尼日利亚拉各斯零售肉类中肠杆菌科抗生素耐药性及质粒分析

背景

食品中耐抗生素微生物的存在在全球引起了极大关注。本研究旨在检测和表征尼日利亚不同肉类肠杆菌科成员的质粒运输和特征。

方法

从羊肉、猪肉、牛肉和鸡肉共80份肉类样品中，按标准程序分离出肠杆菌科微生物，并采用API 20E系统进行鉴定。采用圆盘扩散法和碱性裂解法分别对所选抗菌药物和质粒提取进行药敏试验。

结果

共分离肠杆菌科110株，属鉴定为7属的大肠，肠杆菌属，克雷伯氏菌，枸橼酸杆菌属、变形杆菌属，沙门氏菌而且沙雷氏菌属。微生物对阿莫西林/克拉维酸的总耐药率为91(82.7%)、链霉素85(75.7%)和全氟沙星74(67.2%)，其中氧氟沙星的总耐药率最高(91.8%)。质粒分析显示，质粒的拷贝数为1 ~ 3份，估计大小为700bp ~ 1.1kb大肠杆菌，k .肺炎，大肠aerogenes而且变形杆菌．所有携带质粒的分离株均为多药耐药菌株，除一株属鸡大肠杆菌从含有单一质粒副本的猪肉中提取，这表明这些肉是耐抗生素细菌的贮藏地。

结论

我们的研究结果揭示了肉类污染的高水平与耐抗生素肠杆菌科港耐药质粒。必须确保加工者和零售商之间的综合监督系统和安全实践。

与受污染的肉类和肉制品有关的食源性疾病是一个重大的公共卫生问题。在发展中国家，不适当的食品处理做法，如卫生状况不佳、安全法律薄弱或不完善、监管系统执行不力、缺乏启蒙和对感染的认识，是促进食源性疾病的一些主要因素[1］．任何肉类的微生物质量取决于动物在屠宰、处理、环境卫生和储存时的健康和身体状况[2］．

肠杆菌科由一大群异质的革兰氏阴性杆状细菌组成，它们自然存在于哺乳动物肠道中，尽管也可以在其他环境中发现。它们是食品质量、卫生和污染的有用指标，例如大肠杆菌，沙门氏菌种虫害和志贺氏杆菌肠杆菌科可引起一系列肠道感染，如腹泻和心内膜炎，以及呼吸道、皮肤、软组织、尿道、关节、骨骼、眼睛和中枢神经系统的感染[3.］．

肉和肉制品受到肠杆菌科耐药致病性成员的污染在全球范围内引起了极大关注，因为其健康后果在某些情况下会导致高死亡率。以前也有关于抗生素耐药性升高和在这些食源性病原体中传播的报道[4，5］．在畜牧生产中使用抗生素有时是不可避免的，因为治疗由不同微生物引起的感染可能由于缺乏疫苗而不易预防。然而，这些抗生素有时确实以亚治疗剂量使用，这往往会导致选择性压力和抗微生物药物耐药性的增殖，并在动物肠道菌群中传播。大肠杆菌和肠杆菌科的其他成员已被高度熟练地描述为通过质粒和整合子等移动遗传元件将抗生素抗性基因传递给其他肠道生物[6］．

肉类是一种营养丰富的食物，含有大量的蛋白质、维生素和矿物质，而且比大多数其他食物都有很高的生物利用度[7］．尽管它被认为是将食源性病原体传播给人类的主要媒介之一，但它在尼日利亚的消费量很高[8］．肉类在屠宰过程中最初接触食用动物的肠道内容物是肉类被肠杆菌科细菌污染的易感因素，随后在加工和零售过程中，从环境来源和处理者那里接触肠杆菌科细菌。考虑肠杆菌科致病性成员相对于致病性菌株的食源性暴发大肠杆菌，沙门氏菌，志贺氏杆菌、克雷伯氏菌等，持续开展肉类污染的病原微生物监测势在必行。从被肠杆菌科污染的肉类中获得的数据及其抗生素耐药性概况将对肉类安全性的逻辑评估有价值，并进一步阐明耐抗生素食源性病原体通过受污染的肉类向消费者的可能传播。

本研究旨在检测本地加工肉类样品中的肠杆菌科成员，并研究质粒作为抗生素耐药性基因传播模式的存在。

样品收集

对加工零售肉类进行了横断面研究，以确定拉各斯大都会肠杆菌科的细菌学质量和抗生素敏感性。所采用的抽样准则为简单随机抽样法。共80个零售肉类样本[包括羊肉(n= 20)，猪肉(n= 20)、牛肉(n= 20)和鸡肉(n= 20)]是2019年3月至6月在拉各斯大都会Agege、Obalende、Mushin和Bariga(采样区)的零售点随机购买的。抽样地区是从构成拉各斯州的两个主要区域-拉各斯大陆和拉各斯岛中随机选择的。肉类样本被收集在密封塑料袋中，并立即运送到实验室进行微生物分析。

样品分析

对所有肉类样本进行肠杆菌科检测，方法是无菌称量每个肉样本25克，加入225毫升0.1%缓冲的无菌蛋白胨水中，混合2分钟。[9］．十倍连续稀释至10⁶由均质样品制成，每种最终稀释物各1ml被镀在含有不同的麦康基、伊红、亚甲基蓝、Salmonella-Shigella孵育至少24小时，直到观察到明显的生长。根据菌株的表型和菌落形态进行传代，例如，在麦康基琼脂(MCA)上作为乳糖和非乳糖发酵剂出现的菌株，分别在不同的MCA和沙门氏菌-志贺菌琼脂(SSA)上进行传代。选取中心呈深色的菌落和具有绿色金属光泽的菌落，分别在SSA和Eosin亚甲基蓝琼脂(EMBA)上进行传代培养，然后在山梨醇麦康基琼脂(SMAC)上进行筛选，如所述[9］．

分离株鉴定

所有疑似肠杆菌科成员的纯培养物都进行了初步的标准生化测试以进行鉴定。根据制造商的说明，使用API 20E系统(Bio-Merieux, France)进一步筛选推定鉴定的肠杆菌科成员。

抗菌药敏试验

通过圆盘扩散法的标准程序和指南确定和解释分离株对用于肠道和食源性感染的常用处方药的抗生素敏感性[10］．使用了以下抗生素;三甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(25µg)、氯霉素(30µg)、环丙沙星(10µg)、阿莫西林(30µg)、阿莫西林/克拉维酸(20/10µg)、庆大霉素(10µg)、培氟沙星(30µg)、氧氟沙星(10µg)、链霉素(30µg)。

质粒DNA提取

质粒提取如前所述[11]使用100 bp和1 KB质粒梯子进行少量修改。25 (n= 25)从耐药菌株中随机抽取菌株进行质粒研究。简单地说，细菌培养物在37°C、最佳抗生素浓度的营养肉汤中，在150转/分钟的摇床培养箱中过夜。收获后，将培养物转移到含有裂解缓冲液的1.5 ml Eppendorf管中，在70℃下加热15分钟^oC，与等体积的苯酚:氯仿:异丙醇(25:24:1)混合，然后离心。使用移液管收集上清，添加到蓝色负载染料中，在1%琼脂糖凝胶Tris-acetate-EDTA缓冲液中在80 v下运行1小时，使用凝胶记录系统和紫外线透射器观察质粒带。

统计分析

采用单因素方差分析(ANOVA)检验比较从不同类别样品中分离出的流行率的差异，在p< 0.05。

从80份肉类样品中共分离出110株肠杆菌。菌落形态、革兰氏反应和API 20E试剂盒结果显示分离株身份为产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，弗氏柠檬酸杆菌，奇异变形杆菌，肺炎克雷伯菌，植物克雷伯菌，沙门氏菌spp。大肠杆菌,沙雷氏菌属odorifera。这些微生物在肉类样本中出现的频率见表1与肠杆菌属出现频率最高的属26种(23.6%)沙雷氏菌属最少3个(2.7%)。

抗生素药敏试验

微生物对抗生素的耐药情况见表2．分离出的肠杆菌科91株(82.7%)对阿莫西林/克拉维酸耐药，85株(75.7%)对阿莫西林和链霉素同时耐药，74株(67.2%)对泊氟沙星耐药，65株(59.1%)对斯帕沙星和环丙沙星同时耐药。对庆大霉素和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑的耐药水平为45(40.9%)，对氧氟沙星的耐药率为91.8%。

在属水平上，抗性完全(100%)普罗透斯抗阿莫西林和链霉素，肠杆菌属该菌对阿莫西林/克拉维酸完全耐药大肠杆菌，沙雷氏菌属种虫害和沙门氏菌耐药率为100%大肠杆菌到甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑，阿莫西林和链霉素。克雷伯氏菌种虫害和枸橼酸杆菌属细菌对培氟沙星和链霉素均表现完全耐药。对氯霉素、司帕沙星、环丙沙星、氧氟沙星、链霉素的敏感性为100%沙雷氏菌属spp。肠杆菌属细菌对氯霉素、氧氟沙星和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑完全敏感，而细菌对氯霉素、氧氟沙星和磺胺甲恶唑完全敏感大肠杆菌而且沙门氏菌细菌对庆大霉素、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑和氧氟沙星完全敏感。

质粒分析

25个分离株中有9个(36%)含有1 ~ 3个拷贝的质粒，大小估计在700 bp ~ 1.1 kb之间(数据未显示)，质粒4的数量最多(44.44%)出现在大肠杆菌，然后是k .肺炎而且大肠aerogenes两者各有2个(22.22%)p .奇异君子兰1(11.11%)。质粒拷贝数最多为3份大肠杆菌从鸡中分离，其余分离株各有1个拷贝。所有携带质粒的分离株均来自鸡大肠杆菌从携带单一质粒副本的猪肉中提取。

统计分析

根据统计分析，f-ratio值为0.82804p-值为0.491442，因此猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉中肠杆菌科的发生率无显著差异p< 0.05显著水平。

在这项研究中，从当地加工的零售牛肉、猪肉、羊肉和鸡肉中分离出肠杆菌科。总体而言，不同肉类类型的肠杆菌科污染水平无显著差异，但猪肉和猪肉中分离出的38株肠杆菌最多(34.5%)肠杆菌属从不同的肉类样品中分离到的sp .占主导地位大肠杆菌21%，而沙雷氏菌属spp.与所有肉类的隔离程度最小1）.

本研究中从肉类中分离出的肠杆菌科的来源可能来自受污染的加工水、接触表面和可能破坏卫生习惯的食品操作人员。以前的研究已经记录了从零售肉类和动物尸体中存在一种或多种肠杆菌科成员。乌泽和阿古兰纳[12)检测大肠杆菌O157:H7和其他大肠杆菌牛胴体不同部位的肉样品中分别有37%和63%的菌株。与本研究的结果一致的是，虽然流行程度不同，但之前已经从不同的零售肉类样本中报告了肠杆菌科。来自埃及的研究记录了普罗透斯spp。大肠杆菌种虫害和克雷伯氏菌肉类零售代理[13),克雷伯氏菌spp。沙雷氏菌属spp。大肠杆菌，肠杆菌属spp。枸橼酸杆菌属spp。变形杆菌而且沙雷氏菌属，亦从美国零售牛肉及家禽中检出[14］．沙门氏菌10株(2.3%)分离自尼日利亚Zaria的零售牛肉及相关肉制品[15]，该值低于本研究得到的15(13.6%)。结果的差异可能是由于两项研究中调查的肉类产品不同。沙门氏菌是世界上最重要的食源性病原体之一，从尼日利亚当地加工肉类中分离出的这种病原体令人担忧，需要更加紧急的关注。

本研究分离出的肠杆菌科对所调查的抗生素表现出高水平和多种耐药特征，可通过食用从食品传播给人类。在所有对这些病原体的活性进行调查的抗生素中，氧氟沙星仍然是最有效的，对生物体的总体敏感性为91.8%。与其他氟喹诺酮类药物相比，氧氟沙星的疗效明显高于环丙沙星和斯帕沙星，两者的总敏感性均为40.9%，培氟沙星的总敏感性为32.8%。氧氟沙星具有较高的抗菌活性，这是由于氧氟沙星的一个结构位置上存在烷基化哌嗪基团[16］．

本研究观察到不同种类抗生素的耐药率不同，耐药率从5.6 - 100%不等，其中对链霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、阿莫西林和阿莫西林/克拉维酸的耐药率最高。在这项研究中观察到的抗生素耐药性是如此令人不安，因为大多数被调查的抗生素并不常用于牲畜生产，而是用于治疗肠道细菌引起的人类感染。这些结果与以往相关研究报道的类似对上述抗菌药物的高耐药性一致[17］．85%的分离株对阿莫西林/克拉维酸高度耐药或完全耐药(100%)。这两种药物分别属于β -内酰胺和β -内酰胺酶抑制剂类抗生素，通常用于与革兰氏阴性细菌相关的感染。对这两类抗生素的耐药性通常是由β -内酰胺酶介导的，这些酶编码在质粒和整合子等移动遗传元件上携带的基因上，阿莫西林使它们能够有效地水解这些药物[18，19］．

肠杆菌科以拥有不同大小的多个副本的质粒而闻名[20.］．本研究所调查的25株耐药肠杆菌中有9株存在质粒，占所调查的肠杆菌科质粒总数的36%。质粒阳性的分离株含有多达3份染色体外DNA拷贝，估计大小可达1.1 kb。本研究的结果与先前关于肠杆菌科成员携带质粒的研究一致[20.，21］．本研究分离出的细菌的质粒谱与其多重耐药存在相关性(表2)3.)，从而提示质粒的携带可能与本研究中观察到的耐药谱有关。虽然我们的研究局限性之一是无法提供质粒的存在与观察到的抗菌素耐药性之间的联系的证据。编码对氟喹诺酮类、氨基糖苷类和β -内酰胺类等抗生素类多重耐药性的抗生素耐药基因在质粒上携带，能够通过细菌群落之间的水平基因转移进行细菌间传播[22，23有趣的是，从鸡肉中分离出的细菌中，所选分离株中质粒的携带更为频繁，这表明鸡肉可能是抗微生物药物耐药性的储存库，正如先前在其他地方所认为的那样[24］．

总之，本研究中提供的数据表明，零售的当地加工的猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉可能显著促进了耐抗生素肠杆菌科向社区的传播。在这些零售肉类中出现耐抗生素肠杆菌科是对公众健康的潜在风险。这项研究还清楚地表明，在肉类加工和零售过程中，某些有助于最大限度减少食品污染的安全措施可能已经受到损害。因此，应采取措施减少这些肉制品中致病性抗生素耐药细菌的增殖。

本研究中使用和分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。在这项研究中产生或分析的所有数据也包括在这篇发表的文章中

AST:

抗生素药敏试验

API 2:

分析剖面指数

MCA:

MacConkey琼脂

SSA:

Salmonella-Shigella琼脂

EMBA课程:

伊红亚甲基蓝琼脂

方差分析:

单向方差分析

作者要感谢拉各斯大学微生物系的技术人员在实验工作过程中的支持。

作者(们)没有收到任何特定的资金用于这项工作。

作者及隶属关系

1. 尼日利亚拉各斯阿卡-亚巴拉各斯大学理学院微生物学系

   Roseline Ekiomado Uzeh, Fadekemisola Adewumi和Bamidele Tolulope Odumosu

贡献

在REU的指导下，FA进行了采样和实验工作。数据由BTO分析和解释，手稿由BTO起草，并由REU进行批判性修订。所有作者都阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到Bamidele Tolulope Odumosu．

伦理批准并同意参与

由于所使用的样品是从零售商那里购买的，因此这项工作无需伦理批准。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

没有要申报的。

出版商的注意

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