相反，人造纳米材料可以以所需尺寸和形状的高度同质形式合成(例如，球体、纤维、管、环、平面)。对人造纳米材料的有限研究已经调查了材料的大小、形状和剂量与其生物效应之间的相互关系，以及在生物模型中是否可以观察到这些不同特性的独特毒理学特征。

通常，颗粒的生物活性随着颗粒大小的减小而增加。更小的粒子所占体积更小，导致粒子数量更多，单位质量的表面积更大，生物相互作用的潜力也更大[42- - - - - -46］．最近的研究已经开始将各种纳米材料在生态系统和哺乳动物系统中引起的生物反应进行分类。尽管目前大多数研究都集中在纳米材料在哺乳动物系统中的作用，但最近的一些研究表明，纳米材料在生态系统中引发植物毒性反应的潜力。氧化铝纳米颗粒是美国纳米材料市场的领导者之一，99.6%纯度的平均粒径为13纳米的纳米颗粒被证明对五种植物的根系生长有抑制作用[46］．

纤维状和管状纳米结构的毒理学研究表明，在极高剂量下，这些材料与纤维化肺反应有关，并导致炎症和致癌风险增加。单壁碳纳米管(SWCNT)在细胞培养中通过诱导细胞凋亡和降低细胞粘附能力来抑制肾细胞增殖。此外，它们在注入时会引起肺部发炎[26，33，47- - - - - -49］．多壁碳纳米管(MWCNT)在吸入后持续存在于肺深部，一旦存在，就能够诱导炎症和纤维化反应[47］．

皮肤暴露于MWCNT已通过细胞培养建模，并指出纳米颗粒在目标上皮细胞内定位并启动刺激反应的能力[50］．在暴露于MWCNT的人表皮角质形成细胞中进行的蛋白质组学分析显示，相对于对照组，许多蛋白质的表达均增加或减少。这些蛋白改变提示中间丝表达异常、细胞周期抑制、囊泡转运/胞吐改变和膜支架蛋白下调[50，51］．此外，对暴露于SWCNT的人表皮角质形成细胞进行了基因表达谱分析，显示出与α -石英或二氧化硅相似的谱图。此外，结构蛋白和细胞因子家族中先前与这些颗粒不相关的基因也显著表达[52］．角化细胞和支气管上皮细胞的剂量在体外已被证明会导致氧化应激标志物的增加[50，53，54］．

碳纳米颗粒的电荷特性和影响血脑屏障完整性的能力以及在大脑内表现出的化学作用也得到了研究。纳米颗粒可以克服大脑的物理和静电障碍。此外，高浓度的阴离子纳米颗粒和阳离子纳米颗粒能够破坏血脑屏障的完整性。低浓度阴离子纳米颗粒的脑摄取率高于相同浓度的中性或阳离子配方。这项工作表明，中性纳米颗粒和低浓度阴离子纳米颗粒可以作为载体分子，使化学物质直接进入大脑，而阳离子纳米颗粒对血脑屏障具有立即的毒性作用[55，56］．

用无涂层、水溶性、胶体C进行试验₆₀富勒烯已经表明，氧化还原活性的亲脂性碳纳米颗粒能够在水生物种的大脑中产生氧化损伤[55］．C₆₀在这些实验中还观察到富勒烯。富勒烯的这一特性可能具有生态影响，目前正将其作为新型抗菌剂的潜在来源进行探索[57- - - - - -59］．

氧化应激作为纳米和超细颗粒诱导细胞损伤的常见机制已得到充分证明;富勒烯是产生超氧化物的模型化合物。广泛的纳米材料种类已被证明可以产生活性氧在活的有机体内而且在体外．已被证明能诱导自由基损伤的物种包括C₆₀富勒烯、量子点和碳纳米管[30.，60- - - - - -66］．不同大小和化学成分的纳米颗粒能够优先定位于线粒体，在那里它们会诱导主要的结构损伤，并有助于氧化应激[65］．

量子点(QDs)如CdSe QDs已被引入作为新的荧光团用于生物成像。当与抗体结合时，由于其明亮的光稳定性荧光，它们被用于免疫染色。

迄今为止，文献中还没有对量子点的毒性进行充分的分析，但目前的一些研究指出了将这些纳米材料引入生物系统时值得关注的问题。最近发表的研究表明，生物成像中使用的量子点在一定浓度范围内有可能降低细胞活力，甚至导致细胞死亡，因此迫切需要进一步的毒理学评估[67，68］．虽然众所周知，块状硒化镉(CdSe)具有细胞毒性，但也有人认为CdSe量子点具有细胞相容性，可安全用于全动物研究。这一假设部分基于量子点CdSe核心周围保护基团的使用。这些涂层已被证明具有保护作用，但其长期稳定性尚未得到彻底评估。最近的研究探索了原代肝细胞中cdse核心量子点作为肝脏模型的细胞毒性，发现这些量子点在某些条件下具有急性毒性。细胞毒性与游离Cd的释放有关^{2 +}离子由于CdSe晶格的恶化。这些数据表明，量子点最初可以被制成无毒的在活的有机体内涂上适当涂层后使用。然而，该研究也强调了进一步探索所使用涂料的长期稳定性的必要性在活的有机体内并且暴露在环境条件下[69］．

为了得出关于人造纳米材料和超细颗粒的影响的结论而采用的各种途径和方法导致了不同的结果。这种不一致性表明需要进行标准化测试，以便在筛选纳米材料的潜在不利影响方面获得可比结果。随着纳米毒理学领域的不断发展，标准毒理学测试将帮助那些进入该领域的人，并允许在确定纳米材料的毒性作用方面进行更好的比较和得出结论。

虽然许多工程纳米材料依赖于纳米结构的特性可能使它们属于潜在危害的类别，但它们对人类健康的直接风险将取决于发生接触的概率，以及进入人体的材料在多大程度上表现出与其纳米结构相关的行为。数字1［70];纳米颗粒生物动力学研究;虽然许多摄取和转运途径已经被证明，但其他仍是假设的，需要进行研究。主要未知的是易位率以及关键目标地点的积累和保留及其潜在机制。这些以及潜在的不利影响将在很大程度上取决于纳米颗粒表面和核心的物理化学特征。还需要考虑疾病或受损生物体中纳米颗粒生物动力学的定性和定量变化。

在许多情况下，纳米结构材料将成为纳米复合材料、表面涂层和电子电路等大规模产品的组件，直接暴露的可能性将可以忽略不计。然而，如果纳米结构材料可能进入人体，则需要采用毒性筛选策略来确定它们所呈现的潜在风险。

纳米颗粒是工程纳米材料的一种明显形式，具有显著的暴露潜力，因为它们很容易沉积在肺部或皮肤上，并可能在体内转移。然而，直径从几百纳米到几微米的纳米颗粒也可能被吸入、摄入或沉积在皮肤上，并可能表现出与其纳米结构相关的毒性。同样，可以想象，直径在几微米及以下的纳米结构颗粒(如纳米复合材料或纳米结构表面涂层的碎片)可能表现出依赖于纳米结构的生物特性。在每一种情况下，空气和液体悬浮液或泥浆中的材料都存在接触的可能性。

在本节中，毒性筛选策略的三个关键方面将被解决:纳米材料的表征，在体外筛选策略及在活的有机体内筛查策略(包括吸入、皮肤接触、摄入和注射接触途径)。筛选策略是围绕纳米颗粒开发的，但与所有能够通过吸入、摄入、皮肤穿透或注射进入人体并表达与其纳米结构相关的生物活性的工程纳米材料相关。

4.1理化表征

以下4.4.1介绍

与气体、液体和许多固体材料不同，工程纳米材料的理想性能密切依赖于纳米尺度上的尺寸、形状和结构(物理和化学)。同样，生物活性很可能取决于毒性筛选研究中通常不考虑的物理化学参数。尽管对工程纳米材料的定量毒性研究仍然相对稀少，但已经发表了关于富勒烯、单壁碳纳米管、纳米级金属氧化物如TiO的数据₂而纳米直径的低溶解度颗粒，支持了在评估潜在生物活性时仔细考虑纳米材料如何表征的需要[62，71- - - - - -75］．可呼吸纤维可能是最接近于一种不完全以质量和化学成分为特征的材料。然而，纳米材料的多样性和复杂性表明，适合毒性筛选试验的表征水平将相应地更加复杂。

在更充分地了解纳米材料特性与毒性之间的机制联系之前，有必要确保在毒性筛选试验中测量或推导出所有可能具有重要意义的纳米材料特性。特别是，在可能的情况下;我们希望收集足够的信息，以便根据新的发现对毒性数据进行回顾性解释。在这种情况下，确定一套表征标准的纳米材料毒性筛选提出了一个重大的挑战。显然，描述测试材料的每一个可能方面的理想，虽然值得称赞，但是不切实际的。因此，在本文档中，我们将重点放在发生特征描述的上下文以及我们认为在该上下文中必不可少的特征描述参数的最小集。基本参数已被补充为那些被认为是可取的和那些被认为是感兴趣的但在筛选研究中可选的参数。讨论的两个主要特征背景是人体暴露研究和在体外/在活的有机体内研究。在后者的情况下，我们考虑给药后的材料特性、给药时的特性以及生产或供应的散装材料的特性。还讨论了在吸入暴露过程中根据不同的物理指标描述剂量的相对重要性。随后就纳米材料毒性筛选试验的物理化学表征和能够提供所推荐信息的表征方法提出了建议。

4.1.2材料表征框架

毒性筛选研究的材料表征在正在进行的研究中是最适当的考虑。要求在体外而且在活的有机体内筛选研究将根据材料输送路线或方法而有所不同。此外，在开展适当筛查研究的背景下了解人类接触将提出进一步的特征描述要求。提出了四个筛选研究背景，并在这些背景下提出了特征描述建议:

• 人体暴露特征

• 给药后材料的特性

• 给药材料的特性

• 生产或供应材料的特性

人体暴露特征

在已知会发生或预计会发生接触特定物质的情况下，在制定和选择适当的毒性筛选试验时，需要进行接触研究。目前工程纳米材料主要处于研究或预生产阶段，已知发生暴露的环境相对较少。然而，如果使用纳米材料的产品的商业化如预期的那样发展，那么在未来十年，暴露的可能性可能会急剧增加。因此，在开发毒性筛查时应考虑对未来使用和潜在的人类接触的估计。

给药后纳米材料的表征

在测试系统或模型中对给药后交付的纳米材料进行表征，可提供与观察到的反应相关的剂量和材料特性的最高质量数据，但这受到当前方法能力的限制。在给药前后材料可能发生物理化学变化的情况下，给药后的特性描述尤其有利。潜在变化的例子包括聚集状态，生物分子的物理吸附或化学吸附和生物化学诱导的表面化学变化。此外，由于纳米材料与周围生物系统的相互作用，例如纳米材料的水溶性或脂溶性部分的快速溶解，因此可能发生的物理化学变化需要仔细考虑。虽然在给药后进行特性描述被认为是一种理想的工作，但人们认识到，在许多情况下，在给药时进行特性描述将是一种更现实和可行的选择。人们还认识到，在许多情况下，无论给药后是否进行定性，给药时的定性对研究的相互比较都是必不可少的。

给药材料的表征

毒性筛选研究中给药材料的特性是基本的。这种方法解决了大块材料和被管理材料之间潜在的物理化学变化(如团聚状态)，并允许在材料和观察到的响应之间建立更强大的因果关系。然而，鉴于许多纳米材料的性质对其局部环境具有很强的敏感性，应该指出，在某些情况下，纳米材料在给药和沉积之间的物理化学性质的生物相关变化可能对观察到的反应产生重大影响。

生产或供应材料的特性

在生产或供应时对纳米材料进行表征是获得物理化学信息的最直接方法，并可提供被测材料的有用基线数据。大多数工程纳米材料都具有基于其物理化学性质的功能。因此，在许多情况下，可能会从供应商或生产商那里获得与毒性筛选研究相关的信息。然而，由于目前缺乏公认的纳米材料表征标准，强烈建议在可能的情况下对测试纳米材料进行独立表征。

所提供的纳米材料的特性可能不能恰当地代表材料在给药期间或之后的物理化学性质。因此，不鼓励完全依赖这种方法，仅建议在给药期间或给药后对材料进行表征明显不可行的情况下使用。

4.1.3关键特性

以前对石棉和其他纤维的研究表明，纤维颗粒的尺寸、耐久性和剂量(三个D)是其致病性的关键参数。一般来说，直径较小的纤维会深入肺部。长纤维(比肺泡巨噬细胞直径还长)刺激巨噬细胞释放炎症介质，只会被缓慢清除。除了纤维长度外，化学因素对纤维的耐用性和生物持久性起着重要作用;高碱土氧化物含量和低铝含量的纤维₂O_3.、铁₂O_3., TiO₂往往具有较低的持久性，因此生物持久性较低[76］．另一方面，对矿物颗粒的研究表明，在某些情况下，其毒性和致癌性与吸入颗粒的表面积及其表面活性有关[77，78］．颗粒表面特征被认为是石英(结晶二氧化硅)产生自由基和活性氧以及发生纤维化和癌症的关键因素[77］．

纳米材料的不同寻常的性质主要与它们的纳米级结构、尺寸和结构依赖的电子构型以及相对于块状材料的非常大的表面体积比有关。纳米大小的颗粒可以沉积在呼吸道的所有区域，包括远端肺。由于纳米颗粒体积小，可以直接通过细胞膜进入细胞，也可以在细胞之间或穿过细胞，转移到身体的其他部位。有限的数据表明，吸入的纳米颗粒可能会转移到神经系统和其他器官/组织[79- - - - - -81］．

纳米颗粒的大小本身可能不是决定其毒性的关键因素;总的数量和总表面积可能也很重要。当粒子尺寸减小时，其表面积增大(每单位质量;如果你归一化到粒子的数量，表面积就会减小)，并且在表面发现的原子/分子的比例比内部更大。因此，与较大的颗粒相比，纳米颗粒具有更大的单位质量表面积。表面体积比的增加导致颗粒表面能的增加，这可能使它们更具生物活性。

纳米材料具有各种形状和结构，如球体、针、管、板等。纳米多孔材料是在纳米范围内具有确定孔径的材料。纳米材料的形状对其毒性的影响是未知的。纳米材料的形状可能对其在体内沉积和吸收的动力学有影响。最近的结果在体外细胞毒性研究表明单壁纳米管比多壁纳米管毒性更强[82］．

化学成分是表征纳米材料的另一个重要参数，纳米材料几乎包括所有物质类别，例如金属/金属氧化物、化合物、聚合物以及生物分子。一些纳米材料也可以是上述成分在核壳或其他复杂结构中的组合。根据粒子表面化学性质，粒子表面的反应基团必然会改变生物效应。在环境条件下，一些纳米颗粒可以形成聚集体或团聚体。这些团聚体有多种形式，从树枝状结构到链状或球形结构。为了保持纳米颗粒的特性，通常用涂层或衍生物表面来稳定它们，以防止团聚。纳米颗粒的性质可以通过表面修饰显著改变，纳米颗粒在体内的分布强烈依赖于表面特征。通过涂覆纳米颗粒以防止聚集或团聚而改变表面性质，不同类型和浓度的表面活性剂已被证明可显著改变其体分布和对生物系统的影响[83，84］．

因此，建议对试验材料的以下理化性质进行表征:

• 大小分布

• 聚集状态

• 形状

• 晶体结构

• 化学成分-包括空间平均(体)和空间分解的异质成分

• 表面积

• 表面化学

• 表面电荷

• 孔隙度

4.1.4剂量指标

在任何毒性筛选研究中，都应仔细考虑用于量化剂量的度量标准。虽然反应可能与广泛的物理化学特征有关，但测量剂量与的物理度量质量，表面积或粒子数因为表征良好的材料可以对数据进行定量解释。剂量指标的适当选择将取决于与预期反应最密切相关的假设参数或可能最准确测量的指标。强烈建议在所有情况下都收集足够的信息以启用剂量防范这三个主要的物理指标被推导出来。如果已知纳米材料质量、表面积和粒子数浓度之间的关系，或者通过测量粒子大小分布来推导所有三个剂量指标，就可以实现这一目标。如果纳米材料是在液体介质中给药，例如在气管内灌注或咽吸技术中，悬浮液中材料的性质和数量应在交付之前在数量、表面积和质量浓度方面得到充分表征。吸入研究提出了随时间测量剂量的额外挑战，并且需要在线(时间解析)和离线分析。

离线质量使用基于过滤器的方法进行浓度测量可提供标准吸入研究的连续性，并被推荐作为吸入纳米材料筛选试验的重要组成部分。同样，在线质量浓度测量建议作为吸入研究的一个重要组成部分。与离线表面积和浓度数分析相比，在许多情况下，过滤器样品的重量和/或化学分析将提供最准确的暴露特性。有了适当的附加信息，这些测量可用于计算气溶胶表面积或浓度。但是，如果粒径分布较宽或存在少量过大颗粒，则粒径与质量之间的直径立方关系在由质量转换为数浓度时可能会导致较大的误差。使用锥形元件振荡微天平(TEOM)等仪器进行在线质量浓度测量^®)可提供较高的精密度及良好的准确度[85]，虽然它们很容易出错，因为采样的气溶胶含有挥发性成分。在线光度质量浓度方法通常适用于监测气溶胶的时间稳定性，并提供质量暴露的实时指示，尽管它们对直径小于约0.5 μm的颗粒相对不敏感[86］．然而，一般而言，应采用更适当的方法实时测量暴露的数量和表面积[85，87- - - - - -89］．

气溶胶大小分布如果已知粒子形状和密度等参数，测量可以根据所有三个物理指标合理地计算暴露量。离线尺寸分布测量方法，如透射电子显微镜(TEM)分析，提供了关于这种分布的详细信息，但非常耗时，并且经常受到收集技术的限制，在透射电子显微镜分析的情况下，从二维图像推断三维结构。在线尺寸测量技术，如差动度分析[90]能够以数十秒的时间分辨率测量气溶胶的大小分布。给定颗粒直径之间的气溶胶数浓度很容易从气溶胶尺寸分布测量中得到，尽管根据质量或表面积剂量解释这些数据需要关于颗粒特征(如形状和密度)的额外信息。建议对于每种纳米颗粒类型，尺寸分布测量技术都要通过TEM分析进行验证。

离线表面积虽然需要使用适合过滤样品的技术，但可以使用等温气体吸附进行表征。由于压实和表面闭塞，收集材料的表面积也有可能与空气材料的表面积不同。然而，这种情况可能发生的程度尚不清楚。已发表的研究表明，离线表面积测量与生物反应之间存在良好的相关性[91]，这表明与收集和后续分析相关的错误可能很小。这尤其适用于不溶性粒子;理想情况下，在纳米材料的水溶性和/或脂溶性化合物从颗粒表面溶解后，需要对其不溶性核心进行表面积测量。气溶胶扩散充电已被证明可以在线测量充电率低时的表面积[89]，市面上也有少量的气溶胶扩散充电器。这些设备已被证明可以很好地测量直径小于100纳米的颗粒的气溶胶表面积[87］．在直径较大时，测量的表面积逐渐低估了气溶胶表面积。特别是，多孔颗粒结构的表面积以及高度聚集的颗粒的表面积通常不会被确定。关于一种特定的气溶胶扩散充电器已发表的数据表明，它提供了一种测量肺部气溶胶表面积剂量的方法，而不是气溶胶表面积暴露量[92］．虽然在线气溶胶表面积测量在吸入暴露研究中是可取的，但与当前技术相关的不确定性建议在解释这些测量时要谨慎。

数浓度可使用冷凝粒子计数器等仪器，较容易地进行在线测量[88］．虽然目前尚不清楚作为一种剂量度量指标，数值浓度在生物学上的相关性如何，但进行这种测量的容易程度及其在跟踪暴露时间变化方面的价值，导致它们被推荐为吸入研究中必不可少的指标。

表格1总结了在吸入研究中测量暴露的建议。

4.1.5表征优先级

在为纳米材料毒性筛选研究制定材料表征建议时，考虑了三个具体因素:评估材料的环境，在该环境中测量特定参数的重要性，以及在特定环境中测量参数的可行性。表中列出了用于纳米材料毒性筛选研究的离线材料表征的建议2．

此外，还对记录纳米材料的生产、制备、存储、异质性和团聚状态等信息提出了建议。为了能够对毒性数据进行回顾性解释和重复试验，强烈建议记录有关纳米材料生产和加工的所有信息。充分记录储存时间和条件(包括温度、湿度、光照和大气成分)是必要的，因为随着时间的推移可能会发生物理化学变化。如果可能，应证明样品随时间变化的物理化学稳定性。当测试材料是不同组分的异质混合物时，需要关于不同组分的相对丰度的信息，以及在被管理的材料中是否保持了大块材料中的关联，或者不同组分是否优先使用特定的传递机制。

纳米材料在给药期间和给药后的团聚状态可能对其生物活性有重大影响。应表征不同结构尺度上的团聚状态，包括初级(初级粒子)尺度、次级(初级粒子团聚体和自组装结构)尺度和三级(次级结构的组合)尺度。理想情况下，应评估给药后生物环境中的团聚状态。如果可能的话，应该深入了解团聚体内部的结合力(例如相对较弱的范德华力或相对较强的烧结键)。在可能的情况下，还应研究不同液体介质中的物质团聚或反团聚情况。

对给药材料的特性描述建议作为最高优先级，之后再辅以特性描述在体外或在活的有机体内在可能的情况下进行管理，并按照生产或供应的材料特性的偏好顺序进行管理。表中的推荐特性2同时反映这个层次结构和在各自的上下文中进行度量的可行性。

4.1.6分析方法

许多已建立和正在发展的分析技术可用于表征表中所列的纳米材料的特性2．表格3.列出了一些更广泛使用的技术，并将它们与毒性筛选研究感兴趣的纳米材料特性联系起来。技术根据其对特定材料特性的适用性进行了分类。一般来说，这个表是不言自明的，关于每种技术的进一步信息可以从广泛的来源获得。许多技术只适用于某些形式的材料，或特定类别的材料。例如，虽然透射电子显微镜能够提供大量关于纳米颗粒的信息，并被认为是评估颗粒大小分布和形状的金标准，但干燥(或在冷冻透射电镜的情况下，冷冻液体封装)分散良好的样品需要足够坚固以承受高真空。类似地，红外(IR)光谱等技术对表面有机化合物特别敏感，但对定量无机表面化学作用不大。在许多情况下，可以使用TEM等复杂技术来验证在常规基础上更实用的表征方法。

鉴于与纳米技术相关的许多学科都有广泛的分析技术，在进行纳米材料毒性筛选研究时，强烈建议与提供最先进的纳米材料表征能力的研究和分析小组进行多学科合作。

4.1.7研究空白

1. 1.

   可行的发展在活的有机体内纳米材料(包括纳米颗粒)检测技术。

2. 2.

   开发和生产廉价的气溶胶质量浓度(低浓度，纳米颗粒)、表面积浓度和尺寸分布的实时监测仪器和方法。

3. 3.

   开发标准化的、特征良好的纳米材料样品。

4. 4.

   开发无线电标记的纳米材料样品，以及可以通过中子激活跟踪和检测的样品。

5. 5.

   更先进的表面化学表征技术的发展，特别是能够检测和物种化纳米粒子和纳米材料表面生物分子的技术。

6. 6.

   生物相关纳米尺度分析的电子显微镜技术的发展。

4.1.8建议

1. 1.

   所有具有潜在意义的纳米材料物理化学特性都应在毒性筛选试验中测量或推导出来。

2. 2.

   强烈建议在给药时对纳米材料进行表征，并在技术上可行和切实可行的情况下对给药后的特性进行补充。不建议对生产或供应的散装材料进行除上述以外的表征，除非没有更合适的测量方法。

3. 3.

   建议在可能的情况下对纳米材料进行独立表征(生产者和供应商提供的信息除外)。

4. 4.

   建议在毒性筛选试验中对纳米材料的以下物理化学性质进行表征:粒径分布、团聚状态、颗粒形状、晶体结构、化学成分(体积和空间)、表面积、表面化学、表面电荷和孔隙率。

5. 5.

   建议在所有情况下，都应收集足够的资料，以便根据所有三个主要物理指标(数量、表面积和质量浓度)推算所送剂量。

6. 6.

   推荐使用基于过滤器的方法进行离线质量浓度测量，作为吸入纳米材料筛选测试的重要组成部分。此外，建议离线测量气溶胶尺寸分布。

7. 7.

   在线质量浓度和数量测量建议作为吸入研究的重要组成部分。

8. 8.

   强烈建议研究和分析小组之间进行多学科合作，提供最先进的纳米材料表征能力。

9. 9.

   建议在所有纳米材料毒性筛选研究中记录有关纳米材料的生产、制备、储存、异质性和团聚状态的信息。

10. 10.

    建议充分记录纳米材料的制备方法，包括适当的分散介质的选择，在介质中分散的方法和介质内的团聚状态。不建议使用特定的制备技术，因为这取决于所使用的材料和测试方案。然而，建议在使用超声波搅拌分散材料时要谨慎，因为在高能下，这种方法可能足以改变材料特性(见4.3.1.1节)。

4.2在体外测试方法

4.2.1介绍准备

在考虑具体应用之前在体外在评估纳米材料毒性的测试方法中，有几个一般性的问题需要注意。

1. 1）

   优点和缺点在一般情况下在体外技巧被视为重要的辅助手段在活的有机体内研究。这些研究允许在受控条件下测试特定的生物途径，以及隔离不可行的途径在活的有机体内；例如，很难区分在活的有机体内补体活化是否在颗粒的促炎作用中起作用。补体系统可以被分离在体外，并对其潜在作用进行了研究。当然，有充分记录的问题在体外方法，包括缺乏对的验证在活的有机体内不良反应、剂量测定不匹配、过于简单、未涉及完全炎症反应等。

2. 2）

   控制粒子鉴于上述，重要的是，在所有实验中都包括足够的阳性和阴性对照粒子。这至少可以让测试粒子与已知毒性的粒子进行基准测试。这些可以包括标准晶体二氧化硅(石英;例如，Min-U-Sil或DQ12)是已知的细胞毒性颗粒，而细TiO2是惰性颗粒。

3. 3）

   剂量表达式毒性反应和其他反应应根据材料和可获得的剂量指标数据，用一系列剂量指标来表示(见第4.1节)。

4. 4）

   蛋白质被纳米颗粒吸附纳米颗粒的大表面积意味着它们能够吸附蛋白质。据报道，各种类型的纳米颗粒可以吸附关键蛋白质，如白蛋白[93]、纤维连接蛋白和TGF-β [94］．这可能会混淆依赖于蛋白质测量的端点，因为蛋白质可能会产生，但也可能通过吸附从上清液移到纳米颗粒表面，从而提供假阴性。

的在体外所提出的试验将分为入口毒性和靶器官毒性。将描述潜在的靶细胞和相关的适当终点。最后，将确定研究差距和建议。

4.2.2入境入口

4.2.2.1肺

肺部是空气中任何粒子的潜在目标，还有很多在体外肺的模型是存在的。颗粒沉积在气道或肺泡上皮上，遇到粘液或上皮内液。然后它们可能与巨噬细胞相互作用，这可能导致它们被清除，或者它们可能进入间质，在那里它们可能与成纤维细胞和内皮细胞或免疫系统的细胞接触。

的上皮细胞

上皮细胞是对抗沉积在传导气道或肺泡区的颗粒的第一道屏障。因此，支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞都应该被认为是肿瘤的靶细胞在体外研究。检测纳米颗粒效应的终点可包括毒性测量，如LDH释放、坏死或各种细胞因子表达(IL-8、MCP-1等)，[91，95活化NF-κB和AP-1等炎症相关转录因子[96，97］．氧化应激和亚硝化应激是致病颗粒引起细胞损伤和激活的主要机制假设。这些可以通过使用二氯荧光素测量氧化应激来监测[98]或氧化谷胱甘肽作为终点[99]和亚硝化蛋白作为活性氮种类的衡量指标[One hundred.］．对颗粒诱导的氧化/亚硝化应激的反应可包括抗氧化基因的上调[101比如超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶，所以这些也可以被测量。纳米颗粒的增殖效应可以使用多种方法评估，包括溴脱氧尿苷掺入[102］．

如果癌症是正在考虑的终点，那么可以通过COMET试验和8-羟基脱氧鸟苷测量等方法来量化遗传毒性的直接测量[103，104］．纳米颗粒在上皮细胞间的转运可能是一种重要的危害性鉴别器，尽管很少有文献专门研究纳米颗粒在上皮细胞间的转运在体外，这些应该发展，并可能有助于理解调节易位的因素。

巨噬细胞

巨噬细胞在对沉积在肺部的颗粒的细胞反应中起着关键作用。纳米颗粒对巨噬细胞的影响可以通过多种方式进行研究在体外通过各种测试。细胞毒性可以用传统方法测量，如乳酸脱氢酶释放。巨噬细胞在吞噬多种致病颗粒后被激活，释放细胞因子(肿瘤坏死因子α (TNFα)、白细胞介素-6 (IL-6)等)和炎症相关转录因子核因子κB (NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)的核转移。巨噬细胞在吞噬颗粒时发生氧化爆发[105并且这种对纳米颗粒的反应程度可以被研究。也可产生一氧化氮(NO)，以响应微粒[106]在超氧自由基过氧亚硝酸盐(一种剧毒物质)的存在下，会产生[107］．如果OB或NO的产生被夸大，可能会对上皮细胞造成“旁观者”损伤，而OB/NO的产生减少可能意味着杀微生物活性受损，从而导致感染。据报道，另一个被纳米颗粒损害的关键巨噬细胞功能是吞噬作用，[108因此，可以考虑测试纳米颗粒对这一功能的影响。细胞骨架是正常细胞功能的关键，可以被纳米颗粒靶向，因此可以进行研究。

内皮细胞

虽然这些是在肺中发现的，但它们被认为是心血管系统的一部分，并在下面处理。

成纤维细胞

成纤维细胞存在于间质中，容易受到任何进入该部位的颗粒的影响。至少有两种重要的反应模式可以被纳米颗粒/成纤维细胞相互作用激活，这两种模式都构成了相关的终点在体外1)促炎作用，通过细胞因子/趋化因子基因表达(TNFα;等);或者2)通过直接刺激成纤维细胞生长或由纳米颗粒刺激细胞外基质分泌，或者通过纳米颗粒刺激成纤维细胞释放生长因子(如转化生长因子β和血小板源性生长因子)后的自分泌刺激，激活成纤维细胞反应。

免疫系统

如果颗粒与淋巴细胞相互作用，或者由于它们倾向于进入间质，它们可以调节树突细胞的功能，则可以设想免疫病理效应。纳米颗粒对免疫功能的影响，包括巨噬细胞和树突状细胞的抗原呈递以及对免疫反应的后续影响在体外是相关的终点，应设计适当的测试。

共培养

除了肺细胞的单一培养外，共培养如上皮细胞/巨噬细胞或上皮细胞/内皮细胞可能更接近在活的有机体内情况，所以这样的研究是被鼓励的。

肺片

培养全肺组织切片的方法是可行的，这样可以暴露多种肺细胞类型在体外在相同的结构中发生在活的有机体内．

细胞系vs.新鲜细胞

如果可能，应使用新鲜的原代细胞。在使用细胞系的地方，这些细胞系最好不是癌细胞。当使用癌细胞时，所研究的端点响应应与非癌细胞仔细比较，以确保对于该端点，细胞是癌细胞这一事实与非癌细胞相比不会大大改变响应。

全心肺制剂

Langendorff心肺制剂可能提供了在高度控制条件下研究纳米颗粒行为的机会。在该模型中，放血的心脏和肺通过灌注维持，因此可以在无血的情况下研究肺和血管空间之间的运输[109］．

4.2.2.2皮肤

皮肤或被皮是人体最大的器官，是独特的，因为它是纳米颗粒制造过程中接触纳米颗粒的潜在途径，也为无血管表皮提供了一个环境，在那里颗粒可能会停留，不容易被吞噬作用去除[110］．“肮脏的”纳米颗粒(催化剂残留物)滞留在表皮的毒理学后果是什么?事实上，正是这种在表皮的脂质结构域的相对生物隔离，使得使用脂质纳米颗粒和脂质体将药物输送到皮肤。外用护肤品中使用的较大颗粒的氧化锌和氧化钛已被证明能够穿透兔子皮肤的角质层屏障，水和油性液体的吸收率最高[111］．这也适用于人造纳米颗粒。纳米颗粒能在局部暴露后进入表皮，这是毒理学反应的第一步吗?金属纳米颗粒的物理性质将使它们能够催化许多生物分子的相互作用，暴露于金属纳米颗粒可能会产生不利的毒理学影响。关于纳米颗粒从皮肤上去污的效率，还需要更多的信息，因为溶解和稀释是暴露后去污的两个标志，对这些固体结构可能不那么有效。

研究应解决皮肤中多种类型的纳米颗粒暴露于皮肤和全身的影响。皮肤是潜在接触有毒物质的主要途径，包括新型纳米颗粒。然而，没有关于颗粒是否被角质层屏障吸收或系统施用颗粒是否会在真皮组织中积累的信息。由于颗粒大小的不同，纳米颗粒可能以不同的速度穿过角质层，或被隔离在表皮内，以增加它们与存活的表皮角质形成细胞的暴露时间。

纳米材料很难大量获得;因此，最好是品行端正在体外待估计的测试在活的有机体内毒性测试的起始剂量[112］．所有试验中至少应使用三到四种有对照的浓度在体外系统。这些数据将提供一个初步的，但相关的评估，这两个系统曝光局部给药和皮肤给药后危害经过局部暴露和全身暴露，这是任何风险评估的两个重要组成部分。

细胞培养

人表皮角质形成细胞(HEK)单层可受纳米颗粒相互作用的影响。研究已经表明，暴露于多壁碳纳米管时，活性和毒性的生物标志物会发生变化[50］．应评估细胞毒性终点:1)细胞活力-代谢标记，如线粒体将四唑盐还原为不溶性染料(MTT)， 2)细胞活力降低-膜标记，如中性红摄取到细胞溶酶体，锥虫蓝排斥和细胞附着/细胞分离，3)促炎细胞因子影响，由TNFα， IL-8, IL-6, IL-10或IL-1β测量。基因组学和蛋白质组学分析可用于探索毒性背后的机制。然而，当使用炭黑或任何其他材料作为对照时，必须谨慎，因为可能会发生并发症。碳可以吸附活性染料，如中性红，并干扰吸收光谱。会出现假阳性。使用的炭黑的类型是非常重要的。例如，超细炭黑已用于吸入研究，但在细胞培养中的剂量会产生不同的结果，特别是在进行活力和细胞因子测定时。

三维皮肤细胞培养也可以在市场上买到。他们已经证明能够预测刺激，但可能大大高估了吸收或穿透[113- - - - - -116］．可使用上述测定方法，但由于吸附作用，可能不适用于纳米材料。

流动扩散细胞研究

扩散池系统由流动扩散块组成，每个扩散块包含多个聚四氟乙烯细胞，由恒温循环器通过硅橡胶氧合器、自动馏分收集器和干燥剂灌注。圆形新鲜猪皮肤(猪皮肤模仿人类皮肤，消除了随机来源的人类皮肤所见的极端可变性)或人皮肤表皮面朝上放置在聚四氟乙烯流动扩散池中。含有纳米颗粒的化合物在表皮一侧给药，而每个细胞的真皮一侧以设定的流速沐浴受体液。每隔24小时收集灌注液，可通过放射性计数、荧光或紫外检测来评估灌注液中的纳米颗粒通量。然后，可以用棉签擦拭皮肤表面以去除未被吸收的表面颗粒，然后用胶带剥离以去除角质层样本，以评估纳米颗粒穿透最外层表皮层的情况。也可对皮肤进行连续切片[117，118］．

离体灌注猪皮瓣

分离的灌注猪皮瓣(IPPSF)是研究纳米材料吸收和毒性的理想模型。IPPSF具有功能完整的微循环，存活的表皮和真皮，可得到良好的控制。一个单蒂轴向型管状皮瓣由猪腹部外科创制，主要由尾侧腹壁浅动脉及其相关的成对静脉灌注。IPPSF被转移到灌注装置，这是一个定制设计的温度和湿度调节室。纳米材料可局部给药于皮肤表面，并灌注收集超过8小时的样品，并评估纳米颗粒通量[119- - - - - -121］．

其他急性毒性在体外可用的分析方法，但用于测试腐蚀性(大鼠经皮电阻(TER)，市售的EPISKIN, Epiderm和corrosion sitex)和刺激性(EPISKIN，和Epiderm)。然而，皮肤毒性的主要传统终点是使用细胞活力测定MTT降低，由于标记物与纳米颗粒的相互作用，纳米材料已被证明是不可预测的。

4.2.2.3粘膜

黏膜是湿润的组织，排列在整个身体的特定器官和体腔中，包括鼻腔、口腔、肺、阴道和胃肠道。可能纳米颗粒暴露的最重要入口之一(不包括鼻腔和肺，上面已经详细介绍过)是胃肠道。无论是意外的还是有意的口服给药都可能导致严重的暴露。通过胃肠道有效摄取纳米颗粒已在口服喂养研究和使用10纳米至500纳米颗粒的灌胃研究中得到充分证明[122- - - - - -124］．在这些研究中，纳米颗粒通过肠粘膜衬里和上皮屏障转运，并在短短60分钟内与GALT(胃肠道相关淋巴组织)和循环系统相关[125］．

肠上皮可以用多种方法进行研究，包括永生化细胞系和组织构造。用于研究物质通过肠上皮屏障摄取的永生化细胞系的一个例子包括可可细胞，它已被用于许多药物研究，以确定肠渗透性[126］．

这些测定方法可用于在体外易位率研究或发展对易位过程的机制理解。IEC-6和IEC-18细胞系也已广泛用于肠上皮衬里的机制研究，可能是纳米颗粒研究的有用工具[127- - - - - -129］．这些细胞已被用于测量毒物暴露后各种信号通路的激活，以及细胞因子和ROS/RNS的释放[130，131］．

根据具体的应用，阴道和口腔粘膜暴露可能是可能的，但一般来说，这些不太可能是重要的入口暴露途径。然而，有多种细胞系和组织结构或模型可用于通过这些途径研究易位和纳米颗粒暴露的影响[132- - - - - -134］．

4.2.3细胞分析

对沉积部位远端靶器官的研究假定纳米颗粒从肺、皮肤或肠道的入口转移和重新分配。如上所述，潜在的靶器官包括血液、内皮、神经组织、心脏、肾脏、肝脏和脾脏。

4.2.3.1内皮

内皮是由一层薄薄的细胞构成的，它分布在全身的脉管系统中。已经证明，超细颗粒或纳米颗粒可能对内皮细胞有广泛的影响。在体外培养可能有助于阐明跨越肺泡毛细血管或血脑屏障的转运机制信息以及内皮细胞效应。培养的内皮细胞非常适合于测定纳米颗粒可能对RNS产生的影响，而RNS产生已被证明在血管稳态中发挥重要作用[135- - - - - -137］．

4.2.3.2血

在体外使用分离的血液制品(分离的红细胞、血小板、白细胞或补体血清)的研究可用于评估对循环血液的影响。血小板活化、红细胞相互作用、ROS/RNS的产生、白细胞释放细胞因子/趋化因子和补体活化是评估纳米颗粒的相关终点。已证明，纳米颗粒一旦从进入部位发生易位，就具有进入循环系统的能力[138，139］．

4.2.3.3脾

脾脏是免疫处理和淋巴成熟的主要部位，脾脏中颗粒的积累可能会导致免疫反应和免疫病理。可以分离脾脏细胞并研究纳米颗粒的作用在体外．终点包括抗原处理和免疫反应在体外，淋巴细胞分化标志物，以及树突状细胞功能和淋巴细胞增殖等功能方面。

4.2.3.4肝

肝脏是一个复杂的器官，在结构和功能上都是不同的。肝脏是生物转化和防御外来物质和外来生物的主要部位。它是一个完整的结构，有两个独立的血液供应，许多不同的细胞类型，许多不同的功能。由纳米材料引起的肝损伤可能基于组织学病变，如炎症或坏死。肝脏损伤也可以在分子水平上表现出来。一些最常见的肝细胞损伤机制是通过细胞色素P450代谢途径。肝脏可以将物质排泄到胆汁中;因此，胆道系统也可能暴露。在活的有机体内有报道称，各种不同的毒素通过一系列不同的机制引起肝细胞损伤，如细胞色素P450激活、乙醇脱氢酶激活、膜脂过氧化、蛋白质合成抑制、钙稳态破坏和促凋亡受体酶的激活。应尽一切努力利用人类衍生细胞在体外因为这些研究可以用来预测人类的毒性。然而，酶的功能在人类中有相当大的变异性。

人原代肝细胞

原代人肝细胞培养物已在市售，具有良好的代谢特征和完整的代谢酶。由于肝移植需求的增加，人类细胞的可用性有限。

离体灌注肝

这种复杂的模型系统适合于纳米材料的研究，因为它是最接近模拟的模型在活的有机体内并且可以对器官内的粒子分布进行详细的描述。

肝片

现代精密切片技术使肝脏切片成为一个很好的模型，因为它保留了正常的组织结构，这可能对纳米颗粒的研究特别重要。

胶原蛋白三明治培养

在这个模型系统中，结构和功能的完整性可以保留数天。胆管保存完好，可以评估谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶的释放情况。

一般来说，使用这些在体外肝代谢可以通过分离的肝细胞和细胞系进行研究，并评估CYP450的变化。微粒体可用于筛选用于代谢的纳米材料，使用LC/MS识别代谢物的形成。亚细胞切片、肝切片和全肝匀浆可用于评估肝功能和毒性。为了研究纳米材料对肝功能特定终点的影响，如酶系统、线粒体功能、白蛋白合成、细胞脱离、基因和/或蛋白质表达以及膜损伤。可以利用不同的机制终点，如细胞形态、活力、膜损伤、alamar blue代谢、ATP含量、共价蛋白结合、过氧化物酶体增殖和GSH含量。其他生物标志物鉴定，如转录和蛋白质组学分析应加以研究。然而，生物标志物可能有局限性，因为永生化细胞系在基因和表型上与器官本身不同。此外，肝细胞培养只代表一个单细胞系统，只提供直接影响细胞本身的事件的信息。只要实现这些假设和限制，其中一些测试系统可能能够预测纳米材料的毒性[140，141］．

4.2.3.5神经系统

中枢神经系统

在体外研究粒子对神经系统影响的系统可以包括培养神经元和添加纳米粒子以确定对神经元功能的影响。终点可包括ROS/RNS的产生、凋亡、代谢状态、对动作电位的影响以及一般的离子调节。小胶质细胞是大脑中发现的一种巨噬细胞，它们可能参与处理进入大脑的任何纳米颗粒。小胶质细胞对纳米颗粒的反应应按照肺切片中巨噬细胞的反应进行研究。其他可以研究纳米颗粒作用的细胞有星形胶质细胞、影响神经元行为的胶质细胞和少突胶质细胞。少突胶质细胞通过产生髓鞘为轴突提供支持，髓鞘使轴突绝缘。

周围神经系统

皮肤和其他入口和目标器官都有神经供应，例如，皮肤有感觉神经存在于身体表面附近。纳米颗粒有可能进入这些神经，并通过多种方式运输或影响它们。这可以通过使用周围神经的神经元培养和研究纳米颗粒对各种相关端点(例如背根神经节神经元)的影响来研究。在自主神经系统中，交感神经和旁交感神经都可以培养，纳米颗粒对其活力、代谢、电活动和离子稳态的影响可以被研究。

4.2.3.6心

通过微循环进入心肌的纳米颗粒可以改变心脏功能。可以培养心肌细胞，并可以确定对其一般活力、离子稳态和代谢的影响。此外，心肌细胞有规律的搏动在体外，对这方面的影响可以被测量，任何影响都可以被检查到机制。

4.2.3.7肾

肾脏是一个主要的过滤系统，从血液中消除有毒物质，已经证明纳米颗粒可以通过肾脏排出。纳米颗粒对肾脏是否有不良影响尚不清楚，但这可以用在体外技术。药物研究中使用的渗透性测定可用于测量肾小管的移位和渗透。对上皮小管和血管的影响可以用现有的细胞培养技术进行评估。可以评估多种终点，包括信号转导反应、氧化应激、细胞活力、离子通道通量、生长因子和蛋白酶释放的调节，这些都是肾脏稳态的重要指标。有几个模型可能有助于研究纳米颗粒-肾脏的相互作用，包括肾组织切片，以评估易位、氧化应激、信号转导反应和毒性[142，143］．永生化细胞系是肾脏切片模型的廉价替代品，并可能提供有关纳米材料细胞毒性的机制信息。来源于离体肾小球、远端小管/集管、近端小管或近端肾单位的细胞已被很好地表征，并可在市场上获得[144，145］．一个例子是使用HEK-293细胞(人类胚胎肾细胞)来评估化学物质的细胞毒性[146］．MDKK细胞和LLC-PK1细胞已广泛应用于在体外机理研究，可用于评估纳米颗粒的影响[147，148］．

4.2.4非细胞分析

耐用性

粒子的持久能力决定了它作为剂量积累的能力。在纤维毒理学中，有充分记录的动态和静态协议来评估这种耐久性在体外，使用Gambles平衡盐溶液[149］．这些光纤协议可以修改，以允许测量纳米颗粒的耐久性在体外．

补体的激活

补体系统是一个蛋白质级联系统，已经进化到可以检测外来的，主要是微生物的表面。然而，石棉会活化它[150]和碳纳米颗粒[151］．它们的高单位质量表面和表面活性可能意味着其他类型的纳米颗粒可能有效地激活补体系统。这可能通过调节颗粒(C3b)或通过产生过敏性毒素(C5a)来改变反应。因此，研究纳米颗粒激活补体系统的能力是有必要的。

吸附性能

纳米颗粒的大表面积意味着它们可以吸附蛋白质[152，153］．不同的蛋白质吸附可能发生在不同的纳米颗粒表面，这可能会改变它们被巨噬细胞和其他细胞处理的方式。因此，这可以成为研究的重点。

自由基产生

大多数(可能是全部)致病颗粒在无细胞系统中产生自由基，这种引起氧化应激的能力有助于它们引发炎症，并引起细胞损伤和遗传毒性[95，154- - - - - -157］．自由基可因微粒表面(石英)的稳定自由基而产生[158]，离子过渡金属通过Fenton反应(如焊接烟尘)的氧化还原循环，[159]或未知的表面机制(纳米碳黑)[160］．粒子产生自由基的能力可以通过一系列的分析来评估，包括质粒DNA分裂[161]，电子顺磁自旋共振，[162和8-OH-dG在“裸”DNA中的产生或DCFD检测在体外ROS的产生[163］．

计算毒理学

除了建立上述筛选方法外，评估与工程纳米材料或其他环境压力源相关的风险的努力应该包括一系列称为计算毒理学的新技术。计算毒理学被定义为数学和计算机模型以及分子生物学方法的应用，以改善数据需求的优先次序和环境保护的风险评估。

这种方法涉及四个方面:

• 计算化学是指在分子水平上的物理化学数学建模，包括量子化学、力场、分子力学、分子模拟、分子建模、分子设计和化学信息学等主题;

• 分子生物学，允许遗传成分的表征和广泛覆盖的技术的应用，如基因组学，蛋白质组学和代谢组学，以提供细胞和有机体对应激输入的反应的关键指标;

• 计算生物学或生物信息学，涉及分子生物学数据库的开发和数据的分析;

• 系统生物学是指应用数学建模和推理来理解生物系统和解释生物现象。

计算毒理学旨在通过提高预测毒性的能力来提高优先级、筛选和评估材料的能力。除了“组学”，还应评估物理有机化学中发展的定量结构-活性关系(qsar)，以确定它们是否有助于预测纳米材料的结构-性质关系。然后，这些多学科模型可以在从环境释放到整个浓度、暴露浓度、靶细胞器、早期生物效应和不良结果的来源到结果连续统中考虑。

虽然利用计算毒理学找到纳米材料结构和毒性之间的关系可能还需要很长一段时间，但在开发筛选方法时，最好记住这些模型，并使用当前的方法来验证和通知它们的开发。

4.2.5研究空白

关于纳米颗粒对这些不同靶细胞及其各自端点的影响的数据很少在体外．因此，我们认为迫切需要在所有这些体系中获得更多关于纳米颗粒的信息。但是，我们确实发现了一些迫切的需要，其中包括:

1. 1.

   在体外需要使用分析来确定驱动纳米颗粒毒性和易位潜力的重要参数，例如尺寸、表面积、表面反应性等。

2. 2.

   必须就最合适和最有用的方法作出决定在体外终点及其相对效用和重要性(例如，易位、ROS的产生、细胞因子释放、细胞毒性)。这是一个排名在体外应尝试按相关性和实用性的顺序进行分析。

3. 3.

   在体外数据应用于开发纳米颗粒毒性的范例，以预测基于测量的毒性在体外参数;当这个范式成熟时，可以进行严格的测试在活的有机体内．

4. 4.

   应使用毒动学数据来选择适当的靶细胞和系统，并选择合理的剂量水平用于药物治疗在体外化验。

5. 5.

   应确定纳米颗粒形式的影响(如单线态颗粒或聚集物，表面活性剂的使用)，并尽可能描述纳米颗粒剂量，如表面积、金属等。

6. 6.

   迫切需要准备和选择合适的基准材料在体外测试。

7. 7.

   我们如何解释在体外结果没有适当的机械信息来自在活的有机体内模型?

4.2.6建议

表格4可提供可用的在体外用于入口测试的系统。表格5可提供可用的在体外其他潜在靶器官的系统。

1. 1.

   在体外建议进行检测，因为它们提供了一种快速和相对廉价的方法来评估纳米颗粒的潜在毒性;但是，有充分记录的缺点在体外化验方法，例如其相对简单和常用的高剂量。

2. 2.

   我们建议在所有研究中使用“基准”颗粒控制，如晶体二氧化硅和可呼吸二氧化钛。

3. 3.

   包括纳米颗粒耐久性、补体活化、吸附和自由基产生在内的非细胞测试都可以提供关于纳米颗粒潜在危害的有价值的数据;计算毒理学也可能做出贡献。

4. 4.

   应注意蛋白质或检测成分吸附到纳米颗粒表面的潜在混淆效应。

5. 5.

   各种以细胞为基础的系统都有不同的优点和缺点，包括细胞系和新鲜来源的细胞的单细胞培养、共培养、器官培养(例如气管外植体)和心肺制剂。

6. 6.

   肺是一个关键的靶器官，因此肺上皮细胞、巨噬细胞、免疫细胞和成纤维细胞是纳米颗粒作用的关键细胞，特别是在炎症、免疫病理、纤维化、基因毒性、微生物防御和清除方面。

7. 7.

   皮肤是纳米颗粒的靶点，尤其是化妆品中的纳米颗粒，因此推荐了一些体外测试系统，包括角质形成细胞培养、流动扩散细胞和分离的灌注猪皮瓣(IPPSF)。

8. 8.

   粘膜，鼻腔、口腔、肺、阴道和胃肠道的湿润组织也是纳米颗粒和各种物质的潜在目标在体外系统可用于测试，并应加以利用。

9. 9.

   纳米颗粒进入血管系统的趋势意味着内皮和血液成分是纳米颗粒的潜在目标，这些可以被研究在体外我们敦促对这一途径给予特别关注。

10. 10.

    脾脏，肾脏，心脏和肝脏将是血源性纳米颗粒的目标器官，我们建议一些在体外测试系统可用来模拟这些器官的影响。

11. 11.

    纳米颗粒向大脑的转移以及与肺部自主神经系统的相互作用已被报道，我们强烈建议这样做在体外模型被用来研究纳米颗粒对这些重要神经细胞的影响。

4.3.在活的有机体内化验

下面一节详细介绍一种两层方法在活的有机体内化验。在活的有机体内测定方法包括肺暴露、口腔暴露、皮肤暴露和注射暴露。第1级评估针对所有暴露途径，第2级评估针对肺部暴露。第1级评估包括损伤、氧化应激和细胞增殖的标记物。肺部暴露的第2级评估包括沉积、易位和生物持久性研究;多次暴露的影响;对生殖系统、胎盘和胎儿的潜在影响;替代动物模型;以及机械研究。本节以确定研究差距和有关的主要建议的总结结束在活的有机体内纳米材料测试。

4.3.1肺暴露-第1级

目前，关于生产和加工过程中产生的纳米材料在空气中的含量或可能雾化到环境中的数量的资料很少。然而，由于其体积小，可呼吸纳米材料很可能以单线态或聚集态颗粒雾化，通过吸入途径暴露是一个值得关注的问题[48］．以下是一个模板，建议用于评估肺部暴露于纳米材料对肺和其他器官系统可能产生的不利影响。关键的一步在活的有机体内纳米材料的测试是第4.1节所述的测试材料的表征。

4.3.1.1曝光法

吸入

吸入是用于危险识别和获得剂量反应数据的呼吸道暴露的首选方法。产生的气溶胶的物理化学特性是必不可少的。特别感兴趣的是关于雾化纳米材料的粒径分布的信息，即单线态纳米颗粒与初级粒子的聚集物。产生的气溶胶必须很好地控制颗粒大小和浓度，并应尝试重现特定空气纳米材料的人体暴露条件。使用纳米材料进行吸入研究的一个关键障碍是材料的数量通常是有限的。气管内吸入比全身或仅鼻腔吸入使用的材料更少，但仍比现有的方法需要更多的材料。在这种限制下，通过气管内灌注、咽部或喉部抽吸进行肺暴露是可以接受的危险识别方法。必须记住，上呼吸道不会成为目标。

气管内的滴注法

将悬浮在适当载体中的纳米材料经气管内灌注被认为是一种可接受的肺暴露方法，以评估测试材料的相对毒性[164］．应努力将悬浮在车内的纳米材料分解。纳米颗粒的分散性差异很大;由于缺乏其他一般技术来分解这种颗粒，建议采用涡流加声波处理。然而，探头和浴浴超声都可能产生显著的局部热和压力，破坏特意用于赋予纳米颗粒特定特性的表面涂层。在必须使用超声的地方，建议使用浴超声。在所有情况下，应报告具体的制备技术(超声持续时间和功率)。悬浮颗粒的特性应根据样品的载体和涡流和声波程度确定暴露材料。在血清或含有表面活性剂的载体中悬浮纳米材料有时用于协助纳米颗粒的分解。然而，由于这些物质会粘附在颗粒表面，这种表面涂层对颗粒生物活性的影响是一个必须评估的问题。

咽和喉误吸

咽吸已被证明是一种有效的暴露方法，可使颗粒在整个肺部相对均匀地分布[165］．对肺暴露的咽吸技术的一个关注是在此过程中无意地从口腔中吸入食物颗粒。因此，在吸入暴露的前一晚应保留食物。此外，除车辆对照外，还应增加naïve组，以评估单独吸入对肺部的影响[165］．作为咽吸暴露的一种替代方法，为避免来自口腔的物质污染，喉吸可被使用，特别是在大鼠中。

4.3.1.2设计

动物模型

目前，存在一个大型数据库，使用大鼠或小鼠来评估颗粒的肺毒性。因此，为了与其他毒理学研究的可比性，首选使用大鼠或小鼠模型。然而，其他动物模型可能更适合评估特定的终点，这是可以接受的。

性别

目前，还没有关于性别特异性肺部对纳米材料敏感性的信息。因此，对于这些研究的首选性别没有建议。

剂量测定法

由于质量可能不是比较细颗粒与超细颗粒毒性的适当剂量指标[166，167]，测试材料的特性还应包括每质量的表面积和每质量的颗粒数。在实际应用中，剂量可以监测为递送的质量/动物或吸入的质量/动物，然后根据需要很容易转换为表面积或粒子数剂量，只要这三个粒子参数之间的相关性是可用的。

基准物质

为了正确地看待暴露于特定纳米材料的肺部反应，应将结果与具有明确毒性的颗粒的结果进行比较。这种基准材料可能包括纳米尺寸的TiO₂、炭黑或结晶二氧化硅。应对这些基准材料的表面积和每质量的颗粒数以及颗粒大小以及化学纯度和结晶度进行表征，以便使用各种剂量指标进行比较。

暴露浓度

建议至少使用三种暴露水平。关于人类实际预期接触水平的资料将有助于确定要评价的接触浓度范围。然而，纳米颗粒的这类信息往往缺乏。在所有情况下，测试材料和基准材料的暴露浓度应相似，在选择基准材料和测试材料的暴露时，应考虑上文讨论的各种剂量指标。建议选择的最高浓度应与基准材料具有毒性。

曝光时间

对于气管内灌注或咽吸，单次接触纳米材料就足以进行一级研究。警告:考虑大剂量和大剂量效果!对于吸入，建议接触两周，但如果类似于人类接触，则应缩短接触时间，可能浓度更高。

肺的参数

暴露后24小时至28天应监测肺部反应。建议的时间疗程为暴露后24小时、1周和28天。

4.3.1.3肺终点

吸入研究

暴露于纳米颗粒后肺部炎症和细胞毒性作用的程度/强度和持续时间是评估测试纳米颗粒毒性的重要终点。

1. 1.

   支气管肺泡灌洗(BAL)损伤标志物- BAL剖面。该方法从支气管肺泡间隙取样细胞和液体，并通过定量细胞数量、类型和液体相成分来评估炎症。此外，通过各种方法可以获得相当多的额外信息体外对BAL细胞的操作，如基因表达、吞噬潜能等。其他BAL损伤标志物包括BAL乳酸脱氢酶水平(作为细胞毒性的衡量标准)、BAL蛋白水平(BAL液蛋白浓度的增加通常与血管蛋白进入肺泡区域的渗透性增强相一致，表明肺泡-毛细血管屏障完整性的破坏)和BAL碱性磷酸酶水平(作为2型肺泡上皮细胞毒性的衡量标准)。灌洗液中细胞计数、差异和肺生物标志物的方法以前已被描述过[168，169］．

2. 2.

   氧化应激标记物- ROS/RNS。活性氧和氮已涉及DNA损伤和诱导炎症细胞因子和生长因子。脱细胞BAL液中谷胱甘肽、总抗氧化剂或硝酸盐/亚硝酸盐(一种一氧化氮产生的测量方法)、肺组织脂质过氧化或体外测定BAL细胞的ROS/RNS可用于监测氧化剂的生成和氧化应激。氧化应激标记的方法已被描述[170，171］．

3. 3.

   组织病理学:对肺部治疗的一般影响的描述应包括终点，如含尘埃的巨噬细胞的存在，细胞浸润和上皮细胞的增殖性改变。建议对整个呼吸道进行不良病理影响评估。这包括上呼吸道——鼻子、喉和上呼吸道;下呼吸道和淋巴结;还有胸膜区域。Tier 1过程中的组织病理学观察将主要集中在炎症反应和纤维化的发展。肺组织纤维化可通过组织病理学切片中胶原蛋白的特异性染色，或通过定性和定量组织病理学来确定。

4. 4.

   细胞增殖-增加的细胞分裂在病理反应中起着关键作用，可以在上皮细胞或间皮细胞中通过摄取标记的核苷酸前体来确定，如氚化胸苷或BrdU。推荐的实验旨在测量颗粒暴露对暴露后大鼠气道和肺实质细胞周转的影响。对暴露在微粒环境中的大鼠组和相应的对照组，可以用含有5-溴-2'脱氧尿苷(BrdU)的微型泵进行脉冲或皮下注射，BrdU溶解在碳酸氢钠缓冲溶液中。细胞增殖研究的方法以前已经描述过[168，169］．BrDU染色的另一种方法是PCNA染色法。增殖细胞核抗原(PCNA)是一种与细胞增殖相关的核蛋白，并已被用于通过免疫组织化学区分多种肿瘤类型的增殖细胞，包括在肺部发现的肿瘤[172- - - - - -174］．

气管内灌注或咽/喉误吸研究

如上所述，吸入是生理上最相关的，因此是识别危害和获得剂量反应数据的首选肺部暴露方法。然而，在适当的载体中悬浮纳米材料的气管内灌注和咽部或喉部抽吸(有适当的警告)都被认为是可接受的肺暴露方法，以评估测试材料的相对毒性。与使用气溶胶暴露的研究类似，应在第1级测试策略方法中评估以下肺部终点，以评估纳米颗粒对肺部的危害:

1. 1.

   BAL损伤标记

2. 2.

   氧化应激标志物

3. 3.

   组织病理学

4. 4.

   细胞增殖

4.3.1.4其他器官终点

接触纳米颗粒通过呼吸道有很大可能会转移到其他器官和组织，这取决于纳米颗粒的大小和表面化学成分。尽管易位率可能很低，但定位在敏感的亚细胞部位(如线粒体)可能导致由纳米颗粒直接诱导的不良反应。此外，纳米颗粒在呼吸道中引起的潜在氧化应激和炎症反应可能导致介质的释放，从而导致肺外器官系统的间接次要影响。因此，在第1级评估中包括对远程器官和组织(如肝脏、脾脏、骨髓、心脏、肾脏和中枢神经系统)的潜在影响的评估是至关重要的。

必须对肺外组织进行组织病理学检查;然而，这可能只在长期或非常高的暴露后才显示出显著的影响。因此，还应考虑确定器官特异性终点，如急性期蛋白和凝血因子对心血管系统的影响，免疫反应测定对脾脏的影响，以及对脑切片中多巴胺能神经元的免疫组织化学染色，以评估神经源性影响。附加功能测试(如(心率变异性测量)可以考虑，但由于它们需要特定的设备和专业知识，这些不是1级研究的强制性要求。

4.3.2肺暴露-第2级

研究结果表明，纳米颗粒可以从入口入口，即呼吸道，通过不同的途径转移到其他器官/组织，这使得它们与较大尺寸的颗粒独特不同，因为它们可以在遥远的器官中引起直接的不良反应。特别是，这种反应可能是通过不同靶细胞的内吞作用后纳米颗粒与亚细胞结构的相互作用而启动的。因此，需要特别注意识别这些影响，这些影响在健康的生物体中最初可能非常微妙，甚至无法检测到，但在受损的生物体或受损的器官中可能会产生严重后果。例如，人为超微颗粒对哮喘患者、心血管疾病患者、老年人和幼儿的影响。作为风险评估的第一步，补充性的第2级研究可用于获取更多的危害识别数据。第二级研究将提供更多的信息，以描述第一级研究中看到的进一步影响，或使用特定的易感性模型获得新数据。理想情况下，研究应将吸入暴露作为首选，特别是在第1级研究中，当使用气管内灌注或咽/喉抽吸时，观察到阳性反应。如果可获得的材料量不足，可采用上述非吸入方法进行多次低剂量(1-10 μg/kg体重)呼吸道暴露，即，给药1 - 2次/周，持续4周，随访2-3个月。

4.3.2.1动物模型

纳米颗粒在正常动物模型中没有作用，并不意味着在表现出增强敏感性的模型中没有作用。易感性增加可能是由于许多因素，包括年龄，疾病，器官功能改变，遗传多态性。相应的动物模型包括暴露于衰老、转基因和基因敲除动物和器官系统受损动物(如,高血压;糖尿病模型;免疫受损，传染性模型)。一般来说，易感模型包括呼吸道、中枢神经系统、心血管系统(内皮细胞、血小板功能障碍)、骨髓和/或肾脏功能受损。所使用的模型必须与人类疾病状态相关，并且相应的动物模型必须在同行评审的文献中得到验证。除了获得用于识别纳米颗粒危害的信息外，二级研究还将提供可与该机制协同使用的潜在机制的数据在体外研究。

4.3.2.2多重曝光

如上所述，在第1级研究中，重复吸入暴露是实际剂量的首选。有关工作场所空气中纳米颗粒的物理化学性质或一般公众(消费者)预期暴露的信息，对于模拟动物暴露至关重要。问题包括:纳米颗粒是聚集的还是单线的;在空气状态下直径是多少;关于其他化学特性(见本文件第4.1节的讨论)，我们知道些什么?用于吸入暴露的空气中纳米颗粒的生成和监测需要特殊的设备和专业知识。作为吸入的替代方法，可以使用气管内灌注、口咽或喉抽吸。然而，除非纳米颗粒被包裹并在生理溶液中“可溶性”，否则在使用这些非吸入方法时，可能会出现由于聚集而产生的伪影。此外，通过非吸入方法绕过上呼吸道，从而消除了潜在的神经元纳米颗粒转位到中枢神经系统。为了解决这一问题，人们可以通过鼻腔灌注的方式将动物暴露在纳米颗粒中。 Techniques for tracking the uptake of nanoparticles by sensory neurons would be similar to those discussed in the section concerning deposition, translocation, and biopersistence (Section 4.3.2.3). Furthermore, the impact of coating for purposes of "solubilizing" the nanoparticles has to be carefully considered in cases where anticipated human exposure is to the uncoated material, since cellular uptake, translocation and effects will be affected by the surface coating.

Tier 2研究建议在4周内每天重复吸入，暴露后观察期长达3个月，包括临时暴露后牺牲日。对于非吸入暴露方式，给药可在4周内进行1-2次/周，随后进行暴露后观察期。需要特别注意暴露浓度(吸入)和剂量(滴注、吸入)的选择。关于预期人类暴露的知识将非常有价值，使用预测颗粒沉积模型(如， MPPD模型)可用于确定真实的暴露浓度/剂量。

第2级研究旨在获得有关纳米材料暴露于呼吸道后的生物动力学的额外信息(见下文“沉积、易位和生物持久性研究”)，纳米颗粒在器官系统中的稳定性(如．，在活的有机体内表面化学变化，核心材料的生物利用度)，以及在哺乳动物有机体中的潜在急性和亚急性影响，包括基因组和蛋白质组学评估。其他终点与呼吸道的Tier 1研究中列出的相同。

4.3.2.3沉积、易位和生物持久性研究

接触空气中的纳米颗粒通过吸入路径导致沉积在呼吸道的不同腔室，其概率取决于三个重要参数组:空气动力学和热力学纳米颗粒特性、呼吸模式以及呼吸道的三维几何和结构。热力学直径为500nm以下的纳米颗粒的沉积概率随着粒径的减小而增加，这是因为扩散速度的增加导致沉积在小气道和肺泡中的增加，特别是。在20nm以下，由于纳米颗粒的扩散速度更高，其沉积位置改变到上呼吸道[175］．目前现有的计算机代码提供了呼吸道各个区域沉积概率的初步估计，如果有迹象表明纳米颗粒可能发生这些代码中未考虑到的气动和/或热力学性质的变化，则可能需要对其进行修改[176，177］．

一旦沉积，不溶性纳米颗粒会经历特定于呼吸道区域的清除机制;即，在所有区域，纳米颗粒将与上皮衬液的蛋白质相互作用，可能形成复合物，这可能影响其随后的代谢命运和生物动力学[178］．在传导气道的上皮细胞上，粘液纤毛清除提供了一个快速的运输，到喉头进一步运输到胃肠道和排泄。然而，请注意，部分纳米颗粒也会长期滞留在人体气道中，随着纳米颗粒尺寸的减小而增加，从而引起细胞摄取。在肺泡区的上皮细胞上，没有快速转运，因此游离吞噬细胞的吞噬作用可以发生，随后缓慢清除到喉部，但由于巨噬细胞识别纳米颗粒的能力有限，在炎症条件下，由其他细胞(如上皮型I + II细胞)进行的内吞过程和跨细胞转运，与通过紧密连接的细胞旁转运机制一起变得突出[179，180］．这些机制导致纳米颗粒转位到间质，淋巴引流，并可能通过内皮细胞转位到毛细血管。这种进入血液循环的途径会在次要靶器官如心血管系统、肝脏、脾脏、骨髓、中枢神经系统、内分泌器官中积累和可能的不良反应，并与循环中的内皮细胞、血小板和免疫功能细胞相互作用。除了易位纳米颗粒对次要器官的直接影响外，还可能发生间接影响，这是由纳米颗粒在呼吸道滞留部位与相邻生物系统(如细胞、液体、蛋白质和细胞外基质)的相互作用引发的。随后的细胞活化可导致细胞因子和其他介质的释放，这些介质随后扩散到循环中，在次要靶器官中诱导不良反应。由于纳米颗粒在次要靶器官中的转运和积累或介质反应的潜在机制还不完全清楚，因此纳米颗粒动力学的测定应该是一个高度优先考虑的问题。

上面描述的场景涉及生物持久性纳米颗粒，保持其颗粒状态;然而，即使纳米颗粒可能不溶于水，它们也可能不会作为固体颗粒存在于细胞和体液中，而是可能全部或部分(例如，表面涂层)分解/溶解，从而最终保留具有不同颗粒特性/毒性的生物持久性核心。由于新兴纳米颗粒的高度多样性，对其生物持久性的研究应被高度重视。

这种生物持久性研究的方法包括:

• 无线电标记或荧光或磁标记监测肺和各种器官

对纳米颗粒进行放射性标记，特别是使用粒子基质的一种相关化学元素的放射性同位素，是研究易位动力学的金标准，可实现高效、灵敏度和特异性极高的测量，特别是当它们旨在解释体内和排泄中整个分布的平衡时[79，181］．此外，荧光或磁标记提供了一种高灵敏度和特异性的有力手段来确定各种靶器官中的易位部位[181，182］．应该格外小心;然而，为了确保任何标签都牢固地保留在纳米颗粒上，否则结果将会有严重的缺陷。此外，还需要证据证明标记过程不会改变纳米颗粒的功能和表面，因为表面是与生物系统相互作用的主要底物。

• 如果不可能标记:EM监测沉积和命运

并不是在所有情况下都能标记纳米颗粒。在这种情况下，用电子显微镜跟踪纳米颗粒可能是监测有机体中电子密集纳米颗粒命运的合适选择。评价方法的选择是一个定量的形态测量方法，这是远远优于定性的斑点图像，这可能会导致错误的解释。此外，强烈建议寻找适当的替代标记技术，乍一看可能不明显，但仍将提供一个可行的选择，例如使用荧光标记纳米颗粒的共聚焦显微镜。

• 化学分析是可能的

如果纳米颗粒的基质提供了一种特有的化学元素或化合物，那么对这种特征的化学分析就为跟踪纳米颗粒的命运提供了另一种强有力的选择。重要的是，需要仔细区分污染和可能的内源性背景水平，并确定分析方法的低灵敏度水平。

4.3.2.4基因组学与蛋白质组学

纳米材料在呼吸道沉积后分布到身体的不同组织，可能会影响多种细胞功能，并且很难用传统的检测方法确定可能发生了哪些变化和不良反应。应考虑使用基因组和蛋白质组学分析，前者在分子水平上提供有关特定机制的信息(如后者将其与导致细胞和组织水平影响的蛋白质表达联系起来。需要这种分析的结果来帮助解释答复。对这些测定结果的分析需要生物信息学的输入，这将有助于解释所引起的反应。基因组学和蛋白质组学研究共同代表了一种有效的策略，将假设形成和假设驱动的研究相结合，这是在多学科团队方法的框架内评估纳米颗粒风险所需要的。

4.3.2.5对生殖系统、胎盘和胎儿的影响

评估肺部暴露于纳米颗粒对二级生殖影响的研究应遵循类似于经合组织化学品测试指南422(联合重复剂量毒性研究与生殖/发育毒性筛查试验-1996年3月22日采用)的方案。试验物质应循序渐进地给予几组雄性和雌性大鼠。雄性应至少服用4周(包括交配期交配前至少2周和交配后约2周)。考虑到有限的雄性交配前给药期，生育力可能不是睾丸毒性的一个特别敏感的指标，应该伴随着对雄性性腺的详细组织病理学分析，以评估对生育力和精子发生的影响。

在整个研究过程中，包括交配前2周(目标是至少有2个发情周期)，受孕前的可变时间，怀孕的持续时间，分娩后至少4天，直到并包括计划献祭的前一天。妊娠期应记录，从怀孕第0天开始计算。分娩后应尽快检查每窝幼崽，以确定幼崽的数量和性别、死产、活产、幼仔(明显小于相应对照的幼崽)以及是否存在明显异常。

应在分娩后24小时内(产后第0天或第1天)和产后第4天对活幼崽进行计数和性别鉴定，并对窝仔进行称重。除了对亲本动物的观察外，还应记录后代的任何异常行为。

4.3.3口腔暴露-第1层

在纳米材料的使用过程中(生产、应用、处置等)，它可能会出现在供水系统中或被无意中摄入。如果这是一个问题，应该调查口服纳米材料的影响。接触应通过一次灌胃，其剂量将代表人类接触的最严重情况。与肺暴露一样，对于口服暴露，测试材料的物理和化学性质应以交付给测试动物的形式进行表征。大鼠或小鼠是推荐的模型系统。这类研究没有性别偏好。暴露后应收集粪便4天，并确定清除和保留的纳米材料的数量。特别是GALT，肠系膜淋巴结和肝脏应该分析纳米颗粒的存在。如果从胃肠道吸收的纳米材料接近于零，则不需要评估口服纳米材料的全身影响。然而，如果纳米材料明显吸收，建议使用肺暴露后各器官系统的组织学和功能测定来评估系统毒性。

4.3.4注入—第1层

一些纳米材料正在被评估为药物输送系统。在这种情况下，应该评估注射后这种纳米材料的潜在毒性。大鼠或小鼠是推荐的模型系统。这些研究没有性别偏好。如果可能，应注射标记纳米颗粒，暴露后一周应监测其分布到各个器官(肝脏、脾脏、心脏、骨髓、肾脏和肺)和在粪便中的消除情况。各器官系统的组织学和功能检测(如线粒体功能)应在肺暴露后进行(第4.3.1.4节)。

4.3.5皮肤暴露-第1层

对于纳米材料的皮肤吸收，应该使用最合适的动物模型。老鼠是最常见的，但兔子、豚鼠和猪也被用来评估毒性和刺激性。推荐鼠和猪作为动物的选择。这种老鼠很小，并且已经通过其他接触途径在毒理学领域建立了数据库，因为这种小物种所需的纳米材料较少。通常，家猪被用于吸收研究，因为其皮肤在解剖学、生理学和生物化学上与人类皮肤相似。在使用纳米材料的24小时前，应修剪背部的区域(体表的10%)以去除毛发。以对数间隔给药三次(mg/cm²)加对照(载体对照、无物质对照和阳性对照)应同时应用于正常皮肤和磨损皮肤，以模拟人类暴露的情况。这种材料应该以封闭的方式使用，因为与许多化学物质不同，纳米材料不会立即被皮肤吸收。用于防止纳米材料脱落的遮挡装置(部位保护)应通过无刺激性胶带附着在皮肤表面。在24小时内，每组/剂量至少4-6只动物，加上对照和载体对照。在0.5、1、2、4、8和24小时，应使用Draize测试分数对治疗部位的红斑和水肿进行评分。皮肤活检应采取透射电子显微镜，以确定细胞变化，以及定位穿透颗粒在皮肤内。光学显微镜可用于评估由于纳米材料的急性毒性而可能发生的形态改变，但这不会检测纳米材料的定位。对于重复暴露，纳米材料应每天应用5或7天，并可持续到28天。这可能取决于可用纳米材料的类型和数量。如果计划进行28天的研究，则应进行每日临床观察。 At termination, hematology, clinical chemistry, evaluation of local lymph nodes and an immunotoxicology battery of tests should be performed. Standard full necropsy exam (liver, kidney, etc) should also be conducted [183，184］．研究的具体目标，皮肤吸收或刺激，将决定具体的研究设计(例如，研究持续时间，收集的样本)。

4.3.6研究空白

存在显著的研究差距;以下清单中的前四项涉及有关纳米材料生产、使用和暴露的一般信息需求，这将有助于毒性试验的设计。

1. 1.

   纳米技术产业正在制造什么，制造的数量是多少?

2. 2.

   工作场所可能的暴露水平是多少?

3. 3.

   可能的接触途径是什么?

4. 4.

   什么是职业暴露和环境暴露?

5. 5.

   放射性标记粒子是研究沉积、易位和生物持久性所必需的。这需要特定的实验室，可以工作和检测标签材料;许多材料的标签是不可行的。

6. 6.

   研究人员应该可以获得参考纳米材料的来源。

4.3.7建议

1. 1.

   研究涉及在体外(非细胞性和细胞性)，肺，口服，注射和皮肤暴露建议在Tier 1测试。

2. 2.

   在生产、使用和处置过程中，动物模型中的暴露必须与已知的人类暴露相关。

3. 3.

   建议接触途径与生产、使用和处置过程中预期的人类接触有关。

4. 4.

   建议试验材料应充分表征，最好是在交付给动物时。

5. 5.

   肺部暴露后，建议测量的终点包括炎症、氧化应激和细胞增殖的器官特异性标记物(如线粒体)和肺组织病理学以及对非肺器官损害的测量。

6. 6.

   涉及a)易感模型的使用，b)多重暴露，c)沉积、易位和生物持久性的评估，d)生殖效应，以及e)机制基因组和蛋白质组学技术的研究可以考虑用于第2级测试。

对人类健康构成潜在风险的工程纳米材料包括那些能够进入人体并表现出与其纳米结构相关的生物活性的纳米材料。基于纳米材料的产品，如纳米复合材料、表面涂层和电子电路不太可能产生直接风险，因为潜在的暴露风险很低，甚至可以忽略不计。最有可能带来健康风险的纳米材料是纳米颗粒、纳米颗粒的凝聚体和纳米结构材料的颗粒(其中纳米结构决定行为)。在每一种情况下，空气和液体悬浮液或泥浆中的材料都存在接触的可能性。

认识到对纳米材料潜在毒性的认识尚处于早期阶段，而且关于可能是毒性指标的特定纳米材料特性的知识很少，本文件概述的筛选策略的要素包括一个重要的研究组成部分。推荐测试的范围和程度反映了这种知识的发展状态。筛查策略的要素是明确的，但随着这些早期筛查/研究的结果的出现，详细的方法将不断发展，变得更加有针对性和选择性。只有随着知识的增长，才有可能对所提出的“要素”进行更彻底的讨论，并制定更可靠、更详细的战略。在前面的章节中已经详细介绍的纳米毒性测试策略的要素总结如下。

物理化学特性

对毒性筛选试验中使用的纳米材料进行适当的物理化学表征是至关重要的，如果要解释与材料性质有关的数据，进行的不同研究之间的相互比较，并得出关于危害的结论。纳米材料行为对物理和化学性质的依赖对物理化学表征提出了严格的要求，包括评估一系列性质，包括粒径分布、团聚状态、形状、晶体结构、化学成分、表面积、表面化学、表面电荷和孔隙率。精确的要求会有所不同在活的有机体内而且在体外研究，并根据物料的输送路线或方法。此外，描述人类辐射还提出了第三组要求。

广泛的分析方法适用于纳米材料，并鼓励多学科合作，以确保采用适当的方法。特别要考虑到透射电子显微镜的使用，在许多情况下，它可以被认为是表征纳米颗粒的金标准。此外，在所有情况下都应记录纳米材料的生产、制备、存储、异质性和团聚状态等信息。给药后纳米材料的表征在体外或在活的有机体内在筛选研究中被认为是理想的，尽管目前在分析上存在重大挑战。因此，在大多数筛选试验中，建议对给药材料进行表征。仅根据生产或供应对纳米材料进行表征，仅在前两种方法不可行的情况下才被认为是合适的。在所有筛查研究中，剂量应根据适当的指标进行评估。感兴趣的三个主要物理指标是质量、表面积和粒子的数量浓度:鉴于目前对每一个相关性的不确定性，重要的是，在任何给定的研究中，这三个指标都是可测量或可推导的。

在体外测试方法

在体外毒性试验可迅速获得数据，并可对毒性机理提供重要的见解和确认在活的有机体内效果。我们建议广泛使用在体外测试将应用于与纳米颗粒暴露相关的潜在危险相关的关键研究问题。广泛的在体外现有的方法可以与纳米颗粒毒性的不同方面的具体问题相匹配。非细胞检测可以提供生物持久性、颗粒表面自由基生成和体液系统(如补体系统)激活等方面的信息;计算毒理学方法也可能有用。以细胞为基础的系统可以包括单个培养或共培养的细胞系和新鲜来源的原代细胞。器官培养和心肺准备对研究纳米颗粒效应和易位也可能有用。我们建议在体外测试应反映纳米颗粒可能影响的不同入口和目标器官，包括肺、皮肤、粘膜、内皮、血液、脾脏、肝脏、神经系统和心脏。如往常一样，在解释从在体外系统由于通常使用的高剂量在体外以及大丸效应的影响。的结果应该包含适当的基准粒子以上下文化在体外化验。我们建议警惕纳米颗粒所特有的人为效应，这种人为效应是由其大的吸附表面引起的，它可以耗尽细胞产物或分析成分，从而混淆分析结果。除了利用现有的测试系统，我们建议开发新的分析方法，例如研究纳米颗粒在细胞层间的传输。

在活的有机体内测试方法

为在活的有机体内纳米材料的测试，两个层次的研究被讨论。第1级研究将涉及肺、口服、注射和皮肤暴露，这与所关注的人体暴露有关。关键的第一步在活的有机体内测试是对测试材料的充分表征。肺部暴露关注的终点包括肺部炎症、氧化应激、细胞增殖和组织病理学的有机特异性标志物，以及对非肺部器官损害的测量。2级肺暴露研究是推荐的，但不是强制性的。这些研究将为纳米材料的完整风险评估提供有用的信息。第二级研究包括:1)易感模型的使用，2)多次暴露的影响，3)沉积、易位和生物持久性研究，4)生殖影响评估，5)采用基因组和蛋白质组学技术的机制研究。

的测试策略在活的有机体内如果接触剂量、接触途径和粒子特征与人类接触的情况非常相似，那么研究对危害识别和风险评估将最有价值。因此，了解特定纳米材料的生命周期，即生产过程中的暴露、使用时的暴露和环境暴露，是一项关键的研究需求。

该项目由美国环境保护署污染预防和有毒物质办公室通过与ILSI研究基金会/风险科学研究所的X-82916701合作协议资助。

ILSI研究基金会/风险科学研究所要感谢伍德罗·威尔逊国际学者中心，新兴纳米技术项目——与皮尤慈善信托基金会合作创建——主办了一次会议，使科学和监管界注意到这一报告。

美国环境保护署的David Mustra对第3.0节文献综述做出了重要贡献。

作者及隶属关系

1. 罗切斯特大学环境医学系，埃尔姆伍德大道601号，邮政信箱EHSC，罗切斯特，NY, 14642，美国

   Gunter Oberdorster

2. 新兴纳米技术项目，伍德罗·威尔逊国际学者中心，西北宾夕法尼亚大道1300号，华盛顿特区，20004-3027，美国

   安德鲁·梅纳德

3. MRC/爱丁堡大学炎症研究中心，ELEGI柯尔特实验室女王医学研究所，小法兰西新月47号，爱丁堡，EH16 4TJ，英国

   肯•唐纳森

4. 美国WV州摩根敦Willowdale路1095号国家职业安全与健康研究所健康影响实验室病理生理学研究分部，美国WV州，26505

   文森特Castranova

5. 风险科学研究所，ILSI研究基金会，国际生命科学研究所，托马斯圈一号，北西，900室，华盛顿特区，20005-5802，美国

   朱莉·菲茨帕特里克和斯蒂芬·奥林

6. 生物与环境纳米技术中心，MS-63，邮政信箱1892，莱斯大学，休斯顿，德克萨斯州，77251-1892，美国

   凯文Ausman

7. 呼吸/吸入毒理学，中央产品安全，宝洁公司，邮政信箱538707，辛辛那提，OH, 45253-8707，美国

   珍妮特卡特

8. 美国环境保护署研发办公室，Ariel Rios大楼，邮编:美国华盛顿特区西北宾夕法尼亚大道1200号8722F，邮编:20460

   芭芭拉圆锥形石垒

9. 新兴纳米技术项目，伍德罗·威尔逊国际学者中心，西北宾夕法尼亚大道1300号，华盛顿特区，20004-3027，美国

   芭芭拉圆锥形石垒

10. 吸入生物学研究所和焦点网络:气溶胶与健康，GSF国家环境与健康研究中心，因戈尔施塔特大街1,85764,Neuherberg，慕尼黑，德国

    沃尔夫冈·克雷林

11. 风险评估部，污染预防和有毒物质办公室，美国环境保护署，7403M, 1200宾夕法尼亚大道，西北，华盛顿特区，20460，美国

    大卫·赖

12. 化学毒理学和药物动力学研究中心，北卡罗莱纳州立大学兽医学院，美国北卡罗来纳州罗利希尔斯堡街4700号，27606

    南希Monteiro-Riviere

13. 杜邦哈斯克尔健康与环境科学实验室，美国DE纽瓦克埃尔克顿路1090号邮箱50号，邮编19714-0050

    大卫Warheit

14. 罗彻斯特大学化学工程系，加维特厅253，纽约罗彻斯特，14627，美国

    香港杨

财团

相应的作者

对应到朱莉·菲茨帕特里克．

6.0利益竞争

作者声明他们没有相互竞争的利益。

7.0作者贡献

Günter Oberdörster担任纳米材料毒性筛选工作组主席。安德鲁·梅纳德担任物理化学特性小组的主席，肯·唐纳森担任在体外测试方法子小组，Vincent Castranova担任主席在活的有机体内化验亚群体。Julie Fitzpatrick为ILSI研究基金会/风险科学研究所管理了这个项目6）.

开放获取本文由BioMed Central Ltd授权发布。这是一篇开放获取文章，根据创作共用归属许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是正确地引用原始作品。

转载及权限