对阿米巴和甲硝唑有较高抗药性的gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba主要见于精神分裂症患者gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

酵母菌属gydF4y2BaSp.是肠道最常见的定殖体之一，与伴随的肠道细菌有很强的相互作用。此前，从肠易激综合征(IBS)个体中分离出的原生动物显示出改变的表型特征，这表明它可以被触发成为致病性。先前的研究报告了肠道菌群的改变和高患病率gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba精神分裂症患者。然而，表型特征gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba特别是从SZ个体中分离出来的尚未被描述。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

在这项研究中，筛选了50名严重精神分裂症(SZ)患者和100名非精神分裂症(NS)患者的粪便样本gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.感染。对阳性分离株进行基因型和表型鉴定。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们发现50个SZ个体中有12个(24%)被检出，100个NS个体中有5个(5%)被检出gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba体外培养和PCR方法均为阳性，与年龄和性别无显著相关性。在15株分离株中，ST3亚型最多(66.7%)，其次是ST1(20%)和ST6(13.3%)。SZ个体的分离株生长速度明显较慢(34.9±15.6 h)，细胞直径范围较大(3.3 ~ 140µm)。我们在SZ分离株中检测到更高的阿米巴形态和甲硝唑耐药性，细胞表面糖蛋白变化，其中98%的SZ细胞对Concavalin A染色表现出一致的中至高结合亲和力(+ 2至+ 3)，而NS分离株仅表现出76%的高凝集素(+ 3)结合亲和力。半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶水平主要见于SZ分离株。我们还证明了金属蛋白酶的存在gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba特别是在NS分离株中。与NS分离株相比，来自SZ分离株的可溶性抗原的引入使HCT116细胞的增殖增加了两倍。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究结果表明gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从SZ个体分离的sp表现出表型变异，特别是在形态和耐药性方面。结果表明，肠道环境(SZ和NS)和SZ的处理可能影响了小鼠的表型gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp。gydF4y2Ba

图形抽象gydF4y2Ba

酵母菌属gydF4y2BaSp.是在粪便中发现的最常见的肠道原生动物。据报道，该微生物的流行率约为0.5-23% [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，而在第三世界国家，患病率约为22.1-100% [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2BaSp.是一种多态生物，主要以液泡、颗粒、变形虫和囊肿形式存在于肠道中[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．它通常与非特异性胃肠道症状有关，如轻度腹泻、胀气、体重减轻和腹部痉挛。没有出现上述症状的受感染人士，通常称为无症状携带者[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

关于是否gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba细菌是一种病原体仍有争议。在过去的十年中，一些研究报告了某些亚型的潜在致病性和毒力gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.，特指ST1 [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]， st3 [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba], ST4 [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]及ST7 [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．微生物作为病原体的特征包括表面蛋白的类型[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]、超微结构形式[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，阿米巴形[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，以及蛋白酶活性[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．虽然gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba来自不同微生物环境的sp在形态上有差异[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，这种联系仍不确定。需要收集更多的数据来建立结论性的联系。gydF4y2Ba

精神分裂症(SZ)是一种神经精神疾病，影响全世界0.5-1%的人口[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．马来西亚的SZ发病率约为0.4% [gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．SZ的病因尚不清楚，常被认为是遗传、环境等多种因素共同作用，导致大脑异常[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．此前，寄生虫感染等gydF4y2Ba刚地弓形虫gydF4y2Ba已被确定为SZ的危险因素[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．最近，研究的重点转向了肠道微生物群及其通过肠脑轴影响脑化学的能力。据报道，深圳个体的肠道微生物群与健康个体不同，许多研究报告了深圳个体的肠道生态失调[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．虽然越来越多的NGS研究文献表明，与对照组相比，SZ个体之间的α-多样性没有差异，但在特定细菌属丰度不同的SZ之间，β-多样性的显示存在显著差异，如gydF4y2Ba普氏菌gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba拟杆菌gydF4y2Ba举几个例子[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．最近的一项研究表明55%的人患有gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba伊朗住院男性精神分裂症患者的感染情况[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]尽管在一般人群中的患病率仅为3.33-23.6% [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．流行数据gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba马来西亚的SZ患者很少。的特点gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从这些具有不同肠道菌群特征的患者中分离出来的sp还有待鉴定。gydF4y2Ba

在本研究中，我们调查了gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba在马来西亚雪兰莪城市护理家庭的慢性SZ患者中，评估了表型和基因型的差异gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp与NS个体比较。gydF4y2Ba

样本收集队列gydF4y2Ba

根据结构化临床访谈(SCID)和精神障碍诊断与统计手册第四版，文本修订版DSMIV-TR(由认证精神病学家进行)对参与者进行评估和诊断，并根据临床整体印象量表(CGI)进行分组。在招募前2 - 3周服用过任何抗原生动物和抗生素药物的患者被排除在研究之外。根据《赫尔辛基宣言》，收集粪便样本获得了马来西亚吉隆坡马来亚大学医学中心医学伦理委员会(UMMC)(20191226-8107)和马来西亚国立大学研究伦理委员会(UKM PPI/111/8/JEP-2020-725)的伦理批准。在样本采集之前，所有参与者都获得了书面同意。在样本收集之前，进行了一系列问卷调查，包括标准人口统计学问题以及有关胃肠道症状的问题。从位于雪兰莪州八打灵查亚的四个不同的护理院随机收集了50份慢性SZ (CGI 7)患者的粪便样本。所有患者均为pupum和pupukm的门诊患者，在采集粪便样本期间均在接受抗精神病药物治疗。此外，从患有一系列其他疾病的参加PPUM的平均年龄相似的志愿者中收集了共100份粪便样本，并用作内部对照，非精神分裂症(NS)。这些志愿者被各自的医生通过一系列问卷和患者医疗档案证实没有精神分裂症病史/症状(CGI 0)或任何药物使用史。gydF4y2Ba

的筛选、分离和培养gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp。gydF4y2Ba

对粪便样本进行筛选gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.采用xenic培养法(XCD)在Jones培养基中进行体外培养的感染[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]和传统的聚合酶链式反应(PCR)技术。豌豆大小(≈250mg)的粪便样本在添加10%马血清的Jones培养基(JM)中培养(Gibco Laboratories, Life Technologies, New York, USA)，并在37°C下培养。积极的文化gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2BaSp.传代培养，每3天培养至少1个月，然后分析其表型特征。gydF4y2Ba

粪便基因组DNA提取及PCR筛选gydF4y2Ba

豌豆大小(≈250mg)的粪便样本根据制造商说明使用QIAamp Power Fecal Pro DNA试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany)进行DNA提取。提取的DNA用Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳进行定量和纯度分析。以KAPA (ROCHE, Mannheim, Germany)主mix 18 μl，模板DNA 1 μl，正向引物BL18SPPF1 5′-AGTAGTCATACGCTCGTCTCAAA-3′和反向引物BL18SR2PP 5′-TCTTCGTTACCCGTTACTGC-3′为20 μl的反应量进行筛选gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2BaSp .根据先前建立的研究调整方案[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．根据亚型不同，扩增子的范围在320-342 bp之间，这些扩增子被送去测序以进一步确认物种。gydF4y2Ba

DNA提取用于遗传分析gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.隔离gydF4y2Ba

第3天细胞培养沉淀物用磷酸盐缓冲盐水(PBS) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)洗涤三次，并重组至最终体积为250µl。根据制造商的方案，使用InstaGene Matrix (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)提取和纯化总DNA。提取的DNA模板采用常规PCR分型，引物为BhRDr 5 ' -GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3 '和RD5 5 ' -ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3 '，得到该基因600bp区域的扩增子gydF4y2Ba半导体存储器gydF4y2Ba的-rRNA基因gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp。gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．网上工具(gydF4y2Bahttps://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_blastocystis_seqdef&page=sequenceQuerygydF4y2Ba)用于进一步分配等位基因。引物BhRDr和RD5生成的所有序列均存入GenBank，登录号为ON564757-ON564771。gydF4y2Ba

增长概况gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp。gydF4y2Ba

培养3天gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba将sp分离物合并，用1× PBS冲洗。共1 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba的gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.细胞接种于含有JM和10%马血清的微量离心管中，最终体积为1ml，在37°C下孵育10天。所有实验均重复进行三次。gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba利用血细胞计室(改良Neubauer, Hausser Scientific, PA, USA)排除0.4%台盼蓝染料(Sigma-Aldrich, MO, USA)根据形态(液泡、颗粒状和变形虫状)对sp细胞进行10天的计数。如其他地方所述，计算24小时的生成时间(GT) [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．从每个区域随机选取100个细胞来测量细胞直径。gydF4y2Ba

FITC染色用于表面碳水化合物定量gydF4y2Ba

所有gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.菌株(SZ:gydF4y2BangydF4y2Ba= 9, ns:gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)从培养第3天开始，按照之前研究的方案进行表面碳水化合物定量[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．第3天细胞沉积物用PBS冲洗2次(900×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 5分钟)，然后稀释至50 μ l，含10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba百万的细胞。取50µl fitc凝集素溶液(2 mg/ml Concanavalin A, Sigma, MO, USA)加入稀释后的细胞，37℃孵育30分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba， 5分钟)，用PBS冲洗两次。用PBS将颗粒重组至50 μ l的体积，用荧光显微镜(Leitz, Wetzlar, Germany)在× 400放大倍率下检查10 μ l的体积。随机选择100个细胞，使用亮度刻度(0,1 +，2 +，3 +，其中0表示无荧光，3 +表示荧光最强)进行荧光视觉强度测试。gydF4y2Ba

可溶性抗原的提取gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp。gydF4y2Ba

纯化gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba使用Ficoll-Paque密度梯度离心法获得细菌污染可忽略的sp细胞，并使用先前研究中描述的冻融循环提取可溶性抗原[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．用液氮对细胞球团进行30次冻融循环(1个循环为:先在液氮中浸泡1 min，然后在37℃的水浴中浸泡1 min)。然后将裂解液放置在4°C过夜，然后使用Bradford Assay进行过滤器灭菌和蛋白质定量。aliquote增溶抗原储存在- 20°C以备将来使用。gydF4y2Ba

蛋白酶活性测定gydF4y2Ba

蛋白酶活性gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp抗原采用偶氮酪蛋白比色法(1.5 mg/ml)进行研究，如先前报道[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．将可溶性抗原的浓度标准化至0.1 mg/ml。抗原用二硫苏糖醇(DTT) (2 mM) (Sigma-Aldrich, MO, USA)在37°C孵育蛋白酶10分钟。100微升抗原加入100 μ l预热的偶氮酪蛋白溶液中，在37°C孵育1小时。用300 μ l冰冷的三氯乙酸(Sigma-Aldrich, MO, USA)停止反应，然后冰孵育(30分钟)，8000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba然后用500 μ l 500 mM NaOH处理上清液，并在440 nm处进行吸光度读数(Infinite 200 Pro Nanoquant, Tecan, Mannedorf, Switzerland)。所有实验均为三重复。在沸水中灭活15分钟的细胞裂解液作为阴性对照，而胰蛋白酶(0.1 mg/ml) (Corning, MO, USA)作为阳性对照。gydF4y2Ba

使用蛋白酶抑制剂测定特异性蛋白酶活性的抑制试验gydF4y2Ba

采用蛋白酶抑制试验，研究其中最常见的蛋白酶类型gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.根据以往研究从SZ群中分离出来[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．分别使用优化浓度的蛋白酶抑制剂E-64 (0.1 mM) (Sigma-Aldrich, MO, USA)、苯甲基磺酰氟(PMSF) (1 mM) (Sigma-Aldrich)、碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)和EDTA(金属蛋白酶抑制剂)(1 mM) (Sigma-Aldrich)来测量半胱氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶的蛋白酶活性。将100 μ l抗原(0.1 mg/ml)与不同的蛋白酶抑制剂在37°C下与偶氮酪蛋白(5 mg/ml)孵育1小时。根据上一节的方案，用三氯乙酸、冰孵育和氢氧化钠(500 mM)处理所得到的混合物。加入不同抑制剂后蛋白酶活性抑制率计算公式为:gydF4y2Ba\(蛋白酶抑制率=\frac{P-Pi}{C}*100\)gydF4y2Ba在哪里gydF4y2BaPgydF4y2Ba:不含抑制剂的细胞裂解物蛋白酶活性;gydF4y2BaπgydF4y2Ba:加入特异性抑制剂偶氮酪蛋白作为底物后的蛋白酶活性。gydF4y2Ba

耐药性研究gydF4y2Ba

三天的文化gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba本小节使用sp分离株。gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp分离物标准化浓度为1 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba在添加10%马血清的新鲜琼斯培养基中，甲硝唑浓度范围为(0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mg/ml)。每天监测和记录细胞的生长和形态(阿米巴、液泡和颗粒状)，持续10天。gydF4y2Ba

结肠细胞培养增殖研究gydF4y2Ba

溶解抗原的作用gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba对结肠癌细胞(HCT116)的作用进行了研究[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．在含有l -谷氨酰胺(Corning)和抗生素的全培养基RPMI中培养和维持HCT110细胞，并添加5%胎牛血清(FBS) (Gibco Laboratories, Life Technologies, NY, USA) [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．将1000个细胞接种于96孔板中100 μl的生长培养基中，在37℃5% CO中孵育过夜gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．第二天，从每个分离物中提取的可溶性抗原(最终浓度:0.01µg/ml)被引入每个孔中的细胞。在额外处理48小时后，通过MTT法计算细胞增殖[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]用下面的公式，gydF4y2Ba\(\mathrm{细胞增殖}\左(\mathrm{\%}\右)=\frac{x-c}{c} \乘100\)gydF4y2Ba式中，x =可溶性抗原处理后HCT116细胞孔的平均OD;c = PBS +细胞裂解液洗涤处理后HCT116细胞孔的平均OD值。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有统计分析均使用IBM SPPS软件(version 23, NY, USA)和Microsoft Excel 2019 (Redmond, WA, USA)进行。统计学显著性的阈值为gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba

酵母菌属gydF4y2Ba精神分裂症患者的患病率gydF4y2Ba

采用Jones培养基的xenic培养法和PCR法检测到SZ人群的患病率为24%(12/50)。单独而言，在SZ样品中，两种方法的灵敏度均为83%(10/12)，每种方法分别不能检测到两种不同的分离株。另一方面，NS队列组XCD和PCR的总患病率均为5%。虽然有显著的差异(费雪的确切测试:gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0004)gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp. SZ和NS之间的感染，无年龄相关性[曼-惠特尼gydF4y2BaUgydF4y2Ba(17) = 25.500，gydF4y2BaZgydF4y2Ba=−0.476，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.646]和性别(费雪的确切检验:gydF4y2BaPgydF4y2Ba> 0.05)与gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba在统计分析期间观察到sp感染(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。在我们的研究中，我们没有观察到XCD和PCR检测方法的敏感性有显著差异。然而，我们的结果表明，当两种方法并行运行时，可以达到100%的灵敏度。gydF4y2Ba

所有12个深圳人都呈阳性gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp没有表现出或报告任何胃肠症状。另一方面，所有5个NS个体都呈阳性gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp是从有症状的非特异性胃肠道问题(腹痛、腹胀和恶心)或大便疏松的个体中分离出来的。gydF4y2Ba

的基因型分析gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba来自SZ和NS的分离株gydF4y2Ba

基于小亚单位核糖体RNA基因分析(gydF4y2Ba半导体存储器gydF4y2Ba-rRNA)，共15个gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp分离株分子特征显示ST1(20%， 3/15)、ST3(66.7%， 10/15)和ST6(13.3%， 2/15)。10株SZ分离株中，除SZ6和SZ10为亚型1外，其余8株为亚型3。5株NS分离株中2株为ST3和ST6，其中NS1属于ST1。卡方检验:gydF4y2BaχgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 2.179, df = 2，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.36表示亚型频率与队列组(SZ或NS)无显著相关性。我们发现了一些不同的gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba我们样本中的亚型等位基因。ST3分离株携带34个等位基因占90%，1个分离株携带36个等位基因占90%。有趣的是，ST3亚型内变异仅在SZ队列组中观察到。来自NS队列组的ST6分离株均具有不同的等位基因(122和139)。ST1菌株均为等位基因4，未见亚型内变异。所有序列已存入GenBank(登录号:ON564757-ON564771)。gydF4y2Ba

发展概要gydF4y2Ba

一共有14个gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.菌株(SZ:gydF4y2BangydF4y2Ba= 9, ns:gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)进行10天的生长剖面和形态测量研究(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S2)。总体而言，NS分离株始终表现出较高的生长峰，而SZ分离株生长峰范围较广，大多数生长峰较低。三分之一的SZ菌株(SZ5、SZ6和SZ7)的峰值最高，分别为1.8、1.9和1.7 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/毫升。与SZ菌株相比，NS菌株生长迅速[Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba(14) = 4, z =−2.467，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.014]，平均生成时间为17.31±5.4 h，细胞较小，直径一致(3.3-34µm)。另一方面，SZ菌株的生成时间较长，为34.9±15.1 h。通常情况下，SZ菌株的细胞直径明显更大gydF4y2BatgydF4y2Ba测试:gydF4y2BatgydF4y2Ba(12) = 2.578，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.024]最大直径约140µm(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S1)。更多的变形虫形式[曼-惠特尼gydF4y2BaUgydF4y2Ba(10) = 7，gydF4y2BaZgydF4y2Ba=−3.408，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.001)与NS菌株相比，SZ菌株在第3天之后也观察到。gydF4y2Ba

凝集素染色gydF4y2Ba

SZ和NS分离株主要表现出对FITC-ConA的高荧光强度(AFU2±FU3 +) (2 mg/ml)(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S3)。然而，NS分离株表现出更广泛的荧光强度范围，大多数NS分离株(NS1-NS4)比所有SZ分离株具有更强的结合亲和力。SZ分离株之间没有弱结合(AFU 0)， NS分离株之间存在明显的低凝集素结合，AFU 0 [Mann-Whitney U(14) = 9，gydF4y2BaZgydF4y2Ba=−2.51，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.012])和AFU + 1 [Mann-Whitney .gydF4y2BaUgydF4y2Ba(14) = 6.5，gydF4y2BaZgydF4y2Ba=−2.182，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.029)。在两个NS分离株(NS3和NS4)和两个SZ分离株(SZ5和SZ9)中观察到细胞的凝集(附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S2)。gydF4y2Ba

耐药性gydF4y2Ba

所有gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.菌株用两种不同浓度的甲硝唑处理(1 mg/ml或0.0001 mg/ml，图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．总的来说，SZ分离株对抗生素表现出更强的耐药性，即使在1 mg/ml的甲硝唑浓度较高时也能观察到更高的细胞计数[独立]gydF4y2BatgydF4y2Ba测试:gydF4y2BatgydF4y2Ba(10) = 4.691，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0002]gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).此外，在所有甲硝唑处理中，SZ菌株能够维持和增殖超过第10天，而大多数NS菌株在第10天左右死亡。在0.001 mg/ml时，SZ和NS均无显著差异[相互独立]gydF4y2BatgydF4y2Ba测试:gydF4y2BatgydF4y2Ba(10) = 4.31，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.345]对甲硝唑耐药，在添加0.001 mg/ml甲硝唑的培养基中，与未加抗生素处理的对照相比，平均生成时间最大限度地增加和减少。甲硝唑处理显著增加了SZ菌株的阿米巴形态。与NS菌株相比，SZ菌株中阿米巴形态的百分比更多(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab). Mann-Whitney (gydF4y2BaUgydF4y2Ba)试验显示，SZ和NS在1 mg/ml和0.0001 mg/ml浓度甲硝唑处理后，观察到的阿米巴形态百分比有显著差异。在甲硝唑治疗期间，阿米巴形态增加了2-16%。在0.01 mg/ml甲硝唑的作用下，SZ分离株的阿米巴型最高[Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba(19) = 5，gydF4y2BaZgydF4y2Ba=−3.514，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0004)。此外，在甲硝唑处理后，两个菌株均观察到更多的颗粒形态。gydF4y2Ba

蛋白酶活性gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从SZ中分离得到的sp和HCT116细胞系的细胞增殖gydF4y2Ba

用偶氮酪蛋白法研究了其中的蛋白酶活性gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba特别来自深圳个人。一般情况下，总蛋白酶活性gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba来自SZ的sp.比来自NS的菌株低(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．9株SZ分离株中有7株表现出高蛋白酶活性，而约2 / 3的NS分离株具有高蛋白酶活性。Mann-WhitneygydF4y2BaUgydF4y2Ba以及gydF4y2BaUgydF4y2Ba(14) = 14.00，gydF4y2BaZgydF4y2Ba=−1.133，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.257, SZ和NS的总蛋白酶活性差异不显著。蛋白酶抑制试验表明有显著性[方差分析:gydF4y2BaFgydF4y2Ba(3.35) = 3.196，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.037]在SZ分离株中，半胱氨酸抑制剂如E-64和碘乙酰胺对蛋白酶活性的抑制作用尤其明显，这表明半胱氨酸蛋白酶具有优势(图gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).相比之下，EDTA对NS菌株的高抑制作用表明金属蛋白酶占优势。独立的gydF4y2BatgydF4y2Ba-test分析SZ组与NS组蛋白酶抑制的显著性差异。PMSF对蛋白酶的抑制作用有显著差异[gydF4y2BatgydF4y2Ba以及:gydF4y2BatgydF4y2Ba(12) = 2.201，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.044)和E-64 [gydF4y2BatgydF4y2Ba以及:gydF4y2BatgydF4y2Ba(12) = 2.546，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0。在两个队列组之间。这表明，半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶活性显著提高gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从SZ个体分离。gydF4y2Ba

我们试图研究可溶性抗原(0.01µg/ml)处理HCT116癌细胞株后对细胞增殖的影响gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.我们的结果(图;gydF4y2Ba7gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)表明，在引入两个队列组的可溶性抗原后，癌细胞增殖平均升高，尤其是在SZ分离株中。gydF4y2Ba

肠道微生物群是一个由数万亿微生物组成的联合体，包括细菌、真菌和原生动物gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp。gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．殖民的gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba与多种胃肠道问题有关，如肠易激综合征[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]、溃疡性结肠炎[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，以及结直肠癌[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．过去的研究报告了表型变异gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2BaSp.从不同来源分离出来时[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．这归因于肠道微生物群的变化。从不同肠道微生物群中分离出来的原生动物表现出不同的表型和基因型特征，对这些变异的评估对于理解与微生物致病潜力相关的模式至关重要[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．在本研究中，我们首次研究了gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp从SZ和NS个体中分离出来，据报道它们的肠道微生物组成有显著不同[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．一项调查中国SZ高危人群肠道微生物群的研究报告显示，各个类群的相对丰度有所增加，特别是在gydF4y2Ba细菌性的gydF4y2Ba，gydF4y2Ba梭菌属的gydF4y2Ba,gydF4y2BaLactobacillalesgydF4y2Ba［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．另一项影响服用抗精神病药物的深圳患者的研究与上述发现一致，并报告了深圳患者中这些类群的增加[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．此外，涉及drug-naïve SZ患者抗精神病药物治疗前后的肠道微生物组研究报告，药物可导致进一步的肠道生态失调，可用于衡量SZ的严重程度[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．而抗精神病药物诱导的肠道菌群改变可能有助于肠道菌群的定植gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp仍然未知，不能完全排除。这是可能的肠道菌群处理SZ可能有助于定殖gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2BaSp.和促成了所见的形态差异。gydF4y2Ba

酵母菌属gydF4y2Basp.以前曾报道精神疾病患者感染在来自护理之家和康复中心的伊朗个人中流行率为4-55% [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．我们的研究报告显示gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba在慢性SZ患者中患病率为24%，这与越来越多的文献一致。伊朗的一项研究报告了SZ患者中ST3的患病率[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．同样，我们的结果表明ST3是两个队列组中最普遍的亚型，特别是在SZ分离株中(66.7%)。这种差异可以解释为不同地理位置亚型分布的差异，其中ST3主要分布在东南亚[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]，特别是在马来西亚[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．我们还在NS样本中观察到ST6(与来自鹧鸪和鹌鹑的ST6参考序列密切相关)。ST6感染在人类中很罕见，可能反映了以前报道的人畜共患传播病例[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在本研究中，SZ个体具有gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp感染没有报告或表现出任何明显的胃肠道症状，除了经常便秘，这是常见的，因为服用抗精神病药物[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．精神分裂症患者经常被报道对疼痛的敏感性降低[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]，确切的原因可能是多因素的，因为SZ的病因复杂。前额叶皮层的发育、背侧丘脑损伤、多巴胺或神经递质的改变是少数几个被认为在降低疼痛敏感性中起作用的因素[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．因此，我们推测这些因素可能导致对胃肠道疼痛的感知功能受损，因此SZ个体没有报告任何症状。此外，对具有较高IBS、结肠炎、胃炎和肠炎发生率的SZ个体进行尸检后研究[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]表明存在与胃肠相关的损害，由于疼痛敏感性降低，这些损害可能无法被发现。有可能由于疼痛敏感性降低，腹痛等症状没有被检测到。另一方面，多项研究表明，各种肠道原生动物感染没有症状性疾病[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．这也可能解释了深圳个体中没有任何胃肠道症状。gydF4y2Ba

在这次调查中，九分之六gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从SZ个体中分离出的sp生长速度较慢，直径较大，这与gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从有症状和肠易激综合征患者中分离出来[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．我们注意到，其余三个SZ分离株表现出明显的高生长峰，直径较小，常见于无症状分离株[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．这表明SZ分离株的生长特征在有症状和无症状分离株中表现出不一致的生长峰值。目前的研究结果与其他研究相矛盾gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从具有相同痛苦的宿主中分离出来的sp往往表现出相似的表型特征模式[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．需要更多的研究来进一步阐明SZ分离株之间生长特征的差异。不过，深圳市民易患上肠易激综合征[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba提出了我们的一些研究对象(SZ个体与gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba感染)也可能有未诊断的IBS，因此解释了大多数SZ之间的形态相似性gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.分离株和IBS分离株[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

cona FITC结合分析显示，来自两个队列组的大部分分离株均表现出高至中等荧光强度，但SZ分离株的荧光强度更一致。这一发现与之前的研究一致，报告表面碳水化合物的丰度gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．表面糖蛋白，如凝集素，对于粘附在肠粘膜上至关重要[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]以及与肠道细菌的相互作用[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]，并已被报道有助于微生物的致病性[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．此外，Con-A FITC染色以前被用于区分有症状(高荧光)和无症状菌株(低荧光)[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．高且一致的荧光在SZ分离株表明粗糙的表面拓扑类似于症状分离株，如gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba来自肠易激综合征患者[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．另一方面，NS分离株之间的荧光差异很大，这意味着NS5(低荧光)与无症状分离株的行为相似，而其余(高荧光)与有症状分离株的行为相似。在NS分离株之间观察到的变异可能是宿主依赖性的。gydF4y2Ba

甲硝唑耐药gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2BaSp.已变得越来越普遍[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．在我们的研究中，在0.001 mg/ml甲硝唑处理下，NS和SZ分离株的细胞生长急剧增加，这表明耐药性形成了之前报道的[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．这表明甲硝唑应谨慎使用，因为不适当的药物浓度可能导致耐药性[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．我们还观察到gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从SZ患者分离出的sp具有更强的体外耐受高甲硝唑浓度的能力。这表明在gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba当从SZ个体中分离出sp细胞时，这可能是因为这些分离物预先暴露于通常为SZ开的各种药物和抗精神病药物。药物的引入改变了肠道微生物群，以抵御更恶劣的环境[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．因此,gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从这种环境中分离出来的植物在恶劣的环境中也可能有更大的活力。研究证明肠易激综合征患者有60%的甲硝唑耐药[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba表明有症状的分离株对甲硝唑治疗更有耐药性。这些发现再次表明SZ分离株与症状分离株表现相似，特别是来自IBS个体的分离株。SZ菌株在较高浓度甲硝唑下的生存能力显示出更强的稳健性，并表明其传播和传染性的风险增加gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba当与这些个体隔离时。gydF4y2Ba

阿米巴形式通常与致病潜力有关，因为它们大多在有症状的分离株中发现[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba]，表面有粘性[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，并含有更多的蛋白酶[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．在阿米巴原虫中有较高的流行率gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从症状和肠易激综合征患者中分离出来[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．在目前的研究中，SZ菌株的阿米巴形态更加明显，特别是在甲硝唑处理期间。SZ分离株中阿米巴型的增加增加了这些分离株的致病性。这些寄生细胞也显示出较高比例的中高表面碳水化合物，表明与肠道细菌的相互作用增强。过去的研究已经报道了gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba吞噬肠道细菌[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]，并影响微生物的组成[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba，gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．最近的一项研究假设gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2BaSp.对无症状个体肠道内高度丰富的细菌类群具有掠食性[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．详细的宏基因组分析将揭示类似的效应是否见于gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba深圳个体间感染。此外，最近的研究表明，使用益生菌/益生元对SZ患者有积极影响[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．是否gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp是否会干扰SZ患者的这种干预也不清楚。gydF4y2Ba

我们的研究结果显示，SZ分离株的总平均蛋白酶活性低于NS分离株，尽管表现出更高的阿米巴形式。这与之前将阿米巴形式和蛋白酶联系起来的研究形成了对比[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．对这一观察结果的可能解释可能是由于在我们的研究中，我们在SZ分离株中看到了更低的阿米巴形式。体外和体内研究已经证实，应激诱导增强了小鼠的传染性gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba例如，囊肿数量激增、免疫反应抑制和应激介导的增强失衡[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．类似地，变形虫的增加也可能是对环境压力的另一种反应，比如抗精神病药物，以在恶劣的条件下生存。我们的发现进一步证实了之前的观点，即生命周期gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba某些形态(液泡、颗粒或变形虫)的sp和优势是寄主依赖的，受寄主肠道微生物环境的影响很大。gydF4y2Ba

蛋白酶从gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp据报道发挥多种作用，如降解粘膜IgA [gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]，破坏紧密连接，导致肠道通透性增加[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba]并通过IL8的调节增加炎症[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．半胱氨酸蛋白酶是其中经常报道的主要类型gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp。gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba］．在本研究中，我们注意到由于碘乙酰胺的抑制作用，SZ分离株中半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶活性较高。这些蛋白酶有助于原生动物的生存，并在肠道蛋白质如免疫球蛋白、血红蛋白和肠膜和肠壁的降解中起关键作用[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba，gydF4y2Ba89gydF4y2Ba］．半胱氨酸蛋白酶作为毒力因素，主要见于致病性菌株gydF4y2Ba痢疾阿米巴gydF4y2Ba［gydF4y2Ba90gydF4y2Ba］．虽然蛋白酶作为一种致病因子尚未在gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.，高水平与其他表型特征一起出现，提高了SZ分离株中病原体样品质的可能性。此外，还观察到较高的金属蛋白酶存在gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.，特别是在NS分离株中。虽然差异没有统计学意义，但观察结果表明，特定蛋白酶的优势可能受到分离来源的影响。据报道，金属蛋白酶在调节宿主免疫反应和寄生虫病的发病机制中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba91gydF4y2Ba］．全基因组测序gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba揭示了原生动物除了能产生20种半胱氨酸蛋白酶外，还能产生金属蛋白酶[gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba92gydF4y2Ba］．金属蛋白酶也已确定主要表达在症状gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.来自肠易激综合征个体的分离物[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们注意到，在用可溶性抗原治疗后，癌细胞的增殖普遍增强gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.细胞。在我们的研究中，可溶性抗原来自gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从SZ个体分离的sp促进细胞增殖2倍。一般来说，人源性半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶与癌细胞的增殖有关[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba］．胰蛋白酶、金属蛋白酶等宿主源性丝氨酸蛋白酶共表达促进结直肠癌侵袭转移[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba］．SZ中半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶的优势gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba在本研究中观察到sp分离物和机会感染gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba《儿童权利公约》的sp最近得到了证明[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba］．原生动物来源的蛋白酶是否有助于这种癌症的发病机制尚不清楚。目前，我们只了解到gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.半胱氨酸蛋白酶刺激IL-8分泌，提示肠道炎症[gydF4y2Ba97gydF4y2Ba，gydF4y2Ba98gydF4y2Ba］．然而，更多的证据表明分子机制gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba炎症和免疫调节中的sp蛋白酶活性是将这种生物与癌症发病机制联系起来所必需的。gydF4y2Ba

而目前的研究强调的独特特征gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp.当从SZ个体中分离时，它也意味着当该有机体传播给未受感染的个体时的风险，因为它们具有表明更大传染性和传染性的特征(增强阿米巴形式和甲硝唑耐药性)。一项研究显示，深圳门诊病人的医疗保健经常被忽视，与肠胃有关的问题亟需重视[gydF4y2Ba99gydF4y2Ba］．本研究表明，需要对该病进行诊断和治疗gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba特别是在SZ患者的常规健康筛查程序中，由于这种有机体的不确定趋势，当它变成机会性时，会引起症状性感染，这是不应忽视的。此外，马来西亚的许多SZ患者居住在精神病院和疗养院，在那里他们与许多其他居民住在一起。这些生活条件很容易促进疾病的传播gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba如果不加以检查，可能会传染给大量其他精神病人。gydF4y2Ba

本研究报告表型特征的变异gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从SZ患者中分离出来。我们的研究结果表明gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba从SZ个体分离的sp具有与症状分离株相似的特征，具有更高数量的阿米巴形式和对甲硝唑治疗的更强耐药性。这些发现增加了越来越多的文献，表明微生物的物理性质，如gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Ba肠道微环境对微生物的影响和改变很大，肠道定殖菌的生命周期具有寄主依赖性。我们的研究结果还强调，它可能很难根除gydF4y2Ba酵母菌属gydF4y2Basp分离自具有苛刻的肠道微生物群的个体，如甲硝唑治疗的SZ患者。这表明慢性SZ患者在社区内传播的风险更高，特别是在护理之家或卫生机构中。此外，SZ分离株中增强的致病性样品质增加了已存在结肠癌/直肠癌的SZ个体中加重癌症生长的风险。gydF4y2Ba

作者确认，支持这项研究结果的数据在文章中是可用的。支持本研究结果的原始数据可从通讯作者处获得，应合理要求。gydF4y2Ba

作者感谢马来亚大学寄生虫学系、马来亚秘鲁大学(PPUM)心理医学系、马来西亚马来西亚国民大学(PPUKM)精神病学系的工作人员，以及学生/实习生Kavilasha Venugopal小姐、Sareh Kamran小姐和Barathen Pillai先生在采样期间的协助。gydF4y2Ba

本研究由马来西亚高等教育部基本研究资助计划(FRGS/1/2019/SKK11/UM/01/2)资助。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 马来亚大学寄生虫学系，吉隆坡，50603，马来西亚gydF4y2Ba

   Freddy Franklin, Arutchelvan Rajamanikam和Suresh KumargydF4y2Ba

2. 马来亚大学医学微生物学系，吉隆坡，50603，马来西亚gydF4y2Ba

   Freddy Franklin, Arutchelvan Rajamanikam和Chandramathi Samudi RajugydF4y2Ba

3. 马来亚大学心理医学系，吉隆坡，50603，马来西亚gydF4y2Ba

   杰斯吉特·辛格·吉尔和本尼迪克特·弗朗西斯gydF4y2Ba

4. 马来西亚国民大学精神科，吉隆坡，50603，马来西亚gydF4y2Ba

   卢克云西成gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

概念化:FF, AR, SK;数据管理:FF;形式分析:FF, AR, SK;融资收购:SK;调查:FF;方法:FF;项目管理:FF & AR;资源:JGS、BF、LWSC;监管:AR、CSR、SK;验证:AR & SK; Writing—original draft: FF; Writing—review & editing: AR, CSR, & SK. All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba苏雷什·库马尔gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

根据《赫尔辛基宣言》，收集粪便样本获得了马来西亚吉隆坡马来亚大学医学中心医学伦理委员会(UMMC)(20191226-8107)和马来西亚国立大学研究伦理委员会(UKM PPI/111/8/ JEP-2020-725)的伦理批准。在样本采集之前，所有参与者或最近亲属都获得了书面同意。gydF4y2Ba

出版同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者之间没有利益冲突。作者没有任何商业或其他存在利益冲突的协会。gydF4y2Ba

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伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

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