BIN1是小胶质细胞中促炎和神经变性相关激活的关键调节因子gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

的gydF4y2BaBIN1gydF4y2Ba基因座包含第二重要的迟发性阿尔茨海默病遗传危险因素。gydF4y2BaBIN1gydF4y2Ba经历交替剪接产生组织和细胞类型特异性的BIN1异构体，在一系列关键的细胞过程中调节膜动力学。虽然大脑中BIN1在神经元和少突胶质细胞中的表达已被详细描述，但有关小胶质细胞BIN1表达的信息主要局限于大规模的转录组和蛋白质组数据。值得注意的是，BIN1蛋白的表达及其在小胶质细胞(一种与阿尔茨海默病最相关的细胞类型)中的功能作用尚未得到深入研究。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

通过小鼠和人脑免疫染色，以及分离的小胶质细胞或人ipsc衍生的小胶质细胞的免疫印迹和RT-PCR分析小胶质细胞BIN1的表达。gydF4y2BaBin1gydF4y2BasiRNA敲除在体外原代小胶质细胞培养物中的表达，以及在体内Cre-lox介导的成年小鼠大脑小胶质细胞条件缺失。利用NanoString基因板和流式细胞术方法研究了BIN1在体外和体内调节神经炎性小胶质细胞信号的作用。转录组数据通过硅质通路分析和互补分子方法进行验证。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在此，我们研究了小胶质细胞中BIN1的体外和体内表达，并确定了小胶质细胞表达BIN1的异构体。的沉默gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在原代小胶质细胞培养物中，我们证实BIN1通过基因表达和细胞因子产生调节小胶质细胞中促炎和疾病相关反应的激活。我们的转录组分析揭示了关键的内稳态和脂多糖(LPS)诱导的炎症反应途径，以及转录因子PU.1和IRF1，它们受到BIN1的调控。Microglia-specificgydF4y2BaBin1gydF4y2Ba体内条件敲除揭示了BIN1在调节疾病相关基因表达和对抗CX3CR1信号通路方面的新作用。体外和体内研究的一致结果表明gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba小胶质细胞加载1型干扰素响应促炎挑战的能力受损，特别是关键的1型免疫反应基因的上调，gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究结果为小胶质细胞BIN1的功能提供了新的见解，并证明了小胶质细胞BIN1在调节大脑炎症反应和小胶质细胞表型变化方面的重要作用。此外，我们的研究第一次显示了一种调节关系gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba小胶质细胞中有两个与阿尔茨海默病相关的基因。对BIN1进行调节的要求gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba在许多神经退行性疾病的发病和进展过程中，炎症期间的表达上调对炎症反应具有重要意义。gydF4y2Ba

图形抽象gydF4y2Ba

桥接积分器1 (gydF4y2BaBIN1gydF4y2Ba)是全基因组关联研究发现的晚发性阿尔茨海默病(LOAD)的一个重要遗传风险因子位点[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．20个中有7个的组织和细胞类型特异性交替剪接gydF4y2BaBIN1gydF4y2Ba外显子产生多个BIN1异构体，其功能域不同，亚细胞定位也不同[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．BIN1亚型参与一系列功能，包括膜重塑、内吞作用、细胞骨架调节和细胞周期[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．神经元BIN1定位于小鼠大脑突触前末梢，通过调节突触囊泡动力学在兴奋性神经传递中发挥不可或缺的作用[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．中央网格蛋白相关蛋白结合区(CLAP结构域)只存在于神经元异构体中，赋予了BIN1与内噬蛋白网格蛋白及其衔接蛋白AP-2相互作用的能力[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．尽管内体途径在β-淀粉样蛋白的产生中具有重要作用，但在阿尔茨海默病(AD)淀粉样变性小鼠模型中，神经元BIN1表达的缺失并不能调节β-淀粉样蛋白病理[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．此外，BIN1可与tau结合，BIN1过表达诱导培养神经元中tau依赖的网络过兴奋性[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，提示BIN1可能通过tau发病机制促进AD风险。BIN1也被证明可以限制培养神经元中致病性tau蛋白的神经元间扩散[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．此外，独立研究已经报道了AD个体中神经元BIN1表达的显著降低[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．后一项发现与BIN1表达增加导致缠结病理的建议不一致。对于这种表面上的不一致，一个可能的解释可能来自于神经元亚型(iso 1)的减少与无处不在亚型(iso 9)的增加相一致的观察[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在中枢神经系统中，普遍存在的缺乏CLAP结构域的BIN1异构体在神经元和非神经元细胞中表达，最显著的是在人脑白质中的少突胶质细胞中表达[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．有趣的是,高层gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在急性分离的小鼠和人类大脑小胶质细胞的大规模数据集中，已经报道了转录物和蛋白的表达(图SgydF4y2Ba1gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．此外，在野生型小鼠和AD病理小鼠模型中，gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在定量质谱法测定的丰富小胶质蛋白中处于前20百分位[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．然而，从注射了凋亡神经元的小鼠大脑中分离出的吞噬小胶质细胞中，发现其丰度较低[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，与BIN1潜在的内稳态作用一致。gydF4y2Ba

在人脑蛋白质组学研究中，多标记物基因组注释分析(MAGMA)强调，在小胶质细胞标记中富集的蛋白共表达模块也在AD风险基因中富集，暗示了LOAD发病机制中的小胶质细胞功能障碍[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．小胶质细胞是驻留在中枢神经系统中的免疫细胞，在大脑发育和功能中起着关键作用，包括突触修剪、神经发生和大脑的免疫监视[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．此外，小胶质细胞在神经炎症和神经退行性疾病(包括AD)中发挥着重要而复杂的疾病修饰作用，并通过TREM2调节的免疫检查点从稳态状态转变为疾病相关小胶质细胞(DAM)表型[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．最近一项对小鼠小胶质细胞转录组数据集的网络分析也揭示了DAM表型的异质性，即促炎和抗炎DAM子图谱[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．在这个内稳态小胶质细胞的框架下，我们发现AD中的亲和抗炎DAMgydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在稳态基因模块中ad相关基因的模块成员数最高，这提高了BIN1可能在小胶质细胞中发挥功能性和ad相关作用的可能性[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

吞噬和增殖是ad样病变的标志性小胶质细胞反应[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．尽管BIN1在平衡和病理条件下具有调节关键细胞通路和小胶质功能的潜力，但迄今为止的研究在很大程度上忽视了小胶质BIN1表达的特征。似乎，这一疏忽源于之前的研究未能以明确的方式可视化小胶质细胞中的BIN1免疫反应性。在这方面，少突胶质细胞、髓鞘和突触中BIN1的高水平表达导致了不同细胞群的标记;因此，细长的相互密集重叠的bin1阳性突起在整个组织学切片的深度都紧密地聚集在一起[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．因此，较少树突胶质细胞和神经元过程更强烈的染色掩盖了小胶质细胞中BIN1的免疫反应性，为清晰显示小胶质细胞中BIN1蛋白的原位表达提出了技术挑战。gydF4y2Ba

鉴于AD发病机制中小胶质细胞功能障碍和DAM转化的诸多发现[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，研究小胶质细胞BIN1的表达和功能至关重要。本文通过记录小鼠大脑中的小胶质BIN1蛋白，并对小胶质BIN1异构体进行表征，实现了第一层分析。随后，我们通过沉默探讨了BIN1的功能作用gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在小鼠小胶质细胞和条件敲除小鼠(cKO)中表达gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba等位基因在小胶质细胞。利用神经炎症的转录组分析，我们已经确定BIN1是一种内稳态微胶质调节因子，在激活的促炎症反应上游具有非冗余的作用gydF4y2BaApoegydF4y2Ba，gydF4y2BaTrem2,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTyrobp,gydF4y2BaPU.1和IRF1的上游，两者都是小胶质基因表达和向DAM过渡的主要调控因子[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．的损失gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba微胶质细胞对LPS的反应能力严重受损，导致细胞因子产生和基因表达测定的促炎反应减弱。在体内，小胶质细胞丧失gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在lps诱导的神经炎症模型中，除了减少几个DAM基因的上调外，还减弱了促炎基因的表达变化。在体内和体外都一致gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba操纵研究显示，BIN1可调节小胶质细胞1型干扰素反应。重要的是，BIN1被发现调节炎症诱导的表达gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba，一种干扰素反应基因，最近与ad相关机制有关[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．IFITM3促进溶酶体酸化[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba并限制免疫反应细胞因子的产生[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．值得注意的是，IFITM3基因网络在AD患者的大脑和外周血单个核细胞中富集[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]，提示IFITM3在AD病理的小胶质细胞炎症反应中发挥作用。综上所述，这些发现为研究BIN1在小胶质细胞中的表达和功能提供了重要的见解，证明了小胶质细胞BIN1表达在大脑炎症反应中的重要性。gydF4y2Ba

动物，药物管理和收获gydF4y2Ba

所有涉及动物的实验都是根据南佛罗里达大学IACUC指南进行的。gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}株从George C. Prendergast博士(兰克瑙医学研究所)获得[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．gydF4y2BaEmx1gydF4y2Baires -gydF4y2BaCregydF4y2Ba(JAX股票#005628)gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{Litt tm2.1 (cre / ERT2)gydF4y2Ba}JAX股票021160;杂合子小鼠被称为gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba})系列从杰克逊实验室(Bar Harbor, ME)购买。gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}老鼠与gydF4y2BaEmx1gydF4y2Baires -gydF4y2BaCregydF4y2Ba或gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}动物产生gydF4y2BaEmx1gydF4y2Ba^CregydF4y2Ba：gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}（gydF4y2BaEmxgydF4y2Ba^CregydF4y2Ba-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO)和gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}：gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}（gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba(cKO)动物gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．小鼠维持在C57BL6/J背景下。gydF4y2Ba

他莫西芬(10 mg/mL，在10%乙醇和90%葵花籽油溶液中通过涡流和超声制备)通过腹腔注射(100 mg/kg)连续5天。然后小鼠休息4周，让周围单核细胞重新繁殖。然后，连续4天注射(750 μg/kg) LPS(用250 μg/mL无菌盐水溶解，通过0.22 μm注射器过滤器过滤)。末次给药24 h后处死。在每次注射LPS之前，对小鼠进行称重，并监测其疾病和体重减轻情况。所有动物都被过量异氟醚麻醉，并灌注冰冷的PBS。分离脑组织，进行小胶质细胞分离和免疫染色。gydF4y2Ba

免疫荧光染色及成像gydF4y2Ba

脑组织在4℃含4%多聚甲醛的PBS中固定24 h后，进行石蜡包埋处理。5 μm厚的切片在二甲苯中脱蜡，通过乙醇系列水合，在90°C(含0.05%吐温20,pH 6的10mm柠檬酸钠)中进行抗原提取。在0.25% Triton X-100中洗涤和渗透后，在室温下含有10%驴血清、3% BSA和0.1% Triton X-100的缓冲液中孵育1小时，非特异性结合位点被阻断。用于免疫染色的抗体见补充表5。1次抗体用1% BSA (TBS + 0.1% Triton X-100)稀释，加入载玻片，4℃孵育过夜。冲洗后，将荧光标记二抗体加入载玻片，室温孵育2 h。另外，根据制造商的说明，在表位检索和阻断非特异性结合位点之后，在intelliPATH FLX自动染色系统(Biocare Medical)上进行免疫染色。将载玻片与一、二抗体在室温下孵育1 h。在用VectorShield安装介质安装盖套之前，切片在室温下清洗和干燥。图像是在配备了横河旋转盘场扫描共聚焦系统和Photometrics PRIME 95B sCMOS相机的尼康Eclipse Ti2自动显微镜上获得的，使用20X和100X物镜。 High magnificationzgydF4y2Ba-堆栈图像在nisis - elements软件(尼康)中反卷积，使用Fiji/ImageJ处理，并通过平滑流形提取插件转换为2D投影[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

荧光激活的小胶质细胞分选gydF4y2Ba

如前所述，用流式细胞术分离小鼠大脑小胶质细胞[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．简单地说，采集的脑组织在冰上切碎，然后通过一个40 μm的尼龙细胞过滤器和冰过滤的PBS。分散细胞悬液在800 x离心gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4℃，5分钟，颗粒悬浮在含有1x HBSS的35%等渗Percoll溶液中。髓鞘通过离心分离(800 xgydF4y2BaggydF4y2Ba，在15°C, 25分钟)，并从细胞悬浮液顶部取出。Percoll溶液在冰冷的PBS中稀释10倍，800倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C, 5分钟。将小胶质细胞颗粒重悬于300 μl冰冷PBS中。用7-氨基放线菌素D[1:1000]在室温PBS中标记死亡细胞30分钟。然后用APC-Cy7大鼠α-CD11b[M1/70] (BD Pharmingen 557,657)、PE-Cy7大鼠α-小鼠CD45[30- f11] (BD Pharmingen 552,848)和BV421亚美尼亚仓鼠α-CD11c[N418] (BD Horizon 565,452)[均稀释为1:100]在PBS中标记细胞30分钟，然后用PBS洗涤两次。流式细胞术在BD FACS Melody细胞分选机上进行。活细胞经7-氨基放线菌素d阴性染色门控。单个核细胞采用FSC-A/SSC-A和FSC-A/FSC-H进行门控。小胶质细胞分离为CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba收集在PBS中，1000倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba使细胞沉淀2分钟。用于免疫印迹分析的细胞球在干冰上速冻，并在- 80°C保存，直到进一步处理。用于NanoString分析的细胞球团立即在RLT缓冲液(Qiagen)中裂解，在干冰上速冻，并在−80°C保存。gydF4y2Ba

原发性新生儿小胶质细胞分离gydF4y2Ba

采用已建立的分离和富集方案建立小鼠原代小胶质细胞培养物[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．如前所述[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，处死C57BL/ 6j小鼠(P0-3)，解剖脑组织，37°C胰酶消化15min。用20 ml DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)/10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺(青霉素-链霉素-谷氨酰胺)淬火胰蛋白酶后，清洗细胞颗粒，去除髓磷脂碎片。剩下的细胞悬浮液用40 μm过滤器过滤，然后用CD11b过滤gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba使用mini-MACS (Miltenyi Biotec Cat#130-042-201)柱进行正向选择。CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba富集的结果是> 90%纯度的CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质细胞经流式细胞术验证[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．然后将细胞接种到聚赖氨酸包被孔中，在DMEM中培养。24 h后更换新鲜培养基，细胞用于实验。gydF4y2Ba

人类ipsc衍生的小胶质样细胞gydF4y2Ba

从人类血细胞中生成人类iPSC系及其特性先前已有描述[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．人类iPSCs被分化为原始巨噬细胞前体，然后分化为小胶质细胞(iMG)，基本上如上所述[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．原始巨噬细胞前体最终分化为iMG发生在10天以上，细胞在培养中保持至少1个月，然后收集进行免疫印迹和RT-PCR分析。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2BaBin1gydF4y2BaKO BV2池gydF4y2Ba

BV2细胞在添加10%胎牛血清、4 mM l -谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM中培养，37°C和5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．用pLentiCRISPRv2质粒(Genscript)产生的慢病毒转导细胞gydF4y2BaBin1gydF4y2BasgRNA (GAAGGATCTTCGGACCTATC)或非目标sgRNA。选择嘌呤霉素中的稳定转导池gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba通过gRNA靶位点PCR扩增(f -引物:ACTGAGTGGTGGCTGACAAG;r -引物:TGAGTGCCAGAGAATCAGCG)和测序。PCR产物也被克隆到pGEM-T Easy (Promega)中，每个池中有4个克隆个体被测序，以确认目标区域内的缺失。WT和KO池生长到60 -70%时，血清饥饿16小时，再用LPS (0.5 μg/mL)处理16小时，然后收获用于RNA分离或裂解物制备。gydF4y2Ba

Bin1gydF4y2Ba小干扰RNA (siRNA)转染研究gydF4y2Ba

Bin1gydF4y2Ba沉默了gydF4y2BaBin1gydF4y2BasiRNA (sc-29,805 Santa Cruz Biotechnology)和等量的非特异性伪siRNA (sc-37,007)用于对照。使用Lipofectamine™RNAiMAX (Invitrogen)和Opti-MEM (Invitrogen)转染原代小胶质细胞40nm(终浓度)siRNA。48 h后，通过qRT-PCR验证sirna介导的基因沉默的有效性。LPS (10 ng/ml或100 ng/ml, Sigma-Aldrich Cat#L4391，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在siRNA暴露24小时后加入0111:B4)以激活小胶质细胞。激活24小时后收集细胞进行qRT-PCR、NanoString和吞噬研究，收集上清液进行细胞因子测定。的可行性gydF4y2BaBin1gydF4y2Basirna处理的细胞采用活/死染色(Invitrogen)流式细胞术检测，热处理细胞作为阳性对照。gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

在裂解缓冲液(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 0.5% NP-40, 0.5% SDS)中加入1 × Roche cOmplete蛋白酶抑制剂，250 μM PMSF均质提取全脑样品中的蛋白质。DNA是用探头超声器进行超声剪切的。用流式细胞仪分离的小胶质细胞提取蛋白质，用裂解液裂解培养人iMG。用4-20% Bis-Tris凝胶电泳等分蛋白样本，并用兔抗- bin1 (Proteintech 14,647-1-AP, 1:1000)和小鼠抗-β-actin (Proteintech 66,009-1-lg, 1:5万)抗体检测印迹。用IR680-和ir800结合的二抗培养印迹，用奥德赛红外成像系统(Li-COR Biosciences)成像。gydF4y2Ba

RT-PCR和亚型定量gydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用DirectZol试剂盒(Zymo)从组织和细胞中提取RNA。使用上标IV (Invitrogen)逆转录RNA，使用Phusion聚合酶(NEB)进行pcr。PCR引物设计跨越外显子7 (6-F: GGATGAAGCCAAAATTGCCAA;10-R: CATCATTGAGGTTCTGATTGAGC)、CLAP结构域和外显子17 (12-F: AF690_CATCCCCAAGTCCCCATCTC;19-R: AATCACCAACACCACATCGC)，或外显子11 (10-F: TCAATGATGTCCTGGTCAGC;12-R: GCTCATGGTTCACTCTGATC)。引物也被设计用于扩增人类外显子11序列(Hu_exon 10-F: AGAACCTCAATGATGTGCTGG;Hu_exon 12-R: TCGTGGTTGACTCTGATCTCGG)。扩增的DNA片段通过7.5%的丙烯酰胺凝胶电泳。使用SYTO™60染料(Invitrogen)对凝胶进行染色，并在红外奥德赛扫描仪(LICOR)上进行可视化。 PCR products amplified using Alexa flour 690-modified forward primer were scanned without staining to allow semi-quantification of DNA based on fluorescence intensity relative to the molecular load.

为了计算同工型频率，采用facs分离的小胶质细胞cDNA，引物12-F和19-R进行PCR扩增。产物纯化后克隆于pGEM-T Easy载体(Promega)中，转化为JM109细胞。从单个菌落分离的DNA用PCR重新扩增，并通过5%丙烯酰胺TBE凝胶电泳，通过插入长度区分剪接。所有较大的插入和选择最常见的(容易区分的，最小的)插入通过测序分析，以确定在小鼠大脑小胶质细胞中表达的四种异构体(图SgydF4y2Ba2gydF4y2BaB).计算四个异构体对应克隆的相对频率，数据如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2BaH。gydF4y2Ba

定量逆转录酶PCR (qRT-PCR)gydF4y2Ba

如前所述进行RNA提取和cDNA合成[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．定量实时PCR在7500 Fast real-time PCR系统上使用TaqMan PCR master mix (Applied Biosystems)进行。使用了以下基因特异性TaqMan探针:gydF4y2BaTrem2gydF4y2Ba(Mm04209424_g1),gydF4y2BaApoegydF4y2Ba(Mm01307193_g1),gydF4y2BaTyrobpgydF4y2Ba(Mm00449152_m1),gydF4y2BaSpp1gydF4y2Ba(Mm00436767_m1),gydF4y2Ba入库单gydF4y2Ba(Mm00433848_m1),gydF4y2BaLamp1gydF4y2Ba(Mm00495262_m1),gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba(Mm00437457_m1),gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba(Mm99999915_g1)。每个样本重复分析，相对基因表达分析用2gydF4y2Ba^{-ΔΔCtgydF4y2Ba}方法比较管家基因gydF4y2BaGapdhgydF4y2Ba［gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．或者，RNA提取和cDNA合成采用与RT-PCR相同的方式进行。然后使用QuantStudio™3 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR。使用技术三拷贝(使用补充表6中列出的引物序列)对样本进行扩增gydF4y2Ba^{——∆∆CtgydF4y2Ba}方法,正常gydF4y2BaCotl1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

纳米串神经炎症基因定量表达及数据分析gydF4y2Ba

小胶质细胞暴露于sirnagydF4y2BaBin1gydF4y2Ba24小时后，再进行LPS (10 ng/ml)处理24小时，然后用TRIzol (Invitrogen)溶解细胞。然后使用nCounter低RNA输入试剂盒(NanoString low -RNA-48)分离RNA。对所有样本进行质量控制检查，以确定RNA浓度和完整性(所有样本的RIN得分为> 8.8)，并使用NanoString神经炎症板(770个选定基因)对每个样本使用50 ng进行NanoString检测[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．使用NanoString检测基因表达，将计数高于阴性对照几何图形两个标准差的基因纳入最终分析。在小组中代表的770个基因中，有681个基因符合这一标准。然后将每个基因的计数归一化为包含在面板中的8个家务管理基因的几何平均值。首先对表达数据集进行主成分分析(PCA)，以确定实验条件是否聚集在一起，并确定Bin1和LPS对数据集的影响。采用Morpheus软件(Broad Institute)进行k均值聚类分析。作为一种正交聚类方法，对NanoString表达数据也进行了tSNE。通过将二维tSNE散点图与K-means聚类成员关系(SPSS Version 24)叠加，确定K-means和tSNE聚类之间的一致性。组间比较采用组间方差分析(ANOVA)和事后Tukey检验。使用所有681个纳入的基因作为参考列表(GOElite, Version 1.2.5)，进行基因本体论(GO)分析，在每个聚类中识别丰富的GO术语、Wikipathways和KEGG pathway [gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

荧光聚苯乙烯微球吞噬流式细胞术gydF4y2Ba

将藻氰菊酯(PE)共轭聚苯乙烯微球(heat - fisher Fluorospheres, Cat Cat#F13083)添加到初级小胶质细胞[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．5 μl微球(≈200微球/细胞)在37°C作用1 h后，胰酶在37°C孵育10 min分离细胞，然后加入含10%胎牛血清的DMEM。这些细胞被置于冰上以阻止吞噬活性。用冰冷PBS洗涤细胞，然后用荧光团标记CD45 (CD45- bv421, BD Biosciences Cat#563890)在室温下标记30分钟，然后在流式细胞术前洗涤。如前所述，用流式细胞仪检测吞噬特性[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．使用FlowJo版本10分析所有流式细胞术数据，并确定显示> 1珠/细胞被吞噬的细胞比例作为吞噬活性的指标。> 2珠/细胞的吞噬被认为是高水平的吞噬。gydF4y2Ba

采用与荧光激活小胶质细胞分选相同的处理方法，在成年小鼠脑细胞(含未纯化的小胶质细胞)中评估吞噬作用。去除髓鞘后，细胞用1 μl黄绿色聚苯乙烯珠(Sigma, Cat#L4655)在100 μl PBS中孵育，在37°C加5% CO的潮湿培养箱中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba1 h。然后用PBS洗涤细胞两次，用APC-Cy7大鼠α-CD11b和PE-Cy7大鼠α-CD45染色，流式细胞仪进行荧光激活小胶质细胞分选。gydF4y2Ba

荧光纤维Aβ42吞噬流式细胞仪测定gydF4y2Ba

将100 μg肽(Anaspec Cat#AS-60479)与20 μl 1% NH混合，制备了与HiLyte Fluor 488 (fAβ42-488)结合的Aβ42纤维荧光蛋白gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba并立即用1XPBS稀释，制备100 μM原液。混合物在室温下孵育6天，然后如前所述用于吞噬试验[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．siRNA和/或炎症刺激体外暴露后，在37°C下加入fAβ42-488(终浓度为2 μM) 1 h。按照上面讨论的方法收集细胞，然后用荧光团结合的抗cd45单抗标记细胞(CD45-PE-Cy7, BD Biosciences Cat#552848)。用补偿珠进行了补偿实验。活CD45细胞对荧光fAβ42-488的吞噬吸收gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba测定小胶质细胞与荧光细胞的比例。我们之前已经证明，细胞松弛素D处理可以抑制这种荧光峰值，这证实了我们的检测测量了肌动蛋白依赖的吞噬过程[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

细胞因子和趋化因子的多重免疫测定(中观尺度发现平台V-PLEX)gydF4y2Ba

在收集细胞进行转录组学研究之前收集培养上清。将上清离心除去碎片，然后使用120 μl进行多重免疫测定(MSD V-PLEX促炎仪:IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、KC/GRO、TNF-α)，按照制造商说明。这些实验在艾莫利多重免疫分析中心(EMIC)进行，所有样本都是重复运行的。为每个细胞因子建立标准曲线。细胞因子数据归一化为总体平均值，并以热图表示(Morpheus软件，Broad Institute)。进行分组方差分析和事后两两统计比较。同样的样本也使用Luminex细胞因子面板(EMD Millipore, 15-plex细胞因子试剂盒:GM-CSF, IFN-γ， IL-10, IL-1α， IL-2, IL-4, IL-6, IP-10/CXCL10, MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, TNFα， M-CSF, VEGF-A, G-CSF, RANTES用于体外研究)进行检测。我们还测量了32种细胞因子(EMD Millipore, 32-plex细胞因子试剂盒:G-CSF, Eotaxin, GM-CSF, IFN-g, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, LIF, IL-13, LIX, IL-15, IL-17, IP-10, KC, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, M-CSF, MIP-2, MIG, RANTES, VEGF, TNF-a，用于活体研究)的水平。这些分析是按照制造商的协议进行的，并在MAGPIX仪器上读出。gydF4y2Ba

小胶质形态学分析gydF4y2Ba

小鼠大脑在4℃下用4%的PFA后固定，然后在30%的蔗糖中平衡，直到大脑下沉。冷冻切片(25 μm)用山羊α-IBA1抗体(Novus biicals)在4℃下染色40 h。二抗(Alexa fluor 555 donkey α-goat, Invitrogen)孵育3 h，细胞核用Hoechst染色30 min。全脑切片的显微图像为4.5 μm厚gydF4y2BazgydF4y2Ba-使用带有20X物镜的尼康Eclipse Ti2显微镜(0.5 μm间隔)堆叠。使用NIS Elements软件(尼康)将图像瓦片拼接在一起并去卷积。生成叠加图像的最大强度投影，并在Fiji/ImageJ中转换为二元掩模。个人IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(特定区域的初级体感觉皮层，CA1和下丘脑)被选为感兴趣的区域。在斐济/ImageJ使用FracLac插件的感兴趣区域扫描功能进行形态测量分析[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．手动检查输出图像(由盲法研究人员)，以确保FracLac的凸包检测与原始的最大强度投影相似。用SPSS软件对船体和圆的形态测量数据进行分析。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

采用GraphPad Prism 8.0版本、Microsoft Excel 2017版本、SPSS 24版本和R(3.5.1版本)进行数据分析和数据表示。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。学生t检验(双尾，假设方差相等)用于两两比较，统计学显著性设为gydF4y2BapgydF4y2Ba除非另有说明，否则< 0.05。所有其他统计方面的考虑都在上面的有关部分讨论。gydF4y2Ba

BIN1在小鼠和人脑小胶质细胞中的表达和亚细胞定位gydF4y2Ba

最初，我们试图明确识别小鼠大脑小胶质细胞中BIN1蛋白的表达。我们用抗BIN1和IBA1抗体对野生型(WT)小鼠大脑切片进行免疫染色，发现在皮质和海马区有几个细胞对这两种蛋白质都呈阳性(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,上半部分)。然而，在显微图像中，遍布大脑实质的突触BIN1覆盖了整个视野，形成了较差的对比，无法通过形态学识别细胞特异性。为了明确确认iba1阳性小胶质细胞中BIN1的表达，我们生成gydF4y2BaEmxgydF4y2Ba^CregydF4y2Ba：gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}老鼠的gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba海马和皮质的兴奋性神经元和少突胶质细胞的等位基因被删除[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，为未受影响的细胞群(即小胶质细胞)中检测BIN1提供了更好的对比。正如预期的那样，只有低水平的BIN1免疫反应性(可能在抑制突触中)在脑皮层和海马的神经泌中被检测到gydF4y2BaEmxgydF4y2Ba^CregydF4y2Ba-gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba使用bin1特异性抗体的cKO [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba较低的面板)。相比之下，典型的BIN1在少突胶质细胞和有髓纤维束中的表达在中脑中很明显。gydF4y2Ba1gydF4y2BaA，用an表示gydF4y2Ba星号gydF4y2Ba)．不同于IBA1的细胞BIN1免疫荧光染色gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和IBA1gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在WT小鼠中，cKO小鼠皮层和海马区BIN1细胞染色仅限于IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质细胞。通过双通道图像的线扫描分析来评估BIN1和IBA1的细胞共表达情况。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB).在WT中，尽管在小胶质细胞BIN1表达的高强度峰值子集中，BIN1和IBA1信号有明显重叠，但其他BIN1峰值中没有IBA1信号，表明BIN1在其他细胞类型中表达(如表达高水平BIN1的少突胶质细胞[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba])。相比,gydF4y2BaEmxgydF4y2Ba^CregydF4y2Ba-gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在WT小鼠中可见高水平的实质BIN1信号。重要的是，来自cKO的测量显示了BIN1和IBA1信号在高强度峰值上的近乎完美的对齐，证明了BIN1蛋白在小胶质细胞中的表达(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaB).在高倍镜下，小胶质细胞核周区和分枝过程中可见强烈的BIN1免疫反应性gydF4y2BaEmxgydF4y2Ba^CregydF4y2Ba-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO老鼠和gydF4y2BaEmxgydF4y2Ba^CregydF4y2Ba同窝出生(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaC).为了将这一发现与人类小胶质细胞联系起来，我们以同样的方式对非患病人类的死后额叶皮层切片进行了免疫染色。在许多细胞的神经泌体和体细胞中观察到BIN1的免疫反应性，其中一些被鉴定为IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质细胞。与小鼠大脑小胶质细胞一样，BIN1定位于小胶质细胞的核周区域和人类大脑的过程(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaD).横过小胶质细胞体的直线扫描证实了两个通道的重叠和伴随的强度变化(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaE).总之，这些免疫组化研究明确证实了人类和小鼠大脑中的小胶质细胞BIN1的表达。gydF4y2Ba

小胶质细胞BIN1亚型的表征gydF4y2Ba

为了鉴定小胶质细胞BIN1亚型，我们检测了小鼠全脑匀浆和成年小鼠脑源性CD11b的裂解物免疫印迹gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD45gydF4y2Ba^intgydF4y2BaFACS-purified小胶质细胞(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．根据前人对BIN1亚型的分析[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，小鼠脑均质印迹主要显示高分子量(~ 75-80 kDa)的BIN1亚型，代表含有CLAP结构域的亚型(以下简称BIN1:H)，低分子量(~ 50-55 kDa)的亚型(以下简称BIN1:L)的检测水平较低(图1)。gydF4y2Ba1gydF4y2BaF)。相比之下，荧光激活细胞分选(FACS)分离的小胶质裂解物中的BIN1与BIN1:L相对应，几乎完全缺乏含CLAP结构域的亚型。在小胶质细胞中，在显性BIN1:H和BIN1:L异构体之间迁移的蛋白有明显的低水平表达。这些中等大小的蛋白质可能代表了BIN1:L亚型的翻译后修饰，或者可能是组成CLAP结构域的一个或多个外显子的低水平交替剪接。gydF4y2Ba

为了阐明gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba对分离的小鼠脑源性小胶质细胞和小鼠大脑进行RT-PCR分析。一组跨越外显子6-10的反应结果表明，BAR结构域内的外显子7在小胶质细胞中被排除在外gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba成绩单(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaG,左)。此外，骨骼肌特异性外显子11编码与磷酸肌苷结合的多碱基序列，对bin1诱导的膜管化至关重要[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，是拼接出来的gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba成年小鼠大脑小胶质细胞和人诱导的ipscs衍生小胶质细胞的转录本(图SgydF4y2Ba2gydF4y2BaA).结合我们的免疫印迹数据，RT-PCR横跨外显子12-19的区域显示，小胶质细胞gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba转录本主要排除与CLAP区域相对应的外显子13-16，在该区域有某种程度的选择性剪接(图。gydF4y2Ba1gydF4y2BaG,右)。正如预期的那样，在全脑RT-PCR中，包含和缺乏CLAP结构域的异构体均得到扩增。gydF4y2Ba1gydF4y2BaG)我们证实了我们的解释gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba通过克隆小胶质细胞RT-PCR产物，并通过凝胶电泳(用于显性剪接模式)和/或测序(显性和非显性剪接模式)分析单个克隆的扩增区域，实现小胶质细胞的剪接。绝大多数克隆缺少外显子13-17 (Δ CLAP， Δ外显子17)，约占90%gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba转录本(亚型10)，低频率包含外显子13和17(亚型6、12和9;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2BaH和SgydF4y2Ba2gydF4y2BaB)。gydF4y2Ba

为了将上述小鼠小胶质细胞的发现与人类表达联系起来，我们从人类诱导多能干细胞(iPSC)中生成了分化的小胶质样细胞(iMG) [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba和提取的蛋白质裂解物。免疫印迹分析显示存在BIN1:L亚型，缺乏BIN1:H亚型，并存在一些中等大小的与BIN1相关的多肽。这些跨物种的研究表明，在人类ipsc衍生的小胶质细胞中表达的BIN1异构体的一般模式与在facs分离的成年小鼠大脑小胶质细胞中发现的BIN1异构体相似。gydF4y2Ba1gydF4y2BaF)。gydF4y2Ba

BIN1是原代小鼠小胶质细胞中促炎激活、细胞因子产生和神经变性相关基因表达的调节因子gydF4y2Ba

神经炎症和小胶质细胞激活是包括AD在内的几种神经退行性疾病的常见病理特征。培养的小胶质细胞在暴露于LPS (toll样受体激动剂)时启动强大的促炎反应，导致基因特征改变和促炎细胞因子(如IL1b、TNF和IL6)的释放，这与神经退行性疾病有关[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．为了研究小胶质细胞BIN1在调节体内平衡信号和炎症反应中的潜在作用，我们对培养的原代小胶质细胞进行了操作。小鼠出生后培养的小胶质细胞gydF4y2BaBin1gydF4y2BasiRNA(或伪siRNA)作用48小时，然后添加或不添加LPS (100 ng/ml)再作用24小时，评估其神经炎症谱(770-基因NanoString神经炎症基因组)[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．LPS刺激引起的gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba成绩单(无花果。SgydF4y2Ba3.gydF4y2BaB)。gydF4y2BaBin1gydF4y2BasiRNA治疗大幅抑制gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba转录水平(> 80%，图;gydF4y2Ba2gydF4y2BaA)不影响细胞活力或对LPS的形态响应(图SgydF4y2Ba3.gydF4y2BaA和数据未显示)。在最终分析的681个基因中(补充表1)，513个基因在未调整水平上差异表达(ANOVA)gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)，调整水平498个基因(FDR < 5%)。前两个主成分(pc)共同解释了数据集中71%的方差。PC1主要占gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba敲除效应(KD)(42%的方差)，这在很大程度上与LPS效应无关(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。PC2解释了LPS效应(29%的方差)，进一步表明，LPS效应在损失后减弱gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

K-means聚类发现6组受影响基因，其中5组显示LPS和BIN1调控的不同模式(图1)。gydF4y2Ba2gydF4y2BaD).簇1，在静息和lps刺激条件下都被BIN1正调控，在基因中富集(包括gydF4y2BaSiglec1gydF4y2Ba，gydF4y2BaC3ar1gydF4y2Ba，gydF4y2BaFcgr1gydF4y2Ba,gydF4y2BaTmem119gydF4y2Ba)参与先天免疫反应、调节I型干扰素的产生和信号转导、脂质结合、抗原结合和膜筏定位(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaE和图SgydF4y2Ba4gydF4y2BaC)gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba，证实效果gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba核。簇2基因被LPS上调，被BIN1正调控，包括典型的促炎基因(包括gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba，gydF4y2Ba马可gydF4y2Ba，gydF4y2BaC3gydF4y2Ba,gydF4y2BaIrak3gydF4y2Ba)，参与调节NF-κB信号、细胞因子产生和NLRP3炎症小体功能。簇3基因被LPS下调，被BIN1正调控，包括内稳态(gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba，gydF4y2BaGpr34gydF4y2Ba)和DAM基因(gydF4y2BaTrem2gydF4y2Ba，gydF4y2BaTyrobpgydF4y2Ba，gydF4y2BaSpp1gydF4y2Ba,gydF4y2BaApoegydF4y2Ba) [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba与内溶酶体功能、脂质代谢、粘附和TGFβ信号通路有关(见图SgydF4y2Ba4gydF4y2BaE).簇4包含LPS上调但独立于BIN1的基因，参与泛素介导的蛋白水解、核糖体和表观遗传调控以及组蛋白甲基化，反映了LPS对小胶质细胞的深远影响。群集5基因通常表达水平较低，被BIN1负调控，不依赖于LPS刺激，包括参与突触传递的基因，通常在神经元中表达(见图SgydF4y2Ba4gydF4y2BaF)。gydF4y2Ba

我们还使用t分布随机邻居嵌入(tSNE)分析可视化了我们的基因表达数据，以更好地展示由BIN1正调控的基因(与聚类1、2和3重叠)和由BIN1负调控的基因(聚类4和5)，上述通过分层聚类分析确定(图4和5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaA).在我们数据集的聚类3中，BIN1正向调节几个DAM基因(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC)先前通过AD病理小鼠模型中小胶质细胞的单细胞RNAseq识别[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．为了确定小胶质细胞bin1调节基因在AD病理中的意义，我们对AD相关遗传危险因素进行了MAGMA研究[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．这一分析揭示了与我们数据集的大量重叠。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB)，表明有几个AD风险基因作用于小胶质细胞中BIN1的下游。有趣的是，在小胶质细胞中具有高内稳态表达的风险基因(gydF4y2BaApoegydF4y2Ba，gydF4y2BaTrem2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCd33的gydF4y2Ba,gydF4y2BaMs4a4agydF4y2Ba)被BIN1正调控，而神经元AD风险基因(gydF4y2BaCnn2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGria1gydF4y2Ba)和自噬基因(gydF4y2BaSqstm1gydF4y2Ba)受BIN1负调控。为了验证BIN1在小胶质细胞中对DAM基因的调控，我们使用与NanoString研究相同的条件对初级小胶质细胞进行了qRT-PCR分析。我们证实了BIN1正调控几个选择的DAM基因，包括gydF4y2BaApoegydF4y2Ba，gydF4y2BaTrem2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba入库单gydF4y2Ba，gydF4y2BaTyrobpgydF4y2Ba，gydF4y2BaSpp1,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaLamp1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD和图SgydF4y2Ba3.gydF4y2BaC)。gydF4y2Ba

通路分析发现重要的转录因子是bin1调控基因簇的潜在上游调控因子(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaE). PU.1 -小胶质发育和DAM转变的主要转录调控因子-被预测在簇1、簇2和簇3的上游。此外，已知Cluster 2基因受NF-κB、STAT1、IRF1和HDAC1调控。BIN1正向调控的DAM基因通路分析表明ATF3是上游调控因子。BIN1也有直接影响gydF4y2BaAtf3gydF4y2Ba这表明ATF3可能在BIN1控制DAM基因表达中起中介作用。最后，我们的体外qRT-PCR实验证明BIN1正调控转录gydF4y2BaSfpi1gydF4y2Ba(编码PU.1)和gydF4y2BaIrf1gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaE)，这两种调节因子在稳态和炎症条件下控制大量小胶质细胞基因。有趣的是，我们还发现了PU.1和BIN1之间的相互关系(图1)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaF)，为BIN1参与致病性信号失调增加了另一层复杂性。gydF4y2Ba

根据BIN1对细胞因子基因表达的转录调控(图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaE无花果。SgydF4y2Ba4gydF4y2Ba，以及补充表S1和S2)，我们试图在功能水平上证实这一观察结果。测定原代小胶质细胞的细胞因子分泌情况gydF4y2BaBin1gydF4y2BaKD和LPS暴露。在随后的基础条件下，我们没有发现细胞因子分泌的差异gydF4y2BaBin1gydF4y2BaKD;然而，的减少gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在两种不同的检测平台(MSD和Luminex;无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa - b)。我们的NanoString面板中包含的6种细胞因子的转录水平分析显示，其中5种(gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba，gydF4y2Ba肿瘤坏死因子gydF4y2Ba，gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCcl3gydF4y2Ba，gydF4y2BaCcl5gydF4y2Ba)．更重要的功能是，由Cluster 3基因编码的几个蛋白质(gydF4y2BaTrem2gydF4y2Ba，gydF4y2BaTyrobpgydF4y2Ba，gydF4y2BaCd68gydF4y2Ba,gydF4y2BaApoegydF4y2Ba；见图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC)调节小胶质细胞的吞噬作用。为了研究这些基因表达变化的功能意义，我们分析了原代小胶质细胞的吞噬能力gydF4y2BaBin1gydF4y2BaKD(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac - d)。减少gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba表达降低了荧光微球的吞噬能力，并增强了高剂量LPS暴露引起的损伤。然而，我们观察到没有影响gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba初级小胶质细胞吞噬荧光Aβ能力的损失gydF4y2Ba_42gydF4y2Ba原纤维(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaE).总的来说，我们的体外研究表明，BIN1调节原代小鼠小胶质细胞中的促炎反应、几种神经退行性疾病相关基因的表达和细胞因子的产生。gydF4y2Ba

Microglia-specific消融的gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba减轻体内lps介导的促炎激活和DAM基因表达谱gydF4y2Ba

考虑到培养条件和体内小胶质细胞表型的差异，我们继续研究小胶质细胞特异性的影响gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在体内平衡和炎症(系统性LPS)条件下小鼠大脑小胶质细胞转录组的缺失。我们使用了归纳条件gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba交叉淘汰赛策略gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{Litt tm2.1 (cre / ERT2)gydF4y2Ba}/ WganJ [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba这一系的杂合子动物被称为gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}),gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}老鼠。实验小组包括gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}作为野生型的等价物，gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}作为主要参照组(因为这些小鼠只有一种功能gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba等位基因),gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}；gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}（gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO)为实验组。每天注射他莫西芬5天后，小鼠休息四周，以使外周血单核/巨噬细胞(也表达gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba)．随后，连续4天给予LPS以诱导特征明确的促炎小胶质细胞反应[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]，小鼠在末次注射24 h后安乐死(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA).如预期的那样，LPS诱导了体温过低和体重减轻的疾病反应。有趣的是，我们观察到低温反应减弱的趋势gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba没有影响体重减轻(图SgydF4y2Ba5gydF4y2Ba抵扣)。gydF4y2Ba

LPS给药未引起显著变化gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba通过NanoString分析定量了facs分离的脑小胶质细胞的表达(图SgydF4y2Ba5gydF4y2BaG)，并且没有变化gydF4y2BaBin1gydF4y2BaRT-PCR检测剪接情况(图5。gydF4y2Ba1gydF4y2BaG,年代gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,年代gydF4y2Ba5gydF4y2BaH).通过免疫荧光染色，我们证实了IBA1中BIN1的表达gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质细胞的gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}但不是gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO老鼠(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB).而LPS给药诱导WT的形态转变为阿米巴样表型(gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}小神经胶质细胞,gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba单倍不足的小胶质细胞在LPS作用下表现出高度分枝的形态(图SgydF4y2Ba6gydF4y2BaA)。引人注目的是,gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO小胶质细胞似乎完全保留了静息形态(图SgydF4y2Ba6gydF4y2BaA)，表明对炎症反应的功能性无能。然而，小胶质形态的关键参数没有受到显著影响，表明这些异质细胞的形态响应高度变化，在大脑区域之间有显著差异(图SgydF4y2Ba6gydF4y2Bac)。免疫荧光组织学染色显示，LPS给药似乎不影响BIN1在小胶质细胞中的表达或定位gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}小鼠大脑(图SgydF4y2Ba5gydF4y2BaF)。gydF4y2Ba

用流式细胞术检测脑单个核细胞表面CD11b、CD45、CD11c、Ly6c的表达。CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD45gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba小胶质细胞经facs纯化后进行NanoString转录组学分析(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba基于Iba1免疫荧光染色和流式细胞术研究，我们观察到不同基因型的小胶质细胞密度或数量没有差异(图S . CgydF4y2Ba6gydF4y2BaA和数据未显示)。在CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD45gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba小胶质细胞中CD11c的比例明显增加gydF4y2Ba^+gydF4y2BaLPS治疗后小胶质细胞明显减少gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}老鼠(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaD和E)，可能归因于gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Bahaploinsufficiency。相比gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}老鼠，额外的损失gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba（gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO)消除了这种LPS效应(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaD和E)。因此，高水平的表面CD11c表达，微胶质激活的特征和DAM表型的特征[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba](其中若干基因在LPS暴露后上调[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba])，在lps诱导的神经炎症模型中的小胶质细胞中变得明显，并似乎被CX3CR1信号调节。综上所述，这些发现表明BIN1正向调节小胶质细胞表面CD11c水平，并可能控制全身LPS给药后DAM表型的诱导。gydF4y2Ba

然后从facs纯化的小胶质细胞中分析511个转录本的炎症基因表达数据(补充表S3)。小胶质细胞分离gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO动物的低约50%gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba水平比gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}控制(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaG).效率gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba损失在性别和lps处理之间没有差异(数据未显示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaG).不出所料，小胶质细胞来自gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}老鼠低gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba表达,展示了gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba该小鼠系的单倍不足(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaG). PCA显示，两个pc解释了数据中43%的方差(PC1 29.9%， PC2 12.4%)。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA). PC1捕获的LPS效应在所有三种基因型中都相对相似。PC2捕获的LPS反应被修饰gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba基因型和gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba删除。在基线,gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}与WT相比，小鼠表现出更高的激活水平(gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}老鼠)。PC2捕获的LPS反应在gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}与之前的描述一致，即通过CX3CR1信号通路控制小胶质细胞激活[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．有趣的是，损失gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba减轻了LPS引起的应激反应gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Bahaploinsufficiency。这些高水平的转录组学结果与我们的流式细胞术结果一致，表明在炎症期间，CD11cgydF4y2Ba^+gydF4y2BaDAM表型由BIN1促进。gydF4y2Ba

在511个纳入分析的基因中，164个基因表现出群体差异表达(ANOVA)gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05，补充表S3)。这些差异表达基因的K-means聚类鉴定出5个具有不同表达模式的聚类(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaC).簇1，包含促炎基因(包括gydF4y2BaC4agydF4y2Ba，gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIrf7gydF4y2Ba,gydF4y2BaStat1gydF4y2Ba)，在LPS后上调，而损失gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba抑制这种反应。因此，群集1基因在促炎条件下被BIN1特异正调控，证实了上述体外表型gydF4y2BaBin1gydF4y2BasiRNA KD。簇2基因在所有基因型中都表现出了一致的LPS效应，其中包括一些已知被LPS上调的典型促炎基因(例如，gydF4y2BaTlr2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIl1agydF4y2Ba,gydF4y2BaFcgr3gydF4y2Ba)，以及gydF4y2BaApoegydF4y2Baε4等位基因变异是LOAD风险的最高预测因子[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．簇3基因表现出与簇2相似的模式，没有明显的BIN1依赖性，并被包括在内gydF4y2BaItgaxgydF4y2Ba(编码CD11c),gydF4y2BaTyrobpgydF4y2Ba,gydF4y2BaRpl9gydF4y2Ba．而增加gydF4y2BaItgaxgydF4y2BaLPS表达与流式细胞仪检测的CD11c增加结果一致gydF4y2Ba^+gydF4y2Balps处理小鼠的小胶质细胞(图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaD和E)，不减弱的表达gydF4y2BaItgaxgydF4y2Ba后gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba尽管CD11c减少，但仍然存在缺失gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质细胞的研究结果令人惊讶。gydF4y2Ba5gydF4y2BaF).这一发现表明，CD11c表达的转录后或翻译后控制或表面定位需要BIN1功能。簇4基因被LPS抑制，并随着LPS的增加而改善gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba缺失，表明炎症期间BIN1正调控。簇5包含BIN1和CX3CR1均负调控的基因，与LPS处理无关。图S总结了聚类水平上基因表达变化的总体轨迹gydF4y2Ba7gydF4y2Baa - b。此外，我们还鉴定了13个基因(包括gydF4y2BaOlfml3gydF4y2Ba，gydF4y2BaTmem119gydF4y2Ba，gydF4y2BaMertkgydF4y2Ba，gydF4y2BaTrem2,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaP2ry12gydF4y2Ba)由独立于状态的BIN1调节(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaE)。gydF4y2Ba

Cluster 1基因的基因集富集分析表明I型干扰素(α/β)的表达和产生具有正调控作用(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD).此外，bin1调控的Cluster 1在核糖体基因中富集(gydF4y2BaRpl28gydF4y2Ba，gydF4y2BaRpl29gydF4y2Ba，gydF4y2BaRps10gydF4y2Ba,gydF4y2BaRps9gydF4y2Ba)、细胞因子和对IFNγ基因的响应(gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba，gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCcl5gydF4y2Ba,gydF4y2BaStat1gydF4y2Ba)，以及调节氧化还原酶活性(gydF4y2BaApoegydF4y2Ba，gydF4y2BaIl1bgydF4y2Ba,gydF4y2BaSlamf8gydF4y2Ba)．33个lps上调的基因被抑制至少1.5倍gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba删除。这些基因及其编码蛋白之间已知相互作用的分析如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2BaF。gydF4y2Ba

总之，我们的体内研究表明BIN1有一定的抵消作用gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Bahaploinsufficiency。CX3CR1信号的丢失已被证明会增加荧光微球的吞噬作用[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．因此，我们设法把损失联系起来gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在具有小胶质细胞功能的小胶质细胞中，重点研究它们吞噬荧光微球的能力[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，询问是否额外损失gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba是否足以逆转gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Bahaploinsufficiency。然而，我们发现两者都不是gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba单倍体不足或小胶质缺失gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在本研究所采用的实验条件下，对吞噬作用没有任何影响，LPS也没有影响这种细胞功能(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2BaG).缺乏任何观察到的facs分选小胶质细胞的影响gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba对吞噬作用的影响与在培养的小胶质细胞中观察到的适度影响是一致的gydF4y2BaBin1gydF4y2BasiRNA KD。gydF4y2Ba

我们还通过Luminex(32细胞因子面板)测量了所有实验小鼠的脑匀浆(取自额叶皮层)中的炎症细胞因子水平(图SgydF4y2Ba7gydF4y2BaC). LPS增加了所有基因型的eotaxin、MIG和IP-10水平，而对gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba的损失。然而gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在未受刺激组和lps刺激组中无显著性差异，我们观察到整体效应gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba与LPS治疗无关。相比gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}老鼠,gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO小鼠IFNγ水平较高(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.017)， il4 (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.026)和IL7 (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.014)。gydF4y2Ba

BIN1可能通过影响1型干扰素信号传导来介导其在小胶质细胞中的转录组作用gydF4y2Ba

我们的体外研究显示gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba微胶质基因表达和炎症细胞因子产生的损失。然而，出生后的小胶质细胞不能完全重现成人的小胶质细胞反应[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．虽然我们的体内实验克服了这些体外研究的局限性，但其效果gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba单倍体不足使体内小胶质细胞选择性的解释复杂化gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba删除。尽管存在这些局限性，我们从体外和体内研究中观察到bin1介导的基因调控的基因本体论和模式有显著重叠。为了从我们的体外和体内数据中确定最可靠和一致的发现，我们对来自这两组实验的NanoString数据集进行了联合分析。在这两个数据集中，498个表达高于阈值的基因被纳入分析。维恩图显示了在体外和体内数据集中，在基础和lps刺激条件下共享的DEGs的数量。gydF4y2Ba7gydF4y2BaA).对这些共享基因集的PCA显示，LPS刺激后小胶质细胞中LPS诱导的转录组变化受到抑制是LPS降低后的共同特征gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba表达式(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2BaB和C)。在非刺激条件下(假siRNA vs。gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba体外siRNA，和gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}vs。gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO小胶质细胞的体内研究，都没有LPS处理)，我们观察到很少协调的基因调节gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在两个数据集中(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaD)。然而，在LPS刺激条件下(假siRNA+LPS vs。gydF4y2BaBin1gydF4y2BasiRNA+LPS体外，和gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}+ LPS vs。gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2BacKO + LPS小胶质细胞的体内研究)，我们观察到两个模型系统之间有更大的一致性(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaD).我们将这些bin1调控基因的和谐列表(31个基因正调控包括gydF4y2BaCd69gydF4y2Ba，gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba，gydF4y2BaIrf7gydF4y2Ba,gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba；13个基因负调控包括gydF4y2BaCables1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTmem100gydF4y2Ba)，并进行氧化石墨烯富集分析，以确定小胶质细胞中bin1调节的本体。BIN1被发现是碳水化合物结合、I型干扰素和免疫途径、通过MHC-I抗原呈递的正向调节因子，以及细胞增殖的负向调节因子。BIN1还负调控位于细胞投射、细胞连接和细胞膜上的基因(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaE).包括参与I型干扰素信号传导的特定bin1调节基因gydF4y2BaDdx58gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfih1gydF4y2Ba，gydF4y2BaIrf7gydF4y2Ba，gydF4y2BaIfi30,gydF4y2Ba而且gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2BaF)。gydF4y2Ba

炎症的upregulationgydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba是否依赖于BIN1的表达gydF4y2Ba

鉴于…的深远影响gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在基因转录上的缺失，我们验证了在纳米串面板中识别的关键内稳态和DAM基因gydF4y2BaCst7gydF4y2Ba，一个DAM基因- qRT-PCR(图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaA和图SgydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．我们还发现炎症性转录因子上调gydF4y2BaSfpi1gydF4y2Ba(通过网络分析识别)依赖于BIN1(图1)。gydF4y2Ba8gydF4y2BaA和图SgydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．基于其在胞浆和过程中的定位，我们推断，小胶质BIN1可能是一种胞浆适配器蛋白，在胞吞和循环的背景下调节受体动态，而不是转录调控因子。因此，我们试图确定BIN1是否通过1型干扰素通路调节信号。在我们的数据集中发现的一个关键基因是溶酶体相关限制因子gydF4y2Ba干扰素诱导跨膜蛋白3gydF4y2Ba（gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba)，其表达被I型和II型干扰素信号激活。为了验证我们从facs分离的小胶质细胞中获得的NanoString数据。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa -b)，我们对分离的全脑RNA进行了qRT-PCR分析gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}而且gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}-gydF4y2BaBin1gydF4y2BaLPS刺激(或盐水注射)后的cKO小鼠。我们发现了脂多糖诱导的gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba记录在gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}小鼠，明显减弱gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba删除(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa - c)。我们在全脑蛋白裂解物的免疫印迹分析中进一步验证了这一发现。gydF4y2Ba8gydF4y2BaD). NanoString分析定量培养的小胶质细胞转录水平证实gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba上调调控被削弱了gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba击倒在缺席gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Bahaploinsufficiency(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2BaE).为了进一步验证这一效果而不受gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba单倍体不足(体内)或不完全短暂gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba还原(siRNA KD)，我们产生稳定的池gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba通过CRISPR/ cas9介导的基因编辑BV2细胞系中的KO小胶质细胞(图SgydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．gydF4y2BaBin1gydF4y2BaKO细胞明显钝化gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba对LPS治疗的应答(图。gydF4y2Ba8gydF4y2BaF)。引人注目的是，用IFITM3抗体对小鼠大脑部分进行免疫荧光标记，显示IFITM3在整个小胶质体和分支中具有强烈的免疫反应性gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}在缺乏BIN1表达的情况下，LPS介导的表达上调很少(如果有的话)。gydF4y2Ba8gydF4y2BaG)。gydF4y2Ba

总的来说，我们从小胶质细胞的转录组分析和实验验证研究中得到的一致发现表明，小胶质细胞BIN1正向调节DAM表型转化和1型干扰素网络的关键元素，这可能与体内外差异和体外差异无关gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Bahaploinsufficiency。gydF4y2Ba

我们的研究首次证明，BIN1是小胶质基因表达和功能的关键调节因子，无论是在稳态还是炎症条件下。通过LPS刺激培养的小胶质细胞的转录分析，我们发现BIN1是促炎激活、细胞因子产生和神经变性相关基因表达的调节因子。通过分析从WT和cKO小鼠中分离的facs成年脑小胶质细胞，证实了体外实验结果，小胶质细胞BIN1在体内是lps介导的促炎激活和DAM基因表达的关键调控因子。gydF4y2Ba

BIN1在小胶质细胞转录组和蛋白质组学数据集中的高水平表达已有报道[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．然而，只有两篇关于BIN1与小胶质标记物细胞共定位的报道。在AD患者死后脑组织免疫组化分析中发现1个表达BIN1的iba1阳性细胞[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．另一项研究报告在CD45细胞核中检测到BIN1亚型12和6gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba使用针对BIN1外显子11和13的抗体产生的小胶质细胞;值得注意的是，在之前的研究中，免疫染色没有观察到缺少外显子11和13的主要小胶质BIN1亚型10 [gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．在这方面，值得一提的是外显子11，它编码一个多碱基序列，与磷酸肌苷结合，对bin1诱导的膜管化至关重要[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，是拼接出来的gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba成年小鼠大脑小胶质细胞和人诱导的ipscs衍生小胶质细胞的转录本(图SgydF4y2Ba2gydF4y2BaA).通过在兴奋性神经元和少突胶质细胞中生成缺乏BIN1表达的小鼠，我们明确证明了BIN1在小胶质细胞中的表达。BIN1亚型10在我们的研究中是最丰富的gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba小鼠脑小胶质细胞转录本与人脑小胶质细胞RNAseq数据相一致，并归为BIN1亚型[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．然而，我们对BIN1定位于核周区和小胶质过程的论证与早前关于BIN1在小胶质核中的报道不一致[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．中BIN1的分析gydF4y2BaEmxgydF4y2Ba^CregydF4y2Ba-gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba免疫染色(本研究)和免疫印迹法检测cKO小鼠[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba的研究结果表明，在大脑中表达的所有BIN1中，微胶质BIN1只占很小的一部分。然而，值得注意的是，一项大规模的细胞类型特异性启动子-增强子相互作用研究在人类中发现了一种小胶质细胞特异性增强子gydF4y2BaBIN1gydF4y2Ba基因，含有ad风险变异rs6733839 [gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．最近的一项研究预测了风险变异rs6733839，以促进转录因子MEF2C与gydF4y2BaBIN1gydF4y2Ba增强子在小胶质细胞中增多gydF4y2BaBIN1gydF4y2Ba表达式[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．因此，在BIN1的AD关联信号似乎是小胶质细胞类型特异性的。gydF4y2Ba

特定的BIN1亚型可能参与与膜动力学相关的不同功能，包括内吞作用。神经元BIN1调节突触囊泡释放[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]并通过调节致病性tau蛋白的内吞吸收来限制神经元间tau蛋白在培养神经元中的扩散[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．与神经元BIN1异构体相比，小鼠大脑小胶质细胞BIN1和人类ipscs衍生的小胶质细胞BIN1异构体缺少中央CLAP结构域，该区域位于BIN1及其同系物Amphiphysin 1之间，包含网格蛋白和AP2适配器结合位点[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．CLAP结构域对BIN1在网格蛋白介导的胞吞作用中起重要作用;然而，所有的微胶质BIN1异构体都有一个SH3结构域，该结构域可以与dynamin I的富含脯氨酸结构域相互作用[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．因此，不能仅根据CLAP结构域的缺失就排除小胶质细胞BIN1在细胞内吞作用中的作用。在非神经元细胞中，BIN1的缺失并不妨碍内吞作用对转铁蛋白的摄取，而是延迟内吞循环[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．我们发现BIN1表达的缺失对小胶质细胞的吞噬作用几乎没有影响，这与之前评估小胶质细胞吞噬作用的研究一致gydF4y2BaBin1gydF4y2BaKO巨噬细胞，发现BIN1在这些免疫调节细胞的内吞或吞噬中没有功能性作用[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．外显子13(在早期的出版物中称为外显子12A)和外显子17序列在小胶质细胞子集中被包含gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba转录(尽管频率较低)可能与细胞周期调节有关。事实上，此前有报道称，外显子13的包含废除了BIN1与转录因子E2F1的结合，抑制了细胞周期的进展[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．此外，外显子13包含I类SH3结合基序(PxxP)，可与BIN1自身的SH3结构域进行分子内相互作用，从而隔离其与cMYC的相互作用[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]，也可能阻碍与其他SH3域依赖伙伴(如dynamin和tau)的相互作用。此外，外显子17编码了BIN1的一半c-MYC结合基序，调节c-MYC介导的转化和凋亡[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．单个BIN1亚型的小胶质细胞特异性功能，包括包含外显子13和17的次要亚型，为未来的功能研究提供了一个令人兴奋的领域。gydF4y2Ba

我们的神经炎症转录谱分析结果表明，BIN1是一种内稳态小胶质调节因子，在转录因子PU.1上游的免疫反应激活中具有非冗余作用，而PU.1对小胶质的生存能力至关重要[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．PU.1是小胶质细胞基因表达和向DAM表型过渡的主调控因子[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba，gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．此外，pu - 1调节多个ad相关小胶质基因的表达[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，髓系细胞中较低的PU.1表达已被报道可延迟AD的发生[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba］．重要的是，我们已经证明了BIN1的调节作用gydF4y2BaSfpi1gydF4y2Ba，编码为PU.1。有趣的是，我们在体外和体内一致发现BIN1不影响小胶质细胞的数量，这表明BIN1的功能对小胶质细胞的维持和存活可能不是必需的。总之，我们发现BIN1正向调节PU.1的转录可能表明BIN1的表达可能是小胶质细胞表型和病理结果的一个重要决定因素，特别是在AD中，这一假设值得未来的研究。gydF4y2Ba

我们的体内模型系统的一个局限性与内在有关gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Bahaploinsufficiency在gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}已知其本身通过衰老的转录组表型的过早上调影响小胶质细胞，包括在AD病理中观察到的一些与疾病相关的小胶质细胞基因[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba］．两者之间的差异就是例证gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}小鼠和WT等价物(gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba})组。这种效果的gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba单倍体不足可能部分解释体外和体内效应之间缺乏一致性gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba在我们的研究中观察到小胶质细胞的损失。体外培养的出生后原生小胶质细胞与大脑中原生状态的成年小胶质细胞之间的反应差异，以及LPS对体外小胶质细胞的直接作用和LPS对体内小胶质细胞的间接作用，可能也导致了体外和体内实验模式的差异。尽管存在这些差异，但我们观察到在两个模型系统中都有几个依赖于bin1的lps诱导的炎症基因和通路。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba对我们体外和体内转录组研究结果的一致分析发现，BIN1在调节小胶质细胞中1型干扰素反应方面发挥了新的作用。我们发现在小胶质细胞中操纵BIN1会影响干扰素调节因子(IRFs)的表达。irf是一类转录调节蛋白，对病原体识别受体触发的信号事件作出反应，可转移到细胞核。然后，核易位的irf调节参与免疫反应和免疫细胞发育的不同基因组的表达。例如，IRF1、IRF5和IRF8在促炎反应中发挥重要作用[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba，gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba，gydF4y2Ba88gydF4y2Ba]，而IRF2和IRF4调节抗炎反应[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba］．IRF8是小胶质细胞运动的重要调节因子[gydF4y2Ba90gydF4y2Ba]， IRF7和IRF8调节小胶质细胞内稳态和反应性[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba］．IRF7是干扰素依赖性免疫反应的主要信号调节因子[gydF4y2Ba92gydF4y2Ba］．在AD淀粉样病变的多个小鼠模型中，神经炎症同时激活干扰素信号通路[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．此外，人脑中的IRF7表达与AD临床痴呆、Braak评分和神经淀粉样蛋白负担高度相关[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba］．在体外研究中，我们发现小胶质细胞中缺失BIN1会降低IRF1和IRF7基因的表达，而不影响IRF、IRF3、IRF4和IRF8的表达。在体内，小胶质细胞中BIN1的缺失抑制了全身LPS对IRF7的上调，与体外结果一致，提供了小胶质细胞中BIN1功能与1型干扰素信号之间的联系。gydF4y2Ba

我们的结果进一步表明gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba-受I型干扰素以及促炎细胞因子刺激的基因之一，促炎细胞因子是宿主先天免疫反应的关键介质，包括IL-1b、IL-6和TNF [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba] -在体内和体外均受到BIN1的正调控。最近的一篇论文发现，IFITM3基因网络在AD患者的tau缠结神经元和外周单个核细胞中丰富[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．IFITM3在AD淀粉样蛋白发病的转基因模型的小胶质细胞中表达也上调[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba94gydF4y2Ba］．此外，IFITM3在一个短暂的“干扰素响应”小胶质亚群中上调，该亚群在部分须状病变模型的皮质重映射过程中扩大。在这个小胶质细胞群体中，IFITM3定位于早期吞噬体，被发现是吞噬体成熟的必要条件[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba］．有趣的是，IFITM3是巨噬细胞溶酶体酸化所必需的[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．此外，与外周巨噬细胞(~pH值5)相比，内稳态小胶质细胞中的溶酶体呈弱酸性(~pH值6)，炎症激活导致小胶质细胞溶酶体酸化，使其降解纤维Aβ [gydF4y2Ba95gydF4y2Ba］．因此，研究IFITM3在小胶质溶酶体中的功能作用对于阐明BIN1调节的病理特异性细胞功能是必要的。gydF4y2Ba

至关重要的是，BIN1在体外和体内转录调控的几个基因都与AD的发病机制独立相关。特别是BIN1正调控ad相关关键基因的转录(包括gydF4y2BaApoegydF4y2Ba，gydF4y2BaTrem2gydF4y2Ba,gydF4y2BaTyropbgydF4y2Ba)在平衡条件下。BIN1和其他AD相关基因之间的这种调控相互作用说明了多病因性疾病的复杂性，以及确定与AD相关的整个病理谱系的特定遗传变异的挑战。然而，BIN1参与体内平衡和炎症特异性信号调节表明，BIN1可能作为小胶质激活状态的中央调节器，与介导DAM转录谱的万花筒有关。已知的BIN1在膜重塑和内吞运输中的功能与调节表型变化的广泛作用一致。事实上，我们的发现证明了这一点，BIN1调节CD11c的表面表达对LPS的响应，独立于gydF4y2BaItgaxgydF4y2Ba转录水平(从相同的facs分离细胞样本中测定)。阐明BIN1和小胶质表面受体在DAM转化中的潜在合作作用是未来研究的关键领域。然而，BIN1与表面受体的关系似乎比胞吞作用或核内体循环的单一功能更为复杂，如我们发现的CX3CR1失调。gydF4y2Ba

尽管由于失去一个功能而有一些限制gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba等位基因，通过利用gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^CregydF4y2Ba驱动线，我们偶然发现BIN1抵消引起的变化gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba单倍不足，证明BIN1参与了另一个微胶质功能的中央调节。相比之下,gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba^{fl / flgydF4y2Ba}老鼠正常gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba表达式,gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}小鼠对全身LPS刺激表现出夸张的反应，与先前的观察一致[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba］．作为gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba在第I阶段DAM过渡期间被下调[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba的小胶质细胞gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}驱动线可能被引到DAM过渡。当gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba被删除的gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}小鼠，我们观察到衰减效应引起gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Bahaploinsufficiency。这一发现表明，BIN1可能是CX3CL1 (fractalkine)-CX3CR1信号轴中CX3CR1受体激活的中介因子。这一结论得到了小胶质细胞群数据的支持，该数据显示lps诱导的DAM CD11c显著增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(CD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD45gydF4y2Ba^intgydF4y2Ba)gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba^{克里尔gydF4y2Ba}小鼠，这是废除后的删除gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba等位基因在小胶质细胞。我们的体内转录数据集显示gydF4y2BaBin1gydF4y2Ba以相反的方式调节基因转录gydF4y2BaCx3cr1gydF4y2Ba．正在进行的小胶质细胞特异性BIN1缺失的研究gydF4y2BaTmem119gydF4y2Ba^{Cre-ERT2gydF4y2Ba}司机(gydF4y2Ba97gydF4y2Ba将有助于确定小胶质细胞BIN1是否具有保护淀粉样蛋白和tau蛋白聚集的功能。gydF4y2Ba

我们的研究表明，BIN1调节小胶质细胞炎症反应的关键元素。重要的是，小胶质细胞表型转变的关键特征，包括gydF4y2BaIfitm3gydF4y2Ba和CD11c的表面表达，都依赖于bin1。我们的结论是，BIN1的表达是小胶质细胞对中枢神经系统挑战做出适当反应的关键，而AD风险可能是通过小胶质细胞中BIN1功能的受损而产生的。gydF4y2Ba

在这项研究中产生和分析的所有数据都包含在这篇发表的文章及其补充信息文件中。gydF4y2Ba

一个β:gydF4y2Ba

-β淀粉样蛋白gydF4y2Ba

广告:gydF4y2Ba

阿尔茨海默病gydF4y2Ba

方差分析:gydF4y2Ba

方差分析gydF4y2Ba

栏:gydF4y2Ba

BIN / amphiphysin /旅游房车绑定gydF4y2Ba

BIN1:gydF4y2Ba

桥接积分器1gydF4y2Ba

cKO:gydF4y2Ba

条件敲除gydF4y2Ba

拍:gydF4y2Ba

网格蛋白相关蛋白结合区gydF4y2Ba

大坝:gydF4y2Ba

疾病有关的小胶质细胞gydF4y2Ba

流式细胞仪:gydF4y2Ba

Fluorescence-activated细胞分类gydF4y2Ba

罗斯福:gydF4y2Ba

错误发现率gydF4y2Ba

iPSC:gydF4y2Ba

诱导多能干细胞gydF4y2Ba

iMG:gydF4y2Ba

诱导microglial-like细胞gydF4y2Ba

irf:gydF4y2Ba

干扰素调节因子gydF4y2Ba

Iso:gydF4y2Ba

同种型gydF4y2Ba

KD:gydF4y2Ba

可拆卸的gydF4y2Ba

负载:gydF4y2Ba

晚发性阿尔茨海默病gydF4y2Ba

有限合伙人:gydF4y2Ba

脂多糖gydF4y2Ba

mac:gydF4y2Ba

Magnetic-activated细胞分类gydF4y2Ba

岩浆:gydF4y2Ba

基因组注释的多标记分析gydF4y2Ba

PC:gydF4y2Ba

主成分gydF4y2Ba

SH3:gydF4y2Ba

SRC同源3域gydF4y2Ba

核:gydF4y2Ba

小干扰RNAgydF4y2Ba

tSNE:gydF4y2Ba

t分布随机近邻嵌入gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

我们要感谢Ha-Na Shim和Jeffrey Lenz在小鼠群体维护和组织学方面的帮助。gydF4y2Ba

本研究由美国国立卫生研究院资助RF1 AG054223和RF1 AG056061(给G.T.)， R01 NS114130-01A1, RF1 AG071587和K08 NS099474(给S.R.)， R01 AG063175(给J.D.和G.T.)， R01 MH106575(给J.D.)， R01 R01NS115994(给L.W.)，国家科学基金CAREER 1944053(给L.W.)。gydF4y2Ba

作者和联系gydF4y2Ba

1. 伯德阿尔茨海默病研究中心，南佛罗里达大学，佛罗里达州坦帕市，33613gydF4y2Ba

   Ari Sudwarts, morthi Ponnusamy, Shuai Wang, Mitchell Hansen, David beaulieue - abdelahad, Xiaolin Zhang, Lisa Collier & Gopal ThinakarangydF4y2Ba

2. 南佛罗里达大学莫尔萨尼医学院分子医学系，佛罗里达州坦帕，33620gydF4y2Ba

   Ari Sudwarts, morthi Ponnusamy，王帅，Mitchell Hansen, David beaulieue - abdelahad，张小林，Lisa Collier, Charles Szekeres & Gopal ThinakarangydF4y2Ba

3. 埃默里大学神经学系，亚特兰大，佐治亚州，30322gydF4y2Ba

   Supriya Ramesha, Tianwen Gao, Prateek Kumar和Srikant RangarajugydF4y2Ba

4. 精神病学遗传学中心，北海岸大学卫生系统，伊文斯顿，IL, 60201，美国gydF4y2Ba

   阿莱娜·科兹洛娃和段菊宝gydF4y2Ba

5. 乔治亚理工学院Parker H. Petit生物工程与生物科学研究所，Wallace H. Coulter生物医学工程系和Georgia W. Woodruff机械工程学院，亚特兰大，佐治亚州，30332gydF4y2Ba

   Sara Bitarafan & Levi B. WoodgydF4y2Ba

6. 芝加哥大学精神病学和行为神经科学系，芝加哥，IL, 60637，美国gydF4y2Ba

   聚宝段gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

AS、SRamesha (SRa)、GT和SRangaraju (SRu)设计了所有的体内实验并分析了数据。SRa、TG、PK和SRu设计并完成了所有体外原代培养实验并分析了数据。SRa和SRu进行了NanoString测试并分析了数据。AS、MP和GT进行免疫标记、图像采集和图像分析。AS和SW分别进行免疫印迹和qRT-PCR。MH、XZ、LC和AS进行小鼠繁殖和注射。MH、AS和CS对小鼠大脑小胶质细胞进行FACS分离。SRa和SRu分析了流式细胞术数据。AK和JD生成人体iPSC并进行iMG分化。SW生成crispr编辑的BV2细胞。 SW, DBA, and AS performed BV2 experiments. SB and LBW performed Luminex and MSD assays. SRu and GT performed bioinformatic analyses. AS, GT, and SRu wrote the manuscript, and LBW and JD edited the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba塔·ThinakarangydF4y2Ba或gydF4y2BaSrikant RangarajugydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

所有的动物实验都是在埃默里大学和南佛罗里达大学按照IACUC的规定批准和进行的。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

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