摘要
背景
多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄妇女的一种复杂的生殖和内分泌疾病。绿薄荷(留兰香L.)具有抗雄激素活性,亚麻籽(亚麻属植物usitatissimumL.)含有植物雌激素,据报道可改善PCOS条件。本研究旨在评估这两种植物混合施用后PCOS的状况。
方法
24只周期有规律的大鼠随机分为4组,对照组(C)和治疗对照组(TC)给予留兰香薄荷提取物(SE) +亚麻籽提取物(FE)的组合。PCOS组和治疗(T)组通过单次肌注戊酸雌二醇诱导PCOS。治疗组在戊酸雌二醇注射7周后给予SE和FE联合治疗30天。监测发情周期10天,最后一天处死动物,采集卵巢进行组织形态学研究,测定血清孕酮、睾酮、雌二醇和脱氢表雄酮(DHEA)水平。
结果
与PCOS组相比,T组孕酮显著升高,睾酮和雌二醇显著降低,脱氢表雄酮无明显变化(p < 0.05).T组和对照组(C组和ct组)在评估激素方面无显著差异。与PCOS组相比,T组的原发、窦前和窦前卵泡明显增加。与PCOS组相比,T组囊泡数量减少。与PCOS组相比,T组颗粒层厚度增加,而膜厚度明显降低(p < 0.05).C组和TC组在内分泌和组织学上无明显差异。
结论
与PCOS组相比,亚麻籽和薄荷提取物的组合改善了T组卵巢的内分泌特征和组织形态学特征。
背景
多囊卵巢综合征(PCOS)是一种与高雄激素、高胰岛素血症和慢性无排卵有关的女性异质性生殖疾病,但其病因尚不清楚。内分泌、生殖和代谢系统受此综合征影响,此外,它是女性无排卵性不孕的主要原因[1,2].
虽然该综合征的主要病因尚不明确,但据报道,遗传、胰岛素抵抗、皮质醇代谢障碍、压力和雄激素分泌增加等因素与此有关[3.,4].
多囊症的主要问题是由于激素失衡导致的无排卵。与正常女性相比,PCOS患者的黄体生成素(LH)水平较高,但卵泡刺激素(FSH)水平较低[5].卵泡堆积、黄体缺失和卵巢体积升高是多囊症卵巢的一些显著症状[6].
不同的治疗药物,如二甲双胍,柠檬酸克罗米芬,糖皮质激素和芳香化酶抑制剂,如阿那曲唑,已被推荐用于多囊症治疗[7].据报道,这些药物的各种副作用,如恶心、腹痛和阴道出血[8].因此,今天对草药的使用更有趣,更有价值,更容易获得,在一些社区被广泛用于治疗甚至从疾病中恢复[9].植物含有几种不同的天然产物,其中一些具有较弱的雌激素或抗雌激素活性。这些化合物被称为植物雌激素,包括某些异黄酮,黄酮,二苯乙烯和木脂素。研究得最好的膳食植物雌激素是大豆异黄酮和亚麻籽木脂素[10].
绿薄荷和亚麻籽已被推荐用于治疗多囊症。绿薄荷具有抗雄激素作用,据报道,在用绿薄荷治疗多囊症患者后,睾丸激素水平显著降低[11,12,13].
在一项案例研究中,多囊症患者的雄激素水平在食用绿薄荷水酒精提取物后有所下降[11].在另一项研究中,绿薄荷对那些患有多毛症的人的影响已被揭示出FSH, LH和DHEA水平的降低[14].
亚麻籽也被推荐用于治疗内分泌失调和调节女性性激素[15].亚麻籽水酒精提取物可改善多囊症大鼠的内分泌状况[16].亚麻籽中最重要的成分是纤维、矿物质、维生素和植物雌激素(木脂素)[17,18].亚麻籽是一种非常丰富的膳食木脂素来源。亚麻籽中的木脂素含量可能会改变参与雌激素合成的关键酶(如芳香化酶)的活性,以调节循环性激素及其代谢物的相对水平[19,20.].此外,木脂素可以抑制5 α-还原酶(负责将睾酮转化为DHT的酶),从而改善PCOS患者的雄激素水平[15]植物雌激素的生物学活性与雌二醇相似,可与雌二醇受体结合,表达雌激素效应[15,19].有人提出,食用含有高水平木脂素的亚麻籽可促进睾酮在肠肝循环中的结合并增加其排泄[21]也会增加性激素结合球蛋白(SHBG)水平,从而降低游离睾酮水平[21,22].亚麻籽植物雌激素可能通过对LH的负反馈而降低睾酮水平[23].
因此,考虑到绿薄荷的抗雄激素特性和亚麻籽的植物雌激素特性,以及PCOS中类固醇激素的失衡,本研究旨在评估这两种植物联合给药对戊酸雌二醇诱导的PCOS大鼠内分泌特征和卵巢组织学改变的作用和影响。
方法
实验设计
这项研究是在伊朗设拉子大学国家动物伦理委员会的批准下完成的。此外,1980年11月24日欧洲理事会指令(86/ 609/ EC)关于实验目的动物保护标准的证明也被遵循。
成年雌性Sprague Dawley大鼠24只(200±20克),购自设拉子医科大学医学科学系比较与实验中心。选择生殖周期正常(3个周期后检查)的动物,随机分为4组,分别为对照组(C)(蒸馏水)、对照组(TC) (40 mg/kg绿薄荷水醇提取物+ 200 mg/kg亚麻籽提取物灌胃30 d)。接下来的两组,PCOS组和治疗组(T)通过单次肌注戊酸雌二醇(4 mg/只)诱导PCOS。治疗组给予绿薄荷提取物40 mg/kg +亚麻籽提取物200 mg/kg灌胃30 d,注射戊酸雌二醇7周后,PCOS组同期给予蒸馏水。动物饲养在标准聚丙烯笼中,温度20-22°C,湿度38%,光照/暗循环12/12小时,喂食标准颗粒饲料,免费获得自来水。
绿薄荷和亚麻籽水醇提取物的制备
新鲜的绿薄荷和亚麻籽是从设拉子当地市场购买的。这些植物的品质得到了生物系一位植物学家的证实。在清理和干燥后,将绿薄荷完全研磨;所得粉末置于70%酒精中72小时。滤纸矫直后,用旋转机在减压下浓缩萃取物。所得的半固体提取物放入冻干机24小时以制成粉末。同样的程序用于亚麻籽研磨后的种子。
生殖周期监测
大鼠的生殖周期大约持续4-5天。每个周期的特征是基于三种类型细胞的比例,包括;角质、白细胞及上皮细胞[24].根据Caligioni(2009)描述的方法,在选择实验大鼠前两周(只选择周期有规律的大鼠)通过阴道涂片监测大鼠的生殖周期,并在实验的最后8天(从实验的第85天开始)检查大鼠的生殖周期(图。1).
多囊症的诱导及治疗
两组(治疗组和PCOS组)大鼠有规律的发情周期7周后,肌肉注射4mg戊酸雌二醇溶解在0.2 ml芝麻油中[25,26].
血液取样和组织学研究
在治疗的最后一周,再次评估所有大鼠的生殖周期。第93天(实验最后一天),用含2%乙醚的棉球麻醉大鼠3 ~ 5 min。,而且euthanized by whole blood collection through heart puncture, and sera were used for measuring hormones including estrogen, progesterone, testosterone, and dehydroepiandrosterone (DHEA).
切除卵巢,固定后进行组织形态学研究。以7 μm厚度制备卵巢连续切片,用苏木精和伊红染色,选取所有卵巢同一切片进行组织学研究。不同类型的卵泡包括;在光学显微镜下(CX21 OLYMPUS,日本)评估原发、窦前、窦前和囊性,并使用调整后的数码相机(AM423U Eyepiece相机,Dino- Eye Taiwan)拍摄。卵泡特征为原代(卵母细胞含一层立方颗粒细胞)、窦前(卵母细胞含2-5层立方颗粒细胞)、窦前(卵母细胞含5层以上颗粒细胞和小面积或大面积的卵泡液)和闭锁性囊样卵泡(大型液体填充囊肿,颗粒细胞层减弱,颗粒细胞分离的卵母细胞)。测量了不同卵泡的颗粒和膜层,并评价了卵泡直径。此外,用Dino Capture 2.0测量原发、窦前、窦前和囊性卵泡的数量。
激素测定
采用ELISA试剂盒(Monobind, Inc. lake Forest, CA (92630) USA)测定血清中睾酮、雌激素、孕酮和脱氢表雄酮等激素。
统计分析
所有结果均以均数±均数标准误差(Mean±SEM)表示。采用(SPSS-24.0)进行统计分析。组间统计学差异比较(单因素方差分析)。两组比较采用LSD检验。统计显著性设为p < 0.05.
结果
生殖周期
在PCOS诱导后,该组的平均体重与对照组相比显著增加,未使用提取物治疗的体重有所改善(表2)1).生殖监测结果显示,戊酸雌二醇诱导PCOS后,动物的生殖周期在发情期停止,而提取物治疗后,动物的生殖周期已开始,但周期较长(表2)2).
不同组血清性激素的变化
孕酮激素的平均浓度(图;2)与PCOS相比显著增加(p < 0.05)但是,治疗组、治疗对照组和对照组之间没有显著差异。PCOS组雌二醇水平较其他组升高(p < 0.05),但与PCOS组相比,治疗组该激素的平均浓度显著下降(p < 0.05).对照组、治疗对照组和治疗组之间雌二醇水平无显著差异。
PCOS组平均血清睾酮浓度较其他组明显升高(p < 0.05).而C、TC、T组中该激素的平均浓度变化不明显,组间无显著性差异。
如图所示。2PCOS组雌二醇和睾酮C &B水平明显高于其他各组。然而,在治疗组,睾酮和雌二醇水平显著下降(p < 0.05).此外,与PCOS组相比,治疗组的孕酮水平有所升高,但DHEA水平在各组之间没有明显变化(图2)。2A和d)。
卵巢组织形态学
与其他组相比,PCOS组的囊泡数量明显增加3.).PCOS组初生卵泡和窦前卵泡平均数量较其他组减少,TC组和C组差异有统计学意义。PCOS组的窦卵泡数量较其他组明显减少。
多囊性卵巢综合征的囊性卵泡的特征是由于胶原蛋白水平的增加、膜层的肥大和增生以及间质纤维化导致的白膜厚度的增加。与PCOS组相比,T组的囊泡数量明显减少。治疗对照组和对照组均未见囊泡。黄体的平均数量见图。3..PCOS组卵巢未见黄体。
不同组卵巢组织显微照片见图。4.PCOS组次生卵泡颗粒层厚度明显减少,原因是这些卵泡的膜层较其他组增加(p < 0.05)).与治疗对照组和对照组相比,治疗组的这一数值也有显著增加(p < 0.05)).与其他组相比,PCOS组次级卵泡直径明显增加(图2)。5) (p < 0.05).
讨论
绿薄荷和亚麻籽被单独推荐用于治疗或改善女性多囊症[11,14,15].在本研究中,我们研究了在大鼠模型中联合使用亚麻籽和绿薄荷水醇提取物对PCOS改善的重要性。
我们利用戊酸雌二醇诱导多囊症。如图所示,与对照组相比,PCOS组的睾酮和雌二醇水平显著升高,而PCOS组的孕酮水平显著降低。然而,两组之间的脱氢表雄酮水平没有显著差异。其他研究人员在使用戊酸雌二醇诱导多囊症后也报告了类似的结果[16,27].与PCOS组相比,治疗组的孕酮水平显著增加,这一增加略高于单独使用亚麻籽或绿薄荷治疗[16].据报道,给未成熟大鼠服用水酒精亚麻籽提取物可显著提高孕酮水平[28].似乎使用这两种提取物的组合有可能改善卵巢功能,导致排卵和黄体作为孕激素的来源发育。
在目前的研究中,用绿薄荷和亚麻籽提取物联合治疗的PCOS大鼠的睾丸激素水平大幅下降,这比我们之前的报告中单独给药亚麻籽时的睾酮水平低了四倍[16].其原因可能与留兰香薄荷的抗雄激素作用和亚麻籽的植物雌激素作用有关[11,17]可以降低游离睾酮的含量[11,14,15].同样,48名绝经后妇女用亚麻籽治疗12周后,睾酮水平显著下降[29].此外,据报道,给pcos诱导的大鼠服用绿薄荷作为抗雄激素来源20天,可显著降低睾丸激素水平[30.].
与PCOS组相比,接受亚麻籽和绿薄荷提取物组合的治疗组雌二醇水平也显著降低。这一降幅超过了之前仅使用亚麻籽的报告[16].
雌二醇水平的下降可能是由于亚麻籽中存在木聚糖,这可能导致SHBG产量上升,从而降低游离雌二醇水平[19].此外,木聚糖可以抑制芳香化酶活性,从而降低雌二醇的产生。其他研究也在更年期妇女中报告了同样的结果[31].
各组间脱氢表雄酮无明显变化。其他研究亦有相同的结果[14,16,31].由于脱氢表雄酮的主要来源是肾上腺[32在诱导PCOS或用这些提取物治疗过程中,其分泌没有受到影响。
PCOS诱导后,原卵泡、窦前卵泡和窦前卵泡数量减少,而囊性卵泡数量显著增加。用亚麻籽和绿薄荷提取物联合治疗大鼠可以改善这些不受欢迎的改变。在雌性大鼠PCOS诱导后,也有类似的组织学变化报告[33]和用亚麻籽提取物处理[16].
与PCOS组相比,T组颗粒厚度增加,膜层厚度减少。颗粒增殖受许多旁分泌/内分泌因子调控,如卵泡雌激素浓度、生长因子和TGF-β。GDF9是TGF-β家族的一员,源于卵母细胞,对卵泡的正常生长和发育至关重要。卵泡中雌激素和卵泡刺激素浓度的主导对颗粒细胞的持续生长和积累至关重要[34].因此,这些提取物的组合可能通过这些机制(内分泌/旁分泌)中的任何一种改善了卵泡状况,这需要进一步研究。
结论
总之,前文报道,与单独使用亚麻籽或绿薄荷相比,联合使用绿薄荷和亚麻籽提取物可改善PCOS动物的内分泌分泌,包括雌二醇、孕酮和睾酮水平以及卵巢组织学。结果强调了联合使用绿薄荷和亚麻籽提取物治疗多囊症的潜在效果。
数据和材料的可用性
应要求,将向通讯作者提供数据。
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致谢
作者要感谢设拉子大学对这项研究的支持。
资金
不适用。
作者信息
作者及隶属关系
贡献
MM构思了这项研究,并参与了研究的设计、样本收集、数据采集、生化和组织学研究、数据分析和解释,GJ准备并监督了研究设计、样本收集、数据采集和手稿的起草。FR参与了组织学研究。FR辅助组织学分析。所有作者均已阅读并批准最终稿。
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伦理批准并同意参与
该研究是硕士论文的一部分,该研究的所有步骤都已获得设拉子大学(No.s9431213)“研究生委员会研究”的批准。所有对动物的调查都是根据设拉子大学批准的“研究动物护理和使用指导原则”进行的。
发表同意书
不适用。
相互竞争的利益
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附加文件1。
卵巢中卵泡数量的百分比。
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Mehraban, M. Jelodar, G. & Rahmanifar, F.联合薄荷和亚麻籽提取物改善实验性PCOS患者卵巢内分泌和组织形态学。J卵巢Res13, 32(2020)。https://doi.org/10.1186/s13048-020-00633-8
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DOI:https://doi.org/10.1186/s13048-020-00633-8
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