抗微生物药物耐药非伤寒沙门氏菌血清在尼泊尔奇旺的商业家禽价值链中

背景

细菌病原体中的抗微生物药物耐药性(AMR)是一个快速增长的公共卫生问题。非伤寒的抗生素耐药性沙门氏菌食用动物中的血清病毒(NTS)值得特别关注，因为它可能在处理或消费动物产品时将耐药病原体传播给人类。在尼泊尔，抗生素耐药性的可能性沙门氏菌食用动物中的血清病毒是一个重要的研究领域，特别是考虑到快速发展的家禽业，缺乏监测和适当的生物安全措施;以及相关数据的缺乏。本研究旨在评估商业家禽养殖场环境和屠宰场家禽尸体中NTS的负担和相关的抗微生物药物耐药性。本研究还旨在了解家禽养殖户在使用抗微生物药物、疫苗接种和生物安全措施方面的一些基本知识和实践。

方法

2017年5月至10月在尼泊尔奇旺区开展了一项横断面研究，采用一种健康方法。无菌采集12个肉鸡养殖场的农场垃圾、饲料、水、家禽粪便、车辆拭子、农场拭子和21个屠宰场的不同部位的家禽尸体样本。用微生物学方法评估了NTS血清的存在及其抗微生物药物耐药性的表型和基因型指标。在收集环境样本之前，还对家禽养殖户进行了简单的生物安全相关知识和实践采访。

结果

总的来说，在收集的所有环境样本中，50%(31/62)的NTS血清检测呈阳性，其中环境拭子(70%，8/12)是培养阳性的样本类型。同样地，从24具尸体中采集的159份组织样本中，79%(126/159)的NTS血清培养呈阳性。近97%(153/157)的分离株对四环素耐药，11%(17/157)的分离株对环丙沙星耐药，5%(8/157)的分离株对阿奇霉素耐药。157株菌株均对美罗培南敏感。在耐药基因方面，与四环素、环丙沙星、阿奇霉素和美罗培南耐药基因相对应的分离株中检出tetA(83%， 131/157)、QrnS(40%，64/157)、mefA(8%， 13/157)和VIM-1(0.6%， 1/157)。在农民访谈中，只有42%(5/12)的农民提到在农场周围使用石灰粉等基本生物安全措施;84%(10/12)的农民报告给他们的禽鸟接种了某种疫苗，75%(9/12)的农民使用各种抗菌剂进行预防，如新霉素(33%，4/12)、粘菌素(33%，4/12)、呋他酮(33%，4/12)、强力霉素(25%，3/12)、磺胺甲氧苄啶(25%，3/12)和泰乐素(16%，2/12)。

结论

这项研究揭示了农场环境和随后的禽肉样品的严重污染，NTS血清对几种临床重要的抗菌素具有耐药性。此外，还观察到在商业家禽养殖场中，甚至基本的生物安全措施都不充分，并且经常预防性使用抗微生物药物。这加强了从农场到屠宰场提高认识和实施适当生物安全措施的迫切需要，以减轻NTS污染周围环境和家禽产品的负担。此外，NTS分离株中耐药耐药性的高流行率也强调了加强政策的必要性，以防止在家禽部门大肆使用临床使用的人类抗微生物药物。

2010年非伤寒沙门氏菌血清(NTS)在世界各地造成超过1.53亿人患病和12.2万人死亡，其中5岁以下儿童负担过重[1，2］．根据世界卫生组织(WHO) 2015年的数据，这些疾病中约有50%是由食用受污染的食物引起的;然而，与动物接触、饮用受污染的水也是潜在的交通工具[1，2］．与之相关的食品沙门氏菌受污染的家禽是其中最常见的，因此国际社会努力控制和减轻负担沙门氏菌家禽中[3.，4］．

除了由于NTS疾病负担沉重而造成的重大公共卫生影响外，抗微生物药物耐药性(AMR)的增加也是一个令人严重关切的问题[5］．由耐药性引起的感染沙门氏菌往往更严重，并导致更高的住院率和死亡率[6］．同时，全球正在努力监测和跟踪耐药性的发展沙门氏菌在全球范围内(7，8]，在资源匮乏的国家，对疾病和抗微生物药物耐药性的系统监测可能极具挑战性，因此可能无法发现病原体和相关的抗微生物药物耐药性。

在尼泊尔，家禽生产是一项重要的经济活动，2017年占该国国内生产总值的4% [9］．根据粮食及农业组织(粮农组织)的数据，2007年至2017年，尼泊尔禽肉产量从2007年的1940万只鸡增长至2017年的7540万只，增长了398% [10］．这个数字预计在未来几年还会继续增长。11］．在尼泊尔，家禽生产中通常使用各种抗菌剂，以促进生长和预防疾病。预计在尼泊尔，这种不受管制的抗微生物药物消费将会增加[12］．2012年在尼泊尔进行的一项调查发现，2008年至2012年期间，兽医抗菌剂的销量增长了50%以上，其中70%以上是在没有处方的情况下获得的[12］．尼泊尔家禽生产中抗菌素的显著增加以及可能的滥用和过度使用可能加速耐药性的发展沙门氏菌在这个地区。

在尼泊尔进行的大多数监测工作都集中在沙门氏菌血清从发热的人类分离出的伤寒[13，14]，关于非伤寒患者的负担和抗微生物药物耐药性的知识很少沙门氏菌血清在尼泊尔家禽行业。然而，有限的可用数据突出了必须解决的数据差距。因此，我们采用同一健康的方法对非伤寒的患病率进行了初步研究沙门氏菌并用表型和分子表征方法对尼泊尔Chitwan地区禽业的AMR进行了分析。

该研究于2017年5月至10月在尼泊尔南部的奇旺地区进行;这段时间与夏季季风相吻合，通常预计人类沙门氏菌病的发病率最高。奇旺是该国最大的禽蛋和肉鸡生产区之一[152011年人口普查数据显示，该市人口为58万。

样品收集

肉用鸡农场

选择了在国家家禽联合会注册的奇旺区12个商业家禽养殖场，以代表一系列产量、房舍类型和卫生状况。在获得农场所有者的知情同意后，研究小组与农场所有者进行了非正式访谈，以获得关于产量和通常做法的信息，如疫苗、抗微生物药物的使用以及卫生和基本生物安全措施。使用移动应用程序记录每个农场的GPS位置。通过从每个农场收集以下环境样本:大约20克农场垃圾;直接从使用中的饲料袋中收集25克家禽饲料;还有一把铲满了养鸡场里潮湿的家禽粪便。每个样品都收集在无菌容器中。将大约100毫升的家禽饮用水收集在一个无菌螺旋盖容器中，直接换瓶。此外，用无菌脱脂牛奶浸湿的无菌棉签沿着家禽农场的内壁被拖拽，并浸入装有10毫升无菌脱脂牛奶的小瓶中。采用类似的策略，用无菌棉签对用于将禽鸟从农场运送到屠宰设施的车辆的车轮、侧栏和鸟笼进行取样。所有样品均保存在冰上，并在6小时内运送到实验室。

家禽组织

在Chitwan地区选择了21个屠宰场，以接收本研究所包括和抽样的农场饲养的鸟类。使用智能手机应用程序记录每个场所的GPS点。在每个场所，随机选择一只鸡尸体。从每具胴体上，使用无菌手术刀刀片收集大约50克的7种不同类型的肉类样本，并无菌转移到无菌容器中。样本类型为砂囊、肝脏、心脏、肠、皮肤、脾脏和肌肉。在样本采集后的6小时内，这些样本被储存并在冰上运输到实验室。

微生物分析

除拭子外，所有样品均在缓冲蛋白胨水中预富集(M614, Himedia实验室，印度)，并在35±2℃下孵育(STXBI45, Stericox孵化器，印度)18小时。拭子样品在脱脂牛奶中直接孵育(STXBI45, Stericox孵化器，印度)，在35±2°C下孵育18小时。将100 μl预富集物转移到9.9 ml Rappaport Vassiliadis Broth (M880, Himedia laboratories, India)中选择性富集样品，并在40±2℃下孵育18小时(STXBI45, Stericox Incubator, India)。在木糖赖氨酸脱氧胆酸(XLD)琼脂(M031, Himedia实验室，印度)上传代培养一个充满内容物的循环，并在35±2℃下孵育(STXBI45, Stericox孵化器，印度)18小时。

接种后的XLD板观察其透明的红色菌落，中心为黑色Salmonellaenterica型。为进一步确认沙门氏菌血清属，生化IMVic试验进行沙门氏菌血清就像孤立的细菌菌落。在IMViC生化试验中，分离株吲哚呈阴性，甲基红呈阳性，vogesproskauer呈阴性，柠檬酸利用呈阳性，碱性偏酸，含或不含H₂S在TSI(三糖铁)试验、运动和脲酶阴性结果证实为沙门氏菌血清隔离。的typhoidal沙门氏菌血清型即。沙门氏菌血清伤寒、副伤寒A、B和C高度适应人类，没有已知的动物或环境宿主[16］．因此,所有沙门氏菌血清本研究从家禽和环境样本中分离的血清病毒被认为是非伤寒的沙门氏菌血清型(nt)。

采用改良Kirby Bauer纸片扩散法对阿奇霉素(15 μg)、四环素(35 μg)、环丙沙星(10 μg)、美罗培南(10 μg)进行药敏试验。椎间盘扩散断点的解释是根据CLSI(临床和实验室标准协会)2017指南进行的[17］．分离株储存在−80°C的甘油贮存液中，以备将来使用。

抗微生物药物耐药性标记基因的分子检测

生物化学证实沙门氏菌血清从贮存的甘油原液中分离出的分离株在XLD琼脂板上传代培养。在孵育时，首先检查培养皿的菌落纯度。两到三个与世隔绝的殖民地沙门氏菌血清从过夜培养中随机选取，重悬于200 μl无菌蒸馏水中。使用Quick-DNATM真菌细菌Miniprep试剂盒(D6007, zyymo research, USA)按照制造商说明提取细菌DNA。简单地说，通过在BashingBead缓冲液(试剂盒中提供)中强烈涡旋，然后以10,000 x g离心(1730R, Gyrogen，韩国)1分钟，物理破坏悬液中的细菌细胞。用基因组裂解缓冲液处理裂解液中被破坏的细菌细胞。在Zymo-Spin™IC柱上收集释放的粗细菌DNA，然后以10,000 x g离心(1730R, Gyrogen，韩国)1分钟。丢弃流过的液体后，吸附在色谱柱上的DNA分别用200 μl DNA Pre-Wash Buffer和500 μl g-DNA Wash Buffer洗涤两次，然后以10000 x g离心(1730R, Gyrogen，韩国)1分钟。最后用20 μl DNA洗脱液将细菌DNA从色谱柱中洗脱，保存于2-8℃。

使用商业试剂盒Qiagen微生物DNA qPCR Assay (330025,Qiagen，德国)进行了基于Taq-man化学的抗微生物药物耐药基因实时PCR检测。检测了以下用于特定抗菌素的抗微生物药物耐药性基因:用于氟喹诺酮类药物的QnrS(检测目录BPAR00441A, Qiagen, Germany);用于β -内酰胺类抗菌剂的OXA-62(检测目录BPAR00430A, Qiagen，德国)、NDM(检测目录BPAR00402A, Qiagen，德国)、imp -1组(检测目录BPAR00398A, Qiagen，德国)和vim -1组(检测目录BPAR00403A, Qiagen，德国);氨基糖苷aacC1(检测目录BPAR00367A, Qiagen, Germany);tetA(检测目录BPAR00449A, Qiagen, Germany)用于四环素类;ermA(检测目录BPAR00442A, Qiagen，德国)和mefA(检测目录BPAR00445A, Qiagen，德国)用于大环内酯类/林科氨酰胺。采用热启动qPCR主液12.5 μl，蒸馏水9.5 μl, AMR基因特异性正向引物、反向引物和特异性水解探针混合qPCR检测液1 μl，提取DNA 2 μl，建立每个样品25 μl的PCR反应体积。在每一批PCR试验中，包括一个PCR阳性对照管(添加PCR阳性对照由制造商提供)和一个无模板对照管(添加无菌蒸馏水)作为内部对照。每个样品制备每个AMR标记物的PCR反应。AMR基因的实时检测在Sa Cycler-96热循环仪(Sacace生物技术公司，意大利)中进行，采用以下热循环协议; initial activation at 95 °C/10 min and 40 cycles of denaturation at 95 °C/15 s followed by annealing, extension and detection (in FAM channel) at 60 °C/2 min. The ramp rate was set to 1 °C/second. After the completion of PCR program, the threshold cycle (CT) value for each well was calculated. The baseline and threshold were manually adjusted by normalizing the background signal from the NTC well. Finally, for data analysis, the threshold cycle values for all wells were exported to an Excel spreadsheet for scoring positive or negative results for each AMR marker for all samples.

统计分析

采用STATA软件进行统计分析。定性变量的描述性统计用绝对频率(N)和百分比(%)表示。定量变量以均数±标准差(SD)或中位数四分位差(IQR)计算。为了本研究的分析目的，将表现出中度抗生素敏感性的分离株归类为敏感菌株。

采访了访问的12个家禽农场的农场主。肉鸡的经营规模从70只到1000只不等(中位数为400只;四分位范围200,425)。所有农场都使用商业颗粒饲料，并在深窝中饲养相同年龄的鸟类。在每次收获结束时，75%(9/12)的农场通过承包商处理用于肥料的农场垃圾，其余的则在自己的农场自行处理。在采用生物安全措施方面，约42%(5/12)的农民报告在其农场周围使用石灰粉，16.6%(2/12)的农民未能保持任何生物安全措施，其余41.6%(5/12)的农民对生物安全措施一无所知。近84%(10/12)的农民报告给他们的家禽接种了某种疫苗。75%(9/12)的农民使用抗菌剂，其中8个农场报告从饲料供应商获得了抗生素。农场预防性使用的抗菌剂种类不同，即新霉素(33%，4/12)、粘菌素(33%，4/12)、呋他酮(33%，4/12)、强力霉素(25%，3/12)、磺胺甲氧苄氨嘧啶(25%，3/12)和泰乐肽(16%，2/12)。

普遍存在的沙门氏菌血清在家禽环境中

采访了12个肉鸡农场，但只能从11个农场收集环境样本。从农场共采集了62份环境样本，其中50%(31/62)的NTS血清检测呈阳性。近67%(8/12)的农场和车辆拭子样本和50%(6/12)的粪便样本培养呈NTS血清阳性。除一个农场外，所有农场都至少有一个沙门氏菌血清培养阳性样品。采集的家禽饮用水样品均为培养阴性。表格1显示所收集样本的类型及其培养阳性率沙门氏菌血清型。

从屠宰场获得的24只鸡尸体中，共收集了159份家禽组织样本，包括皮肤、肌肉、心脏、肠道、肝脏、砂囊和脾脏。其中，79%(126/159)的NTS血清培养阳性。每种组织类型中至少70%的NTS血清培养阳性;所有鸡尸体至少有四个NTS培养阳性样本(表1）.

抗微生物药物耐药性概况

抗菌药敏试验结果157例沙门氏菌血清从家禽组织和环境样本分离的菌株见表2．来自环境和组织样本的几乎所有分离株都对四环素(35 μg)耐药。对环丙沙星(10 μg)和阿奇霉素(15 μg)耐药的菌株分别有至少10%和5%。所有菌株均未检测到对美罗培南(10 μg)的耐药性。总的来说，环境和家禽组织样本对每种抗菌素的耐药性百分比是相当的。样本量太小，无法衡量各种样本量之间抗微生物药物耐药性流行率的统计学差异。

表中显示了与特定抗菌素耐药相关的标记物的PCR结果3.．的tetA基因是一种对四环素耐药性的标记，最普遍，从两种样本类型分离出的80%以上的分离物检测呈阳性。QnrS而且mefA在两种样本类型的NTS分离株中，其次是更常见的AMR标记。在10个农场中，有4个农场有一个或多个分离株tetA检测到，没有其他标记。从五个农场分离的分离物检测出共存QnrS或mefA随着tetA．其中一个农场的分离株对这三种标记都呈阳性:tetA，QnrS而且mefA. .AMR基因aacC1，Ndm, oxa-62, imp-1在所有测试的NTS分离株中均未检测到。

据我们所知，这是第一项从尼泊尔肉鸡农场收集了一系列环境样本的研究，目的是评估抗生素耐药性沙门氏菌血清．研究结果显示，更高水平的沙门氏菌污染和抗菌素耐药性比以前在尼泊尔禽肉中观察到的要好。在与养殖户的访谈中发现，只有少数肉鸡养殖户实施了生物安全措施。虽然尼泊尔对食用动物中抗生素的使用进行了监管，但通常不会维持执法。

在家禽组织(79%，126/159)和环境样本(50%，31/62)中检测到较高的NTS患病率。家禽胃肠道是NTS几种血清型最常见的天然生态位之一。家禽尸体中NTS的高患病率表明肉制品可能受到内脏污染程度较高。在加德满都的肉店零售进行的一项研究报告了沙门氏菌在14.5%的鸡肉样本中。最近一项研究从Chitwan Bharatpur的屠宰场收集了38个生鸡肉样本，报告称26.2%的分离微生物是细菌沙门氏菌此外，该家禽养殖场的环境样本中NTS的高流行率表明周围的粪便污染程度同样高，表明缺乏适当的生物安全措施。

在其他低收入和中等收入亚洲国家进行的类似研究报告了在家禽和环境样本中广泛流行的NTS。印度的研究发现，禽肉和禽肉组织中NTS的患病率为0至10% [18，19］．另一项有关NTS的研究在家禽粪便、拖拭子和饲料样本中分别检出0.6%、1.7%和7.4%的NTS [19］．在越南，肉鸡农场的NTS患病率为45.6% [20.]，在另一项研究中为64.7% [21］．2014-2015年期间在缅甸仰光对禽肉尸体进行的一项研究发现，98%的流行率为沙门氏菌141个零售市场[22］．

在沙门氏菌分离自奇旺市先前的零售肉类研究，85% (n= 23)为多重耐药。最常见的抗生素沙门氏菌耐药为氨苄西林、呋喃妥因和强力霉素。与我们的发现相似，越南的研究发现了对四环素耐药的NTS分离株的高百分比，从40%不等[20.]至78% [21]，对环丙沙星耐药性低。对印度家禽和家禽农场的其他研究发现，100%的NTS分离株对四环素具有耐药性[18，19];其中一项研究报告了土霉素作为饲料添加剂的常规使用。在缅甸，从零售鸡样本中分离出的NTS分别有54%和9%对四环素和环丙沙星耐药。[22］．

在这项研究中，QnrS基因在16%的样本中被检测到。然而，对环丙沙星耐药的菌株均无明显的免疫应答QnrS标记;大多数具有标记的标本对环丙沙星敏感，这表明所观察到的环丙沙星耐药可能存在替代遗传机制。细菌分离株中抗微生物药物耐药基因的负担可能取决于在该环境中使用的特定抗生素剂的程度。长期使用抗生素，特别是广谱抗生素，可能会对环境中的微生物群落施加选择压力，这可能会促进抗微生物药物耐药菌株的快速出现和选择，并增加抗微生物药物耐药基因的水平传播。由于抗生素以不受管制的方式广泛用于家禽，主要是在发展中国家，因此应通过监测家禽分离株中的AMR基因来密切监测家禽中的AMR。

本研究的局限性之一是缺乏特异性鉴定NTS血清型的细菌血清分型方法。所选细菌分离株被认为是其中一种沙门氏菌血清基于血清型的使用沙门氏菌样品的特定富集方法，选择性培养基上的菌落特征和生化特性。此外，它假定所有沙门氏菌血清本研究分离的血清型非伤寒型沙门氏菌型基于伤寒的事实沙门氏菌伺服器只有人类作为贮水池。然而，这项研究不能保证所有沙门氏菌血清样本分离株为NTS。例如，不能排除之前是否有任何人类对样本的污染，例如由伤寒感染者或定植者处理家禽样本造成的污染沙门氏菌型(沙门氏菌血清伤寒和副伤寒)。

然而，本研究的主要目的是评估抗生素耐药性的负担沙门氏菌在供人类食用的禽肉样本中以及在商业鸡饲养的环境中。这些发现对于加强和教育生物安全措施以减轻疾病负担具有重要意义沙门氏菌动物源性食品受污染。

在这项研究中，在家禽样本和农场环境中观察到高流行率的抗微生物药物耐药NTS。此外，从运输车辆采集的标本中观察到耐药NTS菌株的高流行率，这可能意味着耐药NTS很容易在农场以外传播。此外，该研究发现，农民对生物安全的知识和实践水平较低，可能进一步加剧家禽行业抗微生物药物NTS的高负担问题。因此，本研究的结果强调了在从农场、屠宰场到零售商店的食品供应价值链的各个层面教育和实施最佳生物安全措施的必要性，以减轻食品生产者的负担沙门氏菌动物源性食品的污染。此外，本研究强调有必要对污染人类动物源性食品的潜在人类病原体进行AMR常规监测，以评估可能对人类健康产生直接影响的AMR基因负担和多样性。在这项研究中，发现在家禽中使用抗生素作为预防是一个普遍的发现。鉴于本研究中NTS分离株的抗微生物药物耐药基因负担很高，这也强调了对家禽业抗菌素进行适当监管的紧迫性，以防止不适当使用，特别是最后一种临床抗菌素，如粘菌素。此外，在当地农场和社区层面开展关于抗微生物药物管理以及与家禽相关的抗微生物药物耐药性对人类健康影响的宣传项目，可能更有效和更可持续，以防止家禽部门滥用抗微生物药物。

在当前研究期间和/或分析的数据集将根据要求从通信作者那里提供。

AMR:

抗菌素耐药性

CLSI:

临床实验室标准协会

粮农组织:

联合国粮农组织

nt:

非typhoidal沙门氏菌血清

人:

世界卫生组织

XLD:

木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂

本文作者要感谢Sabin Shrestha博士，Sharada Thapaliya博士，尼泊尔家禽联合会，Swoyam Prakash Shrestha博士，AHD, NARC和Chitwan农林大学。

本出版物由RTI国际提供支持。

作者及隶属关系

1. RTI国际，研究三角园，北卡罗来纳州，美国

   艾米·尼尔森和朱莉安娜·鲁赞特

2. 尼泊尔分子动力学中心(CMDN)，加德满都，尼泊尔

   Sulochana Manandhar, ya Gywali, Bimala Dhakal, Santosh Dulal, Rupendra Chaulagai和Sameer M. Dixit

贡献

AN, JR, SMD和SM设计了这项研究。AG、BD、SD、SM进行了实验室工作。兽医，支持现场和调查。AN进行了分析。AN、SMD和SM撰写了手稿。AN, JR, SMD, SM参与了稿件的编辑工作。作者阅读并批准最终的手稿。

作者的信息

安:与RTI、学习PI相关

SM, BD, SD, AG是尼泊尔分子动力学中心的高级实验室助理。

JR:与RTI合作

RC:在CMDN担任兽医顾问

SMD: CMDN研究总监

相应的作者

对应到Sameer M. Dixit．

伦理批准并同意参与

本研究不涉及正式的人体提问者调查，也不涉及人体生物样本采集。此外，该农场未对活鸡进行侵入性采样。所使用的粪便样本也是那些排泄和沉积在农场地面上的粪便样本。无论在哪里提到，在访问农场或询问农场所有者他们的农场容量之前，都要获得同意。用于实验室评估的样本是从与被评估农场有关的禽肉和禽蛋供应商处购买的。因此，根据尼泊尔政府的规定，不需要伦理批准。

发表同意书

所有作者都同意发表这项研究。

相互竞争的利益

所有作者都阅读并批准了最终的手稿。其内容完全是作者的责任。所有作者都宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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