MITF基因突变引起囊毛细胞变性

背景

Waardenburg综合征(WS)是一种遗传性常染色体显性突变导致耳蜗血管纹(SV)中间细胞早期退化和严重听力损失的结果。WS患者也可能出现原发性前庭症状。目前的WS研究大多未讨论WS与前庭功能异常之间的关系。我们的研究发现，一只自发突变猪表现出严重的听力损失和脱色。MITF-M是一种常见的导致WS型的基因突变，它影响SV中间细胞的发育，然后被确定为动物模型。

结果

在这项研究中，在MITF-M的猪中发现前庭毛细胞的退化。用电镜观察了猪胚胎第E70天至出生后2周前庭器官毛细胞的形态。本研究发现突变球囊中E95到P14的毛细胞明显减少。相反，胞囊和半圆形管均无毛细胞损失。

结论

我们的研究表明MITF-M基因突变仅影响球囊毛细胞，而对其他前庭器官无影响。研究还表明，耳蜗毛细胞和囊泡毛细胞的存活依赖于耳蜗SV的钾释放，而胞囊和半圆管毛细胞的存活与SV无关。

平衡系统主要依靠前庭器官，前庭器官为我们的体位提供内部参考。1］．毛细胞是前庭器官中唯一能检测到线性或旋转头部运动的感觉细胞。重要的是要注意，哺乳动物的前庭器官是在胚胎发育期间形成的，这些器官中的毛细胞的损伤是不可逆的。2，3.］．衰老、遗传缺陷或耳毒性药物引起的前庭毛细胞损失可导致严重的平衡障碍[4］．前庭功能受损表现为运动时眼球运动、凝视和姿势反应异常[1］．

动物模型是研究前庭毛细胞退化机制和评价其对前庭功能影响的重要工具。荣昌猪，被称为“熊猫猪”，其特点是眼睛周围有黑色的圈。我们之前的工作报道了一种小型猪耳聋和脱色的表型，这是由小眼相关转录因子(MITF)基因黑素细胞特异性启动子区域的突变引起的[5］．MITF-M亚型的这种表达类似于人类Waardenburg综合征II型(WS2)的典型表型，其特征为严重听力损失、虹膜异色症和白色额发[6，7］．在这项研究中，我们描述了表现出ws2样表型的相同猪模型，包括皮肤、皮毛和虹膜的脱色、自发性耳聋以及囊泡功能减退(图2)。1)．耳蜗小囊变性的相关研究讨论了其在多种动物模型中的影响(小鼠[8),猫(9]，狗[10，11]，貂皮[12])及人类[13］．

先前的研究报告了被诊断为WS的患者存在平衡问题。Marcus等人研究了22例WS患者的前庭功能测试结果，总结出一种常见的前庭功能紊乱[14］．Black [15]，泽利格[16]，斯托勒[17]、哈格曼及戴勒曼[7]，希尔德斯海默[18]，也发现WS患者前庭功能异常。然而，哈格曼研究了25名WS患者，发现与其他先天性听力损失患者没有明显差异。Hageman认为前庭功能障碍不应被认为是WS的必要症状[7］．Thorkilgaard等人也报道了WS患者的正常前庭功能[19］．因此，前庭功能异常是否应作为WS患者的特征性表现之一尚不明确。

MITF-M基因突变是一种已知的导致WS的基因突变，很少有研究测试MITF-M基因突变对前庭功能的影响。因此，在本研究中，我们评估了MITF-M突变动物前庭器官的形态特征。

mitf突变猪和野生型猪的形态性能

Micro-CT扫描及三维重建

对野生型猪和白化猪进行Micro-CT扫描。对比CT图像，野生型猪与白化猪之间无明显差异。5个前庭器官的迷宫均未见异常增生，前庭导水管也未见异常增生，尤其未见扩张。2A和b)。

根据重建的内耳三维模型，在野生型猪和白化猪中发现了耳蜗、前庭和半规管的完整空间结构(图2)。2c、d).野生型猪与白化猪的形态比较无显著差异。三个半规管置于正交位置，彼此之间形成大约90度。

前庭系统扫描电镜结果

图中很好地描述了野生型猪和白化猪囊状毛细胞的比较。3.．WT型小型猪的囊泡毛细胞发育良好，且数量均可计数。3.A(1-2)，为了更好的视野，切除耳廓)。相比之下，白化猪的毛细胞明显减少(图2)。3.b(1 - 2))。耳孔缺失，静纤毛稀疏且不典型，甚至在突变球囊中几乎不存在。扫描电镜结果表明，囊内大量毛细胞丢失与MITF-M基因突变有关。

野生型猪和白化猪的胞囊上皮表面均有一层厚厚的耳孔。(无花果。4白化猪与野生型猪相比，小囊内耳孔未见明显减少。

图中显示了野生型猪和白化猪水平管壶腹嵴中的毛细胞。5．野生型和突变型猪壶腹毛细胞未见明显病变。壶腹嵴毛细胞密度无差异，提示MIFT-M突变对壶腹毛细胞无影响。

MITF-M突变模型在出生后14天观察到严重的囊状毛细胞塌陷。为了研究这种退化是否是先天的，我们检查了四个关键的发育时间点，即E70, E95, P1和P14(图7)。6)．与P14相似，与野生型相比，E95和P1的前庭毛细胞普遍减少也很明显。E70处的囊泡毛细胞完整且可计数。这一结果表明，毛细胞损伤发生在细胞发育过程中。在整个发育阶段(E70 ~ P14)，胞囊和半规管均未见毛细胞损伤。

微型猪的前庭功能

VEMP的结果

WT型小型猪咬肌VEMPs波P潜伏期为7.60±0.78 ms，平均振幅为1.31±0.28 μV。在声压级为100、90和80 dB时，VEMP振幅的降低率分别为100、75和100%。而突变猪则表现为诱发电位缺失。VEMP的阈值为80 dB SPL。7)．

运动的结果

在使用庆大霉素前，WT型小型猪的平衡行为正常，无倾斜，无身体摇摆。猪左侧中耳单侧注射庆大霉素后，开始出现向左侧(受损侧)倾斜的运动，并形成绕行轨迹。这种情况可能是暴露于庆大霉素后前庭毛细胞损伤的结果[22这引起了眩晕。白化猪经庆大霉素治疗后，在运动过程中表现出类似的眩晕行为和运动轨迹。左耳注射庆大霉素引起逆时针摇摆。本试验表明白化病猪壶腹毛细胞的存活具有一定的功能。

我们报告了在猪中发现的自发性听力损失模型。该突变在小眼相关转录因子基因(Mitf)的黑素细胞特异性启动子的非调控区域被发现。它引起耳蜗SV中间细胞早期变性和严重的听力损失[5］．本文研究了MITF-M基因突变对前庭神经发育的影响。我们在扫描电镜下检测到MITF-M突变猪的囊泡毛细胞的严重损伤。一致地，在猪模型中未发现VEMP反应，提示球囊功能受损。有趣的是，在E70岁时，囊状毛细胞的损失仍然存在，这表明这种毛细胞损伤不是固有的，而是在发育过程中引起的。MIFT-M基因突变对胞囊、半圆管和骨迷宫中的毛细胞无影响。

MITF基因在WS2哺乳动物中起着至关重要的作用，包括人类[5］

我们的发现与这一结果一致，表明WS不仅引起听力损失，而且还影响前庭器官。利用猪突变模型，我们的研究提供了强有力的证据，证明MITF-M基因突变可引起WS并损害球囊的发育，而不干扰胞囊或半规管。为了验证MITF-M基因突变在前庭器官的出现，我们用扫描电镜观察了3周小鼠前庭器官的各种发育情况。类似的严重毛细胞损失在MITF小鼠的球囊中也很明显(图。8)．

血管纹和前庭暗细胞参与内耳液体的产生[23]，其内稳态对正常的听力和平衡功能至关重要。为什么球囊是前庭系统中唯一受影响的部分?众所周知，耳蜗部分的高浓度钾是由SV的边缘细胞维持的。SV还负责产生耳蜗电位(endocochlear potential, EP)，这是毛细胞将机械刺激转化为电信号的驱动力[24］．最近的研究表明K⁺通道和中间细胞在EP和K中至关重要⁺运输(25，26］．我们之前的研究表明，白化病猪SV中明显缺乏中间细胞[5]，这会影响内淋巴电位[23］．K的还原⁺钙离子流入内淋巴引起静息膜电位下降，从而导致钙离子流入内淋巴^{2 +}漏入，导致毛细胞去极化，最终会引发Ca^{2 +}−介导的凋亡[24］．前庭系统钾循环(暗细胞部分)的过程与耳蜗相同，只是前庭终器官以前不存在中间细胞[23］．我们的结果表明，耳蜗毛细胞和囊泡毛细胞的存活依赖于耳蜗SV的钾释放，而胞囊和半圆形管的毛细胞则不依赖于SV。应注意的是，耳蜗迷路和前庭迷路可能有独立的内淋巴分泌系统[27］．囊壁内既不存在暗细胞，也不存在边缘细胞，高钾的来源通常被认为是耳蜗内的重聚管[28］．除球囊外，所有前庭终器官均有暗细胞，豚鼠、蝙蝠、负鼠、猫、恒河猴和人均有暗细胞[27］．

我们的动物模型对研究耳石在头部定向信号检测和转导中的作用也有潜在的价值。球囊损伤可能会影响颈部和四肢的代偿性运动，因为球囊神经激活的目标是颈部、前肢、背部肌肉和颈部运动间神经元[29］．此外，前庭刺激通过减少头向细胞和位置细胞的活性来调节海马的形成[30.］．缺乏这种刺激可能导致空间记忆缺陷[31]和海马选择性萎缩[32，33］．

由于扫描电镜提供了感觉上皮的相关“表面”视图[34，35]，前庭神经的功能和完整性具有重要意义，值得我们进一步研究。只有3%的囊性激活神经元有直接上升分支到动眼肌核[29]，本文未涉及的VOR分析也应在此之后进行讨论。

动物

本试验选用重庆市畜牧科学院动物养殖场饲养的荣昌猪，猪龄为胚胎期47天至产后2个月。选取成年猪(P-6 m)进行前庭功能试验。带有MITF-M突变的白化猪的特征是眼睛周围没有黑环(图2)。1b)和虹膜异色症(图。1d).以正常荣昌猪为对照组(图。1a).本研究经中国人民解放军总医院机构动物护理使用委员会批准。

前庭功能测验

耳石功能测试

前庭诱发肌原电位(VEMPs)通常用于客观评估人和动物的囊泡功能，在两头0.5岁的小型猪(一头野生型和一头白化猪)中记录[20.］．通过观察野生型猪和突变型猪的步态、头部摆动、躯干扭转和旋转，来检测前庭神经紊乱。VEMP试验采用3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)和苏绵心II (0.1 ml/kg)麻醉猪。由于咬肌比颈伸肌更容易手术暴露，我们记录了咬肌的反应进行VEMP测试[21］．开阔场声刺激诱发VEMP反应。记录电极插入下三咬肌，参考电极插入鼻尖。接地电极插入顶点的头皮。在上下门牙之间放置一个橡胶球，打开下颚，激活咬肌。通过插入耳道的ER3A耳机，以1 kHz(每秒5次)的音调爆发诱发VEMPs的反应。肌源性信号用带通滤波器(30 - 1000hz)放大100k，并用Smart-EP软件(Intelligent Hearing Systems, Miami, USA)进行记录。信号平均128次，分析窗口为50 ms。声压级为100 dB时，声压级为10 dB时，声压级逐渐减小，直至波形消失。以阈值水平连续收集两次记录，以验证重复性和稳定性。 Three more pigs in each group were tested to confirm the results.

运动测试

在1只野生型猪和1只白化猪中，观察了鼓室内注射庆大霉素(在一只耳朵)对运动的影响。庆大霉素可通过圆窗膜迅速扩散到内耳，使周围前庭功能下降。单次鼓室内应用庆大霉素可导致自发性前庭活动严重减少[22]并可能导致异常的旋转行为。在我们的研究中，测试是在一个光线充足的房间里进行的，猪被允许在一个直径2米的圆内自由漫步。每组再测试3头猪以确认结果。

前庭器官形态学评估

Micro-CT扫描及三维重建

为了进行形态学评估，使用过量的脲烷(1.5 g kg)处死动物⁻¹)．猪的左颞骨(野生型(WT)猪(n= 4)及白化猪(n(4))被剖开，露出中耳和内耳。所有样品均采用体素尺寸为39 μm的高速Micro-CT系统(PerkinElmer Inc.， Norwalk, CT, USA)进行扫描。然后使用MIMICS (materiises交互式医学图像控制系统，比利时)进行三维图像构建。

扫描电子显微镜(SEM)样品制备

选取出生后14日龄的猪(正常猪1头，白化猪1头)，研究MITF-M突变对前庭器官的影响。每头猪在全身麻醉下吸入乙醚处死。将所有左内耳用2.5%戊二醛固定在0.1 M含2 mM氯化钙的碳酸钠缓冲液(pH 7.4)中₂．用PBS溶液洗涤样品，在含1% OsO的PBS溶液中固定15 min₄．在一系列分级乙醇中脱水(高达100%)后，样品被干燥并安装在铝存根上。然后溅射涂上金颗粒，在扫描电子显微镜下检查(Hitachi S-3700 N, Hitachi, Tokyo, Japan)。每组再测试3头猪以确认结果。研究结束后，所有样本都被仔细收集并焚烧。

综上所述，本文建立了小型猪囊毛细胞塌陷WS模型。该研究表明，WS模型的主要前庭功能表现为严重的球囊功能减退(无可记录的VEMPs)。其他前庭器官，如胞囊和半规管的毛细胞发育良好。然而，囊毛细胞的损伤不是先天的，而是在胚胎发育阶段引起的。鉴于球囊损害的形态和临床表现，WS患者应考虑耳石功能的临床诊断。我们的结果可以帮助解释WS患者的临床平衡障碍。

CT:

计算机断层扫描

MITF-M:

小眼相关转录因子m

感谢中国人民解放军医学院听力损伤科学重点实验室团队的帮助。

资金

国家自然科学基金(No. 81670940, 81670941, 81570933, 81400472)，北京科技创新基地专项培育发展计划(z151100001615050)，军队健康防护计划(No. 16BJZ18)资助。所有的资助项目都与我们的前庭研究有关。

数据和材料的可用性

本研究中分析的数据集可以根据合理要求从通讯作者处获得。

作者指出

1. 杜毅、任丽丽和江青青对这项工作有同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 听力损伤防治北京市重点实验室，中国人民解放军医学院听力损伤科学重点实验室，中国北京

   杜毅，任丽丽，江青青，刘兴建，季飞，张跃，袁硕龙，吴子明，郭伟伟，杨世明

贡献

所有作者都设计并计划了这项研究。YD、LLR、QQJ、XJL、FJ、YZ、SLY、ZMW收集数据并作为研究参与者。WWG和SHY为发表准备了数据。YD、WWG和SHY撰写了论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Zi-Ming吴，郭萎萎或Shi-Ming杨．

伦理批准并同意参与

本研究经中国人民解放军总医院机构动物护理使用委员会批准。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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