一个新的时间身份窗口产生交替的夏娃gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单一祖先谱系中的运动神经元亚型gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

空间模式指定了神经祖先的身份，进一步的多样性由个体祖先谱系内的时间模式产生。在脊椎动物中，这些机制产生了具有转录因子身份和共同形态的“基本类”神经元。在gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba，两个基本类被偶数跳过(Eve)gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元投射到背纵肌，以及Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元投射到腹斜肌。交叉抑制作用阻止稳定的双正运动神经元。的gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba神经母细胞7-1 (NB7-1)谱系使用时间转录因子级联产生五个不同的EvegydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元;Nkx6的起源和发展gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元仍不清楚。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

我们使用神经母细胞特异性Gal4系、稀疏标记和分子标记来鉴定Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba由NB7-1谱系产生的VO运动神经元。我们使用谱系分析来确定VO运动神经元与Kr运动神经元的出生日期gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经母细胞时间识别窗口。我们使用增益和丧失功能策略来测试Kr的作用gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba时间识别和Nkx6转录因子在指定VO神经元识别。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

谱系分析确定了Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba由Kr产生的神经元gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2BaNB7-1谱系中的时间识别窗口，导致该谱系中基本运动神经元亚型的交替(Eve>Nkx6 > Eve)。Kr/Pdm的共同过表达在NB7-1谱系中产生异位VO运动神经元-这是该TTF组合指定神经元身份的第一个证据。此外，Kr/Pdm组合促进了Nkx6的表达，而Nkx6本身是运动神经元靶向腹斜肌的必要和充分条件，从而揭示了从时间模式到主要转录因子表达再到运动神经元靶选择的分子规范途径。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们发现，一个神经母细胞谱系产生交错的主要运动神经元命运;Kr/Pdm TTFs形成了一个新的时间识别窗口，促进Nkx6的表达;Kr/Pdm > Nkx6通路对于促进VO运动神经元靶向到正确的腹侧肌群是必要和充分的。gydF4y2Ba

从苍蝇到老鼠的神经多样性源于两个主要的发育机制。首先，神经祖细胞获得了独特的、可遗传的空间特征，这是基于它们沿体轴rostroroc外侧或背腹侧的位置[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．第二，基于神经元出生顺序的时间模式导致个体祖细胞产生各种各样的神经元和胶质细胞[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．时间模式的最佳特征是gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba；位于腹侧神经索、中央脑和视神经叶的神经祖细胞(神经母细胞)都经历了时间模式，其中神经母细胞依次表达了指定不同神经元身份的ttf级联[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．虽然所有的神经母细胞都经历了时间模式，但在大脑的每个区域，ttf是不同的[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．类似的机制也用于哺乳动物的皮层、视网膜和脊髓，尽管许多ttf仍有待鉴定[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

一个主要的开放问题是，像Kr和Pdm这样的ttf的瞬时表达如何导致分子和形态神经元多样性的长期规范。整合空间和时间线索以巩固运动神经元身份的良好候选者是有丝分裂后运动神经元中表达的同源域转录因子[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．在脊椎动物中，脊髓的背腹侧结构域被划分为12个不同的基本神经元类别——每一类神经元的特征都是从一个共同的祖细胞结构域发展而来，表达独特的同源结构域转录因子，通过交叉抑制相互作用来稳定边界，并产生具有共同形态的神经元[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．我们用这个命名法来定义夏娃gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(Flybase: HGTX)运动神经元作为运动神经元的两个“基本类别”:每一类表达具有交叉抑制相互作用的同源域转录因子(Eve或Nkx6)，每一类由具有相关神经元形态的运动神经元(Eve)组成gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元投射到背部和外侧纵向肌肉;Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元投射到腹侧肌群)[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba神经母细胞7-1 (NB7-1)可以说是理解TTF表达和功能的最佳特征系统。与大多数其他腹神经索神经母细胞相似，NB7-1表达典型的TTF级联hb - pr - pdm - cas，每个TTF由在表达窗口期出生的GMC继承，并在每个GMC产生的两个有丝分裂后神经元中短暂维持。TTF级联在五个Eve之间产生了多样性gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNB7-1的U1-U5运动神经元后代:Hb指定U1和U2, Kr指定U3, Pdm指定U4, Pdm/Cas一起指定U5 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．识别TTF靶基因，包括转录因子和细胞表面分子，将为发育决定因素如何指导神经元形态和突触伙伴选择提供一个全面的观点。gydF4y2Ba

长期以来，人们一直认为运动神经元的基本类别来自不同的祖细胞;夏娃gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元来源于NB7-1、NB1-1和NB4-2，而Hb9gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba或Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元来源于NB3-1和其他神经元。然而，NB7-1的DiI标记确定了一个可能未知的支配腹侧肌肉的运动神经元，这与Eve靶向的背侧和外侧纵向肌肉不同gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．在这个谱系中观察到的腹侧突出可能反映了在幼虫生活中丢失的短暂的旺盛生长，或者它们可能是由于与腹侧肌肉形成稳定突触的未特征的运动神经元。gydF4y2Ba

在这里，我们展示了一个新发现的Kr/Pdm TTF窗口生成一个Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba夏娃gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba运动神经元，NB7-1谱系中U3和U4之间产生，投射到腹斜肌(VO)。我们还表明，Kr/Pdm一起过表达，或单独Nkx6，基于分子标记的表达产生异位VO运动神经元。最后，我们证明了Nkx6是运动神经元轴突靶向腹斜肌所必需的。我们的研究结果建立了从TTFs (Kr/Pdm)到主要运动神经元转录因子(Nkx6)到运动轴突靶向的遗传途径。我们还意外地发现，单个祖细胞可以交替产生不同种类的基本运动神经元。gydF4y2Ba

NB7-1谱系有一个氪gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba生成Nkx6的时间身份窗口gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元gydF4y2Ba

Kr的存在gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba用计算方法预测了时间身份窗口[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，因此我们试图在体内使用先前描述的高特异性NB7-1分裂gal4系(gydF4y2BaNB7-1-gal4gydF4y2Ba［gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)表示gydF4y2BaUAS-myr:绿色荧光蛋白gydF4y2BaNB7-1及其子代(图SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba模拟)。这条驱动线在谱系的早期表达，包括U1-U5神经元出生的时候，但在谱系结束之前逐渐消失[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．我们观察到NB7-1在早期11胚胎中单独表达Kr，随后是Kr/Pdm共同表达中期11，并在晚期11转变为单独表达Pdm(图S . 1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．为了确定来自Kr的神经元的身份gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba时间识别窗口，我们用Eve识别谱系内的U1-U5运动神经元，用Zfh1标记所有运动神经元[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．我们确定了一个夏娃gydF4y2Ba^−gydF4y2BaZfh1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元在谱系(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba模拟)。由于下面所述的原因，我们称其为VO神经元。这夜gydF4y2Ba^−gydF4y2BaZfh1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO运动神经元为KrgydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, b)，与之前定义的Kr一致gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2BaNB7-1谱系内的GMC [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

U1-U5运动神经元来源于在其末端分裂具有活跃Notch信号的神经元;它们的兄弟神经元缺乏活跃的Notch信号[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．来确定KrgydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元是U1-U5的兄弟，我们为Notch报告基因Hey [gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．不出所料，所有U1-U5运动神经元均瞬时表达Notch报告基因Hey，导致晚出生神经元(U4/U5)表达强，早出生神经元(U1-U3)表达弱。重要的是,基米-雷克南gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元也表达Hey(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bac)，因此KrgydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元不是U型同胞神经元。这进一步支持了我们的结论，即它起源于第四胎氪gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2BaNB7-1谱系中的GMC [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

转录因子Eve和Nkx6存在交叉抑制相互作用[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)，提出了KrgydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元可能是Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba．的确，我们证实了KrgydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元为Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).有趣的是，这个Nkx6 .gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba其他腹侧神经元标志物Hb9、Islet、Lim3均为阴性(数据未显示)。我们得出结论，NB7-1谱系产生两种基本的运动神经元:EvegydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元和Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元;出乎意料的是，这些基本类以交替模式从单一祖细胞谱系产生:3 Eve运动神经元> 1 Nkx6运动神经元> 2 Eve运动神经元(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).这是令人惊讶的，也是祖细胞在其谱系内交替细胞类型的少数例子之一(见讨论)。gydF4y2Ba

的Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元投射到腹斜肌gydF4y2Ba

所有的Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba迄今为止所描述的运动神经元投射到腹侧体壁肌肉[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．识别Kr的肌肉目标gydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2BaNkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在NB7-1谱系的运动神经元中，我们首先检测了单个成神经细胞DiI克隆[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]并寻找与已知的U1-U5背肌目标不同的神经支配的肌肉。NB7-1的DiI标记标记了胚胎17期的所有克隆后代，并显示了所有已知的U1-U5背侧和外侧纵向肌肉靶点的神经支配，以及腹斜肌15、16和17通过节段间神经d支(ISNd)的神经支配(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaA).我们独立确认了这些结果gydF4y2BaNB7-1-gal4gydF4y2Ba来驱动GFP的表达，它标记了大部分半节段中所有U1-U5背侧和外侧纵向肌肉目标以及腹斜肌(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac;hemisegments 54/93。这些数据与Nkx6一致gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba夏娃gydF4y2Ba^−gydF4y2BaNB7-1谱系中的运动神经元投射到腹斜肌，但没有单个神经元标记，我们无法做出决定性的匹配。gydF4y2Ba

为了可视化NB7-1谱系中单个运动神经元的形态，我们生成了单细胞翻转克隆(见基因型方法)，用HA随机标记单个神经元(图7 - 1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个”)。此外，我们使用GFP标记谱系中的所有神经元，并使用FasII检测所有运动轴突及其肌肉目标(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一“”)。正如预期的那样，全谱系标记显示腹斜肌神经支配通过ISNd。此外，HA标记还识别出一个单独的运动神经元，该神经元通过ISNd专门针对腹斜肌(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba“——”;增刊。电影gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．该运动神经元有一个靠近中线的同侧树突。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA '，黄色箭头)，与先前确定的支配腹斜肌神经的MN17难以区分[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．因此，我们称其为KrgydF4y2Ba^+gydF4y2BaPdmgydF4y2Ba^+gydF4y2BaNkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNB7-1谱系中的运动神经元为VO运动神经元。gydF4y2Ba

我们接下来想要确定Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO运动神经元与EvegydF4y2Ba^+gydF4y2BaU1-U5运动神经元具有独特的树突形态或运动前神经支配，这是基于它们针对不同肌群的独特轴突所预期的。我们在刚孵出的幼虫中重复了稀疏ha标记实验(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB-B”)，这样我们就可以识别VO运动神经元形态，并在新孵化的幼虫所有腹部运动神经元的透射电镜图谱中识别它[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．根据NB7-1 VO运动神经元的特征性中枢神经系统(CNS)投影和U3和U4之间的细胞体位置，我们在TEM体积中识别出了该运动神经元。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba有趣的是，VO和U3/U4运动神经元具有不同的树突突出(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC’)，以及神经膜内不同的突触后位置(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD, D ')。此外，它们具有独特的运动前输入:VO的顶部输入是A06c和A18b2中间神经元，而U3/U4的顶部输入是A31k和A18a中间神经元[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．我们得出结论，NB7-1谱系产生两种基本的运动神经元:背侧投射EvegydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元和腹侧投射的Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO运动神经元，每个神经元具有不同的形态和连通性。gydF4y2Ba

Kr/Pdm过表达产生异位Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO运动神经元gydF4y2Ba

Hb, Kr, Pdm和Pdm/Cas都在多个神经母细胞谱系中指定了不同的时间身份[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．相比之下，新发现的Kr/Pdm时间单位窗口[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]尚未被测试在指定神经元身份方面的作用。我们想知道Kr和Pdm共表达是否能诱导VO神经元异位。为了验证这一假设，我们特别在NB7-1谱系中过度表达Kr和Pdm (gydF4y2BaNB7-1-gal4 UAS-Kr UAS-Pdm UAS-myr:GFPgydF4y2Ba)．控制总是有一个夏娃gydF4y2Ba^−gydF4y2BaNkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaZfh1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO运动神经元位于Eve之间gydF4y2Ba^+gydF4y2BaU3和U4(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个;量化的gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).相反，Kr/Pdm共表达导致2-3个额外的Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaZfh1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO运动神经元(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bab;量化的gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).我们注意到Kr/Pdm过表达不能改变早期的时间特征(HbgydF4y2Ba^+gydF4y2BaU1/U2和KrgydF4y2Ba^+gydF4y2BaU3神经元)，类似于晚期TTF无法改变早期TTF细胞命运[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．我们认为Kr/Pdm TTFs可以诱导Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO运动神经元的鉴定始于NB7-1谱系的第四分支。Kr/Pdm是否直接或间接地起到促进作用尚不清楚gydF4y2Bankx6gydF4y2Ba表达式(见讨论)。gydF4y2Ba

我们接下来问Kr/Pdm共表达是否会延迟晚出生Eve的产生gydF4y2Ba^+gydF4y2BaU4-U5运动神经元出生后直到异位VO运动神经元(谱系扩展模型)，或取代EvegydF4y2Ba^+gydF4y2BaU4-U5运动神经元与异位VO运动神经元(转换模型)。这两种结果都是在其他时间转录因子的错误表达后观察到的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．我们在NB7-1谱系中过表达Kr/Pdm (gydF4y2BaNB7-1-gal4 UAS-Kr UAS-Pdm UAS-myr:GFPgydF4y2Ba)，并分析了夏娃的命运gydF4y2Ba^+gydF4y2BaU1-U5运动神经元。在对照组中，我们总是观察到五个夏娃gydF4y2Ba^+gydF4y2BaU1-U5运动神经元，包括两个RuntgydF4y2Ba^+gydF4y2BaU4/U5运动神经元(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bad;量化的gydF4y2Ba4gydF4y2Baf).相反，Kr/Pdm过表达导致Runt缺失gydF4y2Ba^+gydF4y2BaU4/U5运动神经元(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bae;量化的gydF4y2Ba4gydF4y2Baf).我们得出结论，Kr/Pdm在NB7-1谱系中过表达会产生异位Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba以后期出生的U4/U5运动神经元为代价的VO运动神经元，支持转换模型(总结于图。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag)。gydF4y2Ba

Kr/Pdm过表达产生异位Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba正确投射到腹斜肌的运动神经元gydF4y2Ba

在上一节中，基于分子标记，我们展示了Kr/Pdm过表达可以诱导异位VO运动神经元。在这里，我们确定Kr/Pdm过表达是否可以产生异位VO运动神经元，正确地投射到腹斜肌。我们使用gydF4y2BaNB7-1-gal4gydF4y2Ba以驱动Kr/Pdm的长时间共表达，膜靶向GFP显示轴突投影，FasII识别腹斜肌的ISNd分支。在对照组中，NB7-1子代投射在ISNd支配腹斜肌(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,年代gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,年代gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba；ISNd轴突体积量化见图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．随着Kr/Pdm在NB7-1谱系中特异性过表达，我们检测到ISNd轴突体积增加(图7 - 1)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB,年代gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,年代gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba；量化在图中。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC)，与异位VO运动神经元通过ISNd到达腹斜肌的正常VO通路一致。为了最终证明多个异位VO运动神经元靶向ISNd，我们使用了多色翻转(MCFO) [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba在NB7-1谱系的不同神经元上表达HA和V5。随着Kr/Pdm在NB7-1谱系中特异性过表达，我们发现NB7-1谱系具有不同的HAgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和5gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元通过ISNd投射到腹斜肌(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaD).我们得出结论，延长Kr/Pdm共表达足以产生正确投射出ISNd神经根支配腹斜肌的VO运动神经元。因此，Kr/Pdm诱导分子和形态正常的VO运动神经元。gydF4y2Ba

Nkx6是NB7-1谱系中产生VO运动神经元的必要和充分条件gydF4y2Ba

我们在上面已经证明了Kr/Pdm的TTF组合可以诱导Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba投射到腹斜肌的运动神经元。这就提出了一个问题，从Kr/Pdm到Nkx6到VO运动神经元身份是否存在线性遗传途径，或者Kr/Pdm是否驱动VO运动神经元身份所需的多个基因的表达。因此，我们询问Nkx6单独是否足以指定VO运动神经元的身份。在对照组中(gydF4y2BaNB7-1-gal4 UAS-myr:绿色荧光蛋白gydF4y2Ba)，我们总是探测到U1-U5 EvegydF4y2Ba^+gydF4y2BaZfh1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元和单个Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaZfh1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO运动神经元(图;gydF4y2Ba6gydF4y2BaA).相反，Nkx6的过表达(gydF4y2BaNB7-1-gal4 UAS-myr:GFP UAS-Nkx6gydF4y2Ba)，产生U3-U5 Eve的损失gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元和异位VO运动神经元(图;gydF4y2Ba6gydF4y2BaB;量化的gydF4y2Ba6gydF4y2BaE)。当我们通过RNAi降低Nkx6水平时，观察到相反的表型(gydF4y2BaNB7-1-gal4 UAS-myr:GFP UAS-Nkx6-RNAigydF4y2Ba): Nkx6的损失gydF4y2Ba^+gydF4y2BaZfh1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO和运动神经元产生单个异位EvegydF4y2Ba^+gydF4y2BaZfh1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元(图;gydF4y2Ba6gydF4y2BaC;量化的gydF4y2Ba6gydF4y2BaE)。我们得出结论(1)Nkx6对于从谱系中的第四个GMC巩固VO运动神经元命运是必要的，因为没有Nkx6，这个GMC会生成第六个EvegydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经元;(2)在NB7-1谱系中产生第四个GMC后，Nkx6足以指定VO运动神经元身份。gydF4y2Ba

接下来，我们询问Nkx6是否足以产生正确靶向腹斜肌的VO运动神经元。在野生型中，NB7-1总是产生一个运动神经元，该运动神经元从ISNd出口并以腹斜肌为目标(图7 - 1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个;的ISNd投影量gydF4y2Ba7gydF4y2Bad). Nkx6在NB7-1谱系中的过表达产生额外的ISNd和腹斜肌神经支配(图7 - 1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab;量化在图中。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad,年代gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．重要的是，当NB7-1谱系中的单个神经元被MCFO标记时，观察到相同的表型，表明谱系中的两个不同神经元支配ISNd(图7 - 1)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac)，表明至少有一个异位VO神经元可以准确地投射出ISNd。这些结果总结在图中。gydF4y2Ba7gydF4y2Bae.相反，当我们通过RNAi降低Nkx6水平时(gydF4y2BaNB7-1-gal4 UAS-myr:GFP UAS-Nkx6-RNAigydF4y2Ba)，我们检测到ISNd投影的丢失(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Baf;与图比较。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).我们得出结论，Nkx6是产生VO运动神经元的必要和充分条件，这些运动神经元通过ISNd投射到腹斜肌。此外，我们的数据支持Kr/Pdm ttf诱导Nkx6表达的线性途径，该表达指定了VO运动神经元的分子和形态特征(见讨论)。gydF4y2Ba

Kr/Pdm共表达已在几种神经母细胞谱系中检测到[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，但直到现在还没有证据表明这种TTF组合可以指定神经元身份。我们之前已经证明Kr/Pdm窗口生成Kr/Pdm GMC [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba(图SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，这里我们展示了这个GMC生成了一个Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba腹侧突出运动神经元。Kr/Pdm是直接激活还是间接激活尚不清楚gydF4y2Bankx6gydF4y2Ba表达式。的gydF4y2Bankx6gydF4y2Ba该基因位于一个45 kb的无基因区域，在这个基因组区域中只有少数稀疏的预测Kr或Pdm结合位点。Kr和Pdm如何一起指定一个命运(Nkx6gydF4y2Ba^+gydF4y2BaVO运动神经元)，而Kr或Pdm单独指定完全不同的命运(EvegydF4y2Ba^+gydF4y2Ba背侧运动神经元)?Kr/Pdm共同激活的靶基因可能不同于单独激活的靶基因。例如，Kr/Pdm组合可能直接激活nkx6表达，而单独两者都没有这种潜力。单细胞转录组和ChIP研究的出现[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]将有助于揭示Kr/Pdm ttf组合与Kr或Pdm单独相比如何产生不同的细胞命运输出。gydF4y2Ba

Nkx6的生产gydF4y2Ba^+gydF4y2BaKr/Pdm窗口的VO运动神经元中断Eve的顺序生成gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNB7-1谱系中的背侧运动神经元，导致该谱系中基本运动神经元产生的变化。这是不寻常的，因为在大多数情况下，具有相似形态或功能的神经元是在一个谱系中一起产生的。在哺乳动物中，祖细胞首先产生神经元，然后是神经胶质[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba];我们不知道>神经元和>神经元是由单一谱系产生的。同样的,gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba中枢脑神经母细胞谱系产生蘑菇体γ神经元，然后是α ' /β '神经元，最后是α/β神经元，没有证据表明交替或穿插的命运[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．在腹部NB3-3谱系中，早出生的细胞处于机械敏感回路中，而晚出生的细胞处于本体感觉回路中[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．据我们所知，两种形态神经元交替产生的唯一可能的例子是在gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba外侧触角叶成神经细胞谱系，在单肾小球和多肾小球(AMMC)投射神经元之间交替[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．需要使用克隆和时间标记工具来检查其他谱系，以确定产生NB7-1谱系中时间交错神经元亚型的谱系的患病率。gydF4y2Ba

Kr/Pdm或Nkx6过表达只能诱导NB7-1谱系中2-3个异位VO运动神经元。显然，并不是所有的神经元都能对这些转录因子做出反应。由Hb和Kr (U1-U3)指定的早期出生的时间身份不受Kr/Pdm或Nkx6过表达的影响，这与先前的数据相似，表明早期的时间命运不受多个谱系中后期ttf过表达的影响[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．这仍然是一个谜gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba过表达Kr/Pdm后，U3神经元不会向VO命运转变。可能需要相等水平的Kr和Pdm来指定VO命运，尽管这不能解释为什么Kr/Pdm过表达转换PdmgydF4y2Ba^+gydF4y2BaU4运动神经元的VO命运。或者，可能存在早期染色质景观，阻断了对相关Pdm靶位点的访问。gydF4y2Ba

我们注意到我们的VO神经元鉴定是在新孵化的幼虫中完成的。虽然此时的运动电路还能正常工作，但幼虫还能多生长5天。我们没有关于异位VO运动神经元是否有功能或在幼虫的一生中保持的数据。这将是未来的一个重要问题。gydF4y2Ba

Nkx6和Eve存在交叉抑制作用[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，但有一些局限性:早产的夏娃gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元不受Nkx6过表达的影响(我们的工作和参考文献[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba])。野生型动物甚至在Eve中出现零星的Nkx6表达gydF4y2Ba^+gydF4y2BaU2运动神经元(数据未显示)，但在这些神经元中，它对Eve的表达没有影响，也没有促进靶向腹斜肌。在产生Eve的神经母细胞的早期谱系中，似乎有一种机制可以阻断内源性或过表达的Nkx6功能gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba运动神经元。“保护”早出生的夏娃的机制gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba来自Nkx6抑制Eve的神经元是未知的。早期谱系可能缺乏Nkx6辅因子;Nkx6可能通过早期谱系中缺失的中间转录因子间接起作用;早期ttf Hb或Kr可能阻断Nkx6功能;或者是gydF4y2Ba夏娃gydF4y2Ba基因座可能位于Nkx6无法到达的亚核区域。gydF4y2Ba

Nkx6促进了两者的运动神经元规范gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba脊椎动物[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba， Nkx6的缺失使腹侧投射运动神经元数量减少，Eve数量增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经元，而过度表达增加腹侧投射运动神经元的数量，以Eve为代价gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba神经元(我们的工作和[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．在脊椎动物中，Nkx6家族成员Nkx6.1/Nkx6.2似乎在运动神经元规范中发挥更广泛的作用。Nkx6.1/Nkx6.2在pMN区域早期表达;Nkx6家族突变小鼠缺乏大部分体细胞运动神经元;Nkx6.1在鸡或斑马鱼中过表达可诱导异位运动神经元[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．研究脊椎动物Nkx6.1/Nkx6.2是否需要抑制特定的运动神经元身份，这将是很有趣的，类似于Nkx6和Eve之间的拮抗关系gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

所有区域的神经母细胞gydF4y2Ba果蝇gydF4y2Ba中枢神经系统(大脑、腹侧神经束、视神经叶)利用TTF级联产生神经元多样性[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，但对TTF靶基因的了解较少。ttf很可能诱导神经元中持续存在的转录因子组的表达，并赋予它们的身份。例如，可包括指定成人腿部运动神经元树突投射的“形态转录因子”[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]，但在这种情况下，这些转录因子是否控制了成人运动神经元身份的所有其他方面仍然未知。有可能“形态转录因子”是一个更广泛的调控层的下游模块，类似于中末端选择基因gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba［gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们发现了从Kr/Pdm到Nkx6的线性通路，该通路指定了VO运动神经元的身份。ttf可以通过两种非互斥机制起作用:诱导稳定的转录因子组合代码来巩固神经元身份，或通过改变染色质景观来对运动神经元基因表达产生可遗传的、持久的影响。我们观察到Nkx6在Kr/Pdm表达减弱后仍保留在VO神经元中(数据未显示)支持前一种机制。识别Kr/Pdm或Nkx6靶基因可以更全面地了解TTF对神经元身份的规范。gydF4y2Ba

在这项工作中提出的结果导致几个有趣的方向。其他雏形VNC谱系显示Kr/Pdm窗口;这个窗口会在这些谱系中产生神经元吗?在Kr/Pdm窗口出生的神经元有共同的特征吗?此外，异位VO神经元是否与腹斜肌形成功能突触前，它们是否有正常的输入到它们的树突突触后?只有少数病例显示ttf诱导的神经元在功能上集成到适当的电路中[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．Kr和Pdm已在脊椎动物中发现。在脊椎动物中寻找Kr和Pdm的双表达可能会揭示其在指定时间身份方面的作用，类似于Hb和Cas ttf具有指定时间身份的脊椎动物orthors的证据[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

飞的股票gydF4y2Ba

男性和女性gydF4y2Ba黑腹果蝇gydF4y2Ba被使用。基因型旁边显示了转基因的染色体和插入位点(如果已知)。先前发表的gal4系、突变体和报告使用的是:gydF4y2BaNB7-1-gal4gydF4y2Ba^KZgydF4y2Ba(2) (gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),被称为gydF4y2BaNB7-1-gal4gydF4y2Ba在这里;gydF4y2Ba10 xuas-ivs-myr: sfGFP-THS-10xUAS (FRT.stop)最高产量研究::smGdP-HAgydF4y2Ba(RRID: BDSC_62127);gydF4y2BaUAS-nkx6gydF4y2Ba(RRID: BDSC_9932);gydF4y2BaUAS-nkx6gydF4y2Ba^{RNAigydF4y2Ba}(RRID: BDSC_61188);gydF4y2BaUAS-KrgydF4y2Ba(II及III) [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba];gydF4y2BaUAS-Pdm2gydF4y2Ba(II及III) [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba];gydF4y2Bahs-FLPG5.PEST.OptgydF4y2Ba(RRID: BDSC_77140);gydF4y2Bahs-FLPG5。PEST, 10xUAS(fr .stop)myr::smGdP-OLLAS 10xUAS(fr .stop)myr::smGdP-HA 10xUAS(fr .stop)myr::smGdP-V5-THS-10xUAS(fr .stop)myr::smGdP-FLAGgydF4y2Ba(RRID: BDSC_64086)。gydF4y2Ba

免疫染色和成像gydF4y2Ba

一抗为:小鼠抗eve (5 μg/mL, DSHB, 2B8)，兔抗eve #2472 (1:100, Doe实验室)，小鼠抗fasii (1:50, DSHB, 1D4)，鸡抗gfp (1:100, RRID:AB_2307313, Aves Labs, Davis, CA)，兔抗ha表位标签，DyLight™549偶联(1:100,Rockland, 600-442-384，利默里克，PA)，大鼠抗ha (1:100, MilliporeSigma, 11,867,423,001，圣路易斯，MO)，豚鼠抗hey(1:100，剑桥大学S. Bray赠送)，豚鼠抗kr (1:50, Doe实验室)，大鼠抗nkx6 (1:50, J. Skeath赠送)，圣路易斯华盛顿大学)，大鼠抗pdm2 (abcam, ab201325，剑桥，马萨诸塞州)，豚鼠抗runt(1:1000，来自纽约大学C. Desplan的礼物)，鸡抗v5 (Bethyl Laboratories, Inc.)。A190-118A, Centennial, CO)，兔子抗zfh1(1:1000，来自R. Lehman，纽约大学)，豚鼠抗zfh1(1:1000，来自J. Skeath，华盛顿大学圣路易斯分校)，以及。荧光团偶联二抗来自Jackson免疫研究公司(West Grove, PA)，使用比例为1:200。gydF4y2Ba

胚胎及整个刚孵出的幼虫按先前所述固定及染色[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．在某些情况下，幼虫大脑在PBS中解剖，在4%的多聚甲醛中固定，然后按照所述的方法进行染色[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．样品被安装在vectasshield (Vector Laboratories, Burlingame, CA)或DPX [gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

使用蔡司LSM 710或蔡司LSM 800共聚焦显微镜拍摄图像gydF4y2BazgydF4y2Ba分辨率为0.35 μm。由于所检测的每个标记的复杂三维模式，我们无法在最大强度投影中显示NB7-1子代标记的表达，因为z轴上不相关的神经元掩盖了感兴趣的神经元;因此，NB7-1子代从它们独特的z轴位置蒙太奇，同时保留它们的X-Y位置。这是在Figs完成的。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．图像处理使用开源软件FIJI (gydF4y2Bahttps://fiji.scgydF4y2Ba)．在Adobe Illustrator (Adobe, San Jose, CA)中组装图形。三维重建和水平调整是使用Imaris (Bitplane，苏黎世，瑞士)生成的。任何水平调整都适用于整个图像。gydF4y2Ba

标准化ISNd体积的量化gydF4y2Ba

为了产生可靠的体积指标来确定ISNd神经大小的变化，使用FasII染色在共聚焦图像堆栈的3D IMARIS体积中识别SNc，以归一化胚胎年龄和发育的方差。SNc被选择归一化，因为我们观察到它不受我们基因操作的影响。使用默认参数分别在FasII通道标记SNc和ISNd上生成表面，生成精确的体积测量。然后，我们使用这些体积测量来生成用于统计分析的ISNd/SNc比率(见图S)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这一指标在野生型对照中表现出低方差，允许与基因操纵胚胎进行准确比较。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

统计学意义以星号表示:****gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;＊＊＊gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001;**gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01;＊gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;n.s.，不重要。进行了以下统计检验:Mann-Whitney U检验(非正态分布，非参数)(双尾gydF4y2BapgydF4y2Ba值)(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2BaC f i j，gydF4y2Ba6gydF4y2BaD);韦尔奇t检验(正态分布，非参数)(双尾gydF4y2BapgydF4y2Ba值)(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC,gydF4y2Ba7gydF4y2Bad).所有分析均使用Prism8 (GraphPad)进行。结果以平均值±s.d表示。，除非另有说明。gydF4y2Ba

我们发现，一个神经母细胞谱系产生交错的主要运动神经元命运;Kr/Pdm TTFs形成了一个新的时间识别窗口，促进Nkx6的表达;Kr/Pdm > Nkx6通路是确定VO运动神经元身份和形态的必要和充分的。gydF4y2Ba

没有生成数据集。没有产生新的苍蝇库存，所有的苍蝇库存都可以从公共库存中心或根据要求获得。gydF4y2Ba

伊芙:gydF4y2Ba

甚至没有gydF4y2Ba

TTF:gydF4y2Ba

时间转录因子gydF4y2Ba

签证官:gydF4y2Ba

腹侧斜gydF4y2Ba

Hb:gydF4y2Ba

驼背gydF4y2Ba

基米-雷克南:gydF4y2Ba

KruppelgydF4y2Ba

中科院:gydF4y2Ba

CastorgydF4y2Ba

NB7-1-gal4:gydF4y2Ba

NB7-1分裂gal4gydF4y2Ba

中枢神经系统:gydF4y2Ba

中枢神经系统gydF4y2Ba

OE:gydF4y2Ba

超表达gydF4y2Ba

我们感谢Alice Schmid为图中的DiI克隆。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, Ellie Heckscher, Judith Eisen和Emily Heckman对手稿的评论，Sarah Bray, Claude Desplan, Ruth Lehman, Jim Skeath和Stefan Thor对苍蝇股票和/或抗体的评论。我们感谢Bloomington库存中心(NIH P40OD018537)提供的苍蝇库存，以及DSHB提供的抗体。gydF4y2Ba

这项工作由HHMI (S-LL,CQD)， NIH R01 HD27056 (CQD)和T32 HD007348 (AQS)资助。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 霍华德休斯医学研究所，神经科学研究所，俄勒冈大学，尤金，OR, 97403，美国gydF4y2Ba

   Austin Seroka, Rita M. Yazejian, senlin Lai和Chris Q. DoegydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

a.q. S.-L。L和c.q.d构想了这项工作。a.q.， r.m.y和s.l.l.进行了实验并分析了结果。所有作者都参与了手稿的撰写。作者阅读并批准最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaSen-Lin赖gydF4y2Ba或gydF4y2Ba克里斯·多伊gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用;没有脊椎动物或人类实验对象。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

所有作者都同意了这份手稿。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

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