PiggyMac富含半胱氨酸结构域的不寻常结构揭示了piggybac相关转座的锌指多样性gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

转座子是一种可移动的遗传元件，它在所有生物体中定居于基因组并驱动其可塑性。DNA转座子编码的转座子结合到其同源转座子的末端并催化其运动。在某些情况下，转座子基因的剔除使新的细胞功能得以出现。纤毛虫的PiggyMac (Pgm)内切酶gydF4y2Ba草履虫tetraureliagydF4y2Ba是一种来自PiggyBac家族的驯化转座酶。它携带一个典型的piggybac相关转座的核心催化结构域和一个短的富含半胱氨酸的结构域(CRD)，两侧有N端和c端延伸。在性过程中，Pgm催化程序性基因组重排(PGR)，在每一代体细胞基因组中消除约30%的种系DNA。Pgm如何识别其在染色质中的DNA切割位点尚不清楚，其不同结构域的结构-功能关系仍然难以捉摸。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们通过确定其CRD所采用的褶皱来了解Pgm的结构，CRD是PGR所需的基本域。利用核磁共振，我们发现Pgm CRD结合了两个ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子和形成一个不寻常的双核交叉支撑锌指，有一个圆形排列的三谱号折叠，两侧是两个灵活的手臂。Pgm CRD结构明显不同于其他几种piggybac相关转座酶，其中包括来自gydF4y2BaTrichoplusia倪gydF4y2Ba．相反，半胱氨酸和组氨酸在Pgm CRD的一级序列中的排列类似于来自gydF4y2BapiggyBacgydF4y2Ba在其他物种和人类piggybac衍生的驯化转座酶中发现的类似元素。我们发现，与PB CRD不同，Pgm CRD不结合DNA。相反，它与组蛋白H3的n端相互作用弱，无论其赖氨酸甲基化状态如何。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究指出了PiggyBac家族及其驯化衍生物转座中CRD的结构多样性，并强调了该结构域可能与染色质建立的多种相互作用，从序列特异性DNA结合到与组蛋白尾部的接触。我们的数据表明，Pgm CRD折叠，其不寻常的半胱氨酸和组氨酸排列在所有piggybac相关的驯化转座中发现gydF4y2Ba草履虫gydF4y2Ba和gydF4y2Ba四膜虫gydF4y2Ba，已经存在于产生纤毛虫驯化蛋白的祖先的活性转座酶中。gydF4y2Ba

转座子或转座因子(te)是可移动的遗传因子，已被证明在所有生物王国的生物体基因组中定居[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。te分为两大类别:I类te或逆转录转座子，它们使用RNA中间体进行“复制-粘贴”转座;II类te，也称为DNA转座子，它们通过DNA中间体转座[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。DNA转座子的一个亚类遵循“剪切-粘贴”转座子机制，即它们在插入新的目标位点之前从供体位点切除。转座酶是由DNA转座子编码的酶[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]。它们通常与转座子末端的末端倒置重复序列(TIRs)结合，并催化它们从一个基因组位置移动到另一个基因组位置。当te侵入编码区或调控区，使宿主基因失活或改变其调控功能时，可能会产生有害的后果，但这有时可能会建立对宿主有益的新型调控网络[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。许多物种的基因组序列也揭示了许多以前未被识别的te衍生基因。在某些情况下，转座酶基因在进化过程中被宿主吸收以产生新的细胞基因，从而为宿主带来适应性利益[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。这被称为转座酶“驯化”。gydF4y2Ba

的gydF4y2BapiggyBacgydF4y2Ba转座子最初是从gydF4y2BaTrichoplusia倪gydF4y2Ba（gydF4y2Bat .倪gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]是一种被充分研究的DNA转座子，在许多昆虫和哺乳动物物种中具有有效的转座子活性(参见[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba])。它几乎完全插入到TTAA靶位点，并在切除后恢复原始的TTAA序列，在其供体位点没有留下足迹[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。PB, PiggyBac转座酶由gydF4y2BaT.ni piggyBacgydF4y2Ba转座子，催化在转座子过程中发生的DNA链断裂和重新连接反应[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。gydF4y2BaPiggyBacgydF4y2Ba类元素(PBLE)，其中一些被证明是有活性的，已经在许多生物的基因组中发现，包括真菌、植物和一系列广泛的后生动物[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。此外,gydF4y2BapiggyBacgydF4y2Ba转座因子衍生(PGBD)转座酶存在于几种真核生物物种中，包括人类中的五种，但其在正常组织中的细胞功能尚不清楚[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。最古老的Pgbd5在转换中活跃[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]并促进实体肿瘤的基因组重排[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，但其他四种(Pgbd1至Pgbd4)没有催化作用[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。据报道，在纤毛虫的发育过程中，驯化的PGBD转座起着重要作用gydF4y2Ba草履虫tetraureliagydF4y2Ba(PiggyMac及其类似PiggyMac的合作伙伴)[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),gydF4y2Ba四膜虫thermophilagydF4y2Ba(Tpb1, Tpb2, Tpb6和Lia5) [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

纤毛虫是单细胞真核生物，两种功能不同的细胞核在同一细胞质中共存(参见[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba])。二倍体微核(MIC)在生殖过程中将种系基因组传递给有性后代。高多倍体体细胞巨核(MAC)，源自MIC，负责基因转录，在每个性周期中被破坏。在新发展的MACgydF4y2Bap . tetraureliagydF4y2Ba，基因组经历从2n到800n的扩增，同时发生广泛的程序化基因组重排。这包括精确消除约45,000个单拷贝、非编码和短的内部消除序列(ie)，占所有生殖系DNA的约3%，以及不均匀地去除包含te和其他DNA重复序列的区域，这些区域总共占生殖系基因组的约25%。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。因为~ 50%gydF4y2Bap . tetraureliagydF4y2Ba基因在MIC中至少被一个IES中断，精确的IES切除对于新MAC中功能基因的组装是必不可少的。每个IES侧面的保守TA二核苷酸是PiggyMac (Pgm)内切酶与其PiggyMac样(PgmL)伙伴相关的DNA切割的目标[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]并且在重排的MAC基因组的切除位点保留了一个单一的TA。通过Ezl1组蛋白甲基转移酶，发育调节的H3K9me3和H3K27me3异染色质标记沉积是消除所有te和约70% ess所必需的[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。同样的,gydF4y2Bat . thermophilagydF4y2Ba使用Tpb2 [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，通过异染色质驱动的不精确切除约12,000个te相关的IESs，以消除其生殖系基因组的约三分之一[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

Pgm是一种含有1065个氨基酸的蛋白质，在DNA的IES末端裂解中起着重要的催化作用[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，而它的PgmL伙伴可能是组织切除复合体的架构子单元[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。与PB转座酶的比较表明，Pgm由四个不同的结构域组成[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba:(i)一个含有220个氨基酸的n端结构域;(ii)典型的PiggyBac家族转座酶的424个氨基酸核心结构域，其中包括三个保守的天冬氨酸(DgydF4y2Ba_401gydF4y2BaDgydF4y2Ba_491gydF4y2BaDgydF4y2Ba_609gydF4y2Ba)是切除IES所必需的;(iii)在其他生物的PBLE转座酶和驯化的PGBD蛋白中也发现了短的富含半胱氨酸结构域(CRD)，其半胱氨酸和组氨酸残基的数量和顺序有所不同[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba];(iv)预测了包含最后307个残基的c端线圈结构(CC)，这似乎是对纤毛虫驯化PGBDs的创新。前面，我们证明了PgmgydF4y2Ba_{ΔCRDgydF4y2Ba}缺乏CRD的缺失突变体在MAC发育过程中无法支持IES切除，这表明CRD对体内Pgm活性至关重要，尽管其确切作用尚不清楚[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。对于转位至关重要的PB CRD采用了博士式交叉支撑锌指折叠(即锌指，其中两个锌离子的结构核心重叠)，并特异性结合存在于的重复DNA序列基序gydF4y2BapiggyBacgydF4y2Ba转座子末端[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。最近的低温电镜数据表明，PB转座酶在由两个突触复合物组成的二聚体中组装gydF4y2BapiggyBacgydF4y2Ba左端，两个PB crd结合在一起，在复合物内引入不对称[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。gydF4y2Bap . tetraureliagydF4y2Ba有趣的是，iys不携带可能作为Pgm序列特异性识别位点的保守基序，并且与PB相比，Pgm CRD的初级序列显示出其潜在的锌配位残基的不同排列[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。综上所述，这些观察结果提出了两个问题:Pgm CRD是否采用与PB CRD相同的结构褶皱，以及它是否也与DNA相互作用。gydF4y2Ba

在本研究中，我们通过结构/功能分析来解决这两个问题。我们利用核磁共振(NMR)光谱分析了含有CRD的Pgm(692-768)的结构，发现它结合了两个具有两种不同配位模式(His-Cys)的锌离子gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-His (ZF1)和CysgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba(ZF2))，在一个交叉支撑锌指基序中，这对于以前提出的与染色质相互作用的结构域来说是非常不寻常的[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。Pgm(692-768)采用环状排列的双核三重谱子[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]，与仅在蛋白激酶C (PKC)超家族成员的C1交叉支撑锌指基元中观察到的褶皱相似。我们进一步表明，与PB CRD不同，Pgm CRD在体外不结合DNA，但与组蛋白H3的n端尾部(残基1-19)有弱相互作用，独立于Lys9的甲基化状态。我们的工作为PBLE转座及其驯化衍生物的CRD的结构和功能多样性开辟了新的视角。gydF4y2Ba

PB转座酶和驯化PGBD蛋白的CRD变异性gydF4y2Ba

先前的蛋白质序列比对显示，位于PBLE转座酶和大多数PGBD驯化转座酶的c端核心区域的crd之间存在不同的Cys/His排列[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。的CRDgydF4y2Bat .倪gydF4y2BaPB转座酶具有CxxC-CxxC-CxxH-CxxC基序(其中C、H和x分别表示半胱氨酸、组氨酸和任何其他残基)，也存在于PBLE转座酶和PGBD蛋白的一个子集中(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，形成配合两个Zn的博士状锌指gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。在Pgm CRD中发现的假定的变异基序(CxxC-CxxC-CH-CxxxH)最初被提出采用类似的折叠，尽管其Cys和His残基的数量和位置不同[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。然而，初级序列比对显示，与Pgm中变异基序的第5半胱氨酸相邻的His738在其他PGBD驯化转座的crd中并不保守，在其他具有相似Cys和His残基排列的PBLE转座中也不保守。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，令人怀疑His738实际参与了Pgm CRD的折叠。相反，我们注意到在Pgm (His701)和其他携带变异Cys/His排列的CRDs中，一个组氨酸残基系统地存在于第一个保守半胱氨酸双偶体上游的可变距离处。观察到的Pgm和PB CRDs一级序列特征的差异表明它们可能采用不同的褶皱。这促使我们求解Pgm(692-768)变异域的结构。gydF4y2Ba

锌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}His701、His738和His749的协调模式gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba采用核磁共振波谱法获得Pgm(692-768)*的N HSQC谱图(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2BaA)表现出明显的分散gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH共振化学位移，大多数交叉峰在6.6-11 ppm范围内，反映了良好折叠结构的存在。我们发现锌离子在维持Pgm(692-768)*的结构完整性方面起着关键作用。事实上，在过量EDTA (10mm)络合锌离子的存在下gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba1D光谱给出了随机线圈外观的证据，表明域展开，因为观察到化学位移色散显著减少(图1)。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba）.组氨酸配体可以结合锌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}使用两种不同的配位模式，涉及它们的内环氮(Nδ1或Nε2)。的锌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}配位模式与组氨酸的互变异构形式有关:当去质子化的Nδ1结合Zn时gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}， Nε2被质子化，反之亦然(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).因此，首先，我们使用NMR来确定Pgm(692-768)*中组氨酸残基的质子化状态。如前所述[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]，组氨酸的Cδ2和Cε1化学位移可以作为蛋白质中组氨酸配位模式的标志。使用gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC HSQC(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)我们得到了His749的c δ2和Cε1化学位移(分别为126.0 ppm和140.0 ppm)，这清楚地表明His749具有Nε2配位模式[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。然而，His701(分别为120.2 ppm和139.0 ppm)和His738(分别为118.4 ppm和138.0 ppm)的Cδ2和Cε1化学位移使我们无法区分配位组氨酸和非配位组氨酸。我们只能得出结论，His701和His738是H-Nε2互变异构体形式。gydF4y2Ba

我们也使用了远程gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN HSQC测定Pgm(692-768)三个组氨酸残基的不同形式。交叉峰的强度(依赖于j耦合)使得确定Nε2和Nδ1的化学位移成为可能，与H-Nδ1互变异构体相比，H-Nε2互变异构体的化学位移是倒置的。无论哪种互变异构体，Nε2与H-Cε1和H-Cδ2之间存在两种强相关性，而Nδ1与H-Cε1之间只有一种相关性。在His701和His738中观察到的模式具有三个连通性(hε 1- nε 1, Hε1-Nε2和Hδ2-Nε2)(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad)，与H-Nε2互变异构体的形成一致[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。对于His749，观察到的模式由四个连接组成(HCε1-Nε2, HCδ2-Nε2, HCε1-Nδ1和HCδ2-Nδ1)，这些连接与H-Nδ1互变异构体的形成相适应。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba因此，一方面His701和His738 Nδ1，另一方面His749 n δ 2可能与Zn相互作用gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}．比较两者之间的差异gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNδ1和gydF4y2Ba^15gydF4y2BaHis701 (45.7 ppm)、His738 (88.4 ppm)和His749 (46.0 ppm)的Nε2化学位移与非zn的Nε2化学位移一致gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-相互作用组氨酸残基(平均约80 ppm)允许我们提出His701和His749与Zn协调，而不是His738gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

锌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}通过原子发射光谱进一步证实了His701的配位(表1)gydF4y2BaS1gydF4y2Ba）.与野生型Pgm相比，His701突变为丝氨酸残基导致锌释放量减少(692-786)。而His738突变对锌的释放无显著影响。结合我们的核磁共振和原子发射光谱结果，我们可以明确地看出，His701 Nδ1和His749 Nε2参与了Zn的配位gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}而His738则不然。gydF4y2Ba

Pgm(692-768)结构域结构gydF4y2Ba

TALOS+分析[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba用HN、Hα、Cα、Cβ、CO和N的化学位移来估计Pgm(692-768)*二级结构和phi和psi主扭角。TALOS+结果显示，Pgm(692-768)*由包含724-730和744-751残基的2条α-螺旋和包含703-705、709-710、720-723和735-737残基的4条β-链组成。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

采用施加两个Zn的四面体配位的距离和角度约束进行了CYANA结构计算gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子:第一个是含有His701 Nδ1、Cys723 S、Cys726 S和His749 Nε2原子，另一个是含有Cys712 S、Cys715 S、Cys737 S和Cys745 S原子。选取15个结构进行结构分析(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，并在图中叠加。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个和gydF4y2BaS2gydF4y2Ba．Pgm(692-768)的结构显示，残基His701至His749具有明确的球形结构域，与主链原子的平均结构的均方根偏差(rmsd)为0.54±0.19 Å，两个锌结合基序呈交叉支撑排列(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae和gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab). CRD结构由两个反平行的β-片和两个α-螺旋，加上一个由四个残基(残基738-741)组成的迷你螺旋组成。第一个β-薄片包含两条链，β1(残基703-705)和β4(残基721-723)。第二个β-薄片由两条链组成，β2(残基710-712)和β3(残基716-719)，是残基706至720延伸的长弯曲发夹的一部分，位于由两个螺旋形成的核心之上。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa和b)。在N端和c端区域观察到高度的柔韧性(图2)。gydF4y2BaS2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

分析gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN弛豫突出了Pgm的N端和c端区域的化学交换(692-768)。gydF4y2Ba

我们观察到的峰线宽的异质性gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN HSQC，其中一些表现出明显较弱的强度(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).为了确定异质性是否来自不同构象之间的交换过程，我们使用950 MHz的核磁共振弛豫测量监测了Pgm(692-768)*主干的动力学gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH频率和20°C(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.核磁共振gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN松弛测量是一个强大的工具，以表征动态过程的蛋白质在溶液中，在广泛的时间尺度。gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN的弛豫是由gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN键向量，它代表蛋白质的整体运动(刚体的扩散)和内部向量(原子键)的运动的组合。在皮秒-纳秒(ps-ns)尺度上的快速运动可以用异核来表征gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN纵向松弛率(RgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba)，横向弛豫速率(RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba),gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN - {gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba酰胺基团共振的H}异核Overhauser效应(hetNOE)。化学交换机制涉及微秒-毫秒(μs-ms)尺度上的一般运动，并有助于RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba横向弛豫率。它们可以通过测量超额贡献(R)来描述gydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba})到RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结果表明:gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN松弛率在残数701 ~ 737的区域内相对均匀，平均RgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba, RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，gydF4y2Banoe值为1.07±0.03 sgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}， 13.00±0.56秒gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别为0.85±0.09。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa - c)。相比之下，N端和c端末端(残基687-700和752-768)总体较高gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN RgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和更低的gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和hetNOE值，表明锌指侧交叉支撑节段活动度升高。顺序参数gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba描述了H-N键在结构框架内的内部运动幅度，刚性键接近于1，柔性键接近于0。具有更高灵活性的区域也通过主干顺序参数突出显示gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba^2gydF4y2BaTALOS+估算[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba(并源自thegydF4y2Ba化学变化gydF4y2Ba)，因为talos预测的平均值gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba残基685-700和756-768的值分别为0.55和0.63，而结构良好的残基701-755的值为0.86。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad)。这与每个残基的rmsd一致，对于N端和c端柔性区，rmsd特别高，平均值约为20 Å(残基685-700)和15 Å(残基756-768)，而残基701-755的rmsd为2.5 Å(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

我们注意到，包含柔性n端结构域(695-699)残基的Pgm区域，以及包含柔性c端结构域的741-744环、α2螺旋(745-751)和几个残基(752-755)的Pgm区域显示出更高的RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba值大于平均RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba计算了CRD结构部分的前三个季度(残差701-737)(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).这可能是由于μs-ms构象或化学交换的贡献。无模型分析[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba的gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba核磁共振弛豫数据提供了分子运动的内部迁移率和时间尺度方面的信息。除了相关时间(τc)描述的整体分子运动之外，内部运动的描述由平方阶参数(S)反映gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)，内相关时间(τε)和化学交换贡献(RgydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba})到横向弛豫(RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba）.总体相关时间(τc)由RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba/ RgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba比(6.62±0.04 ns)，与Pgm(692-768)*处于单体状态一致[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。均值SgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(0.92±0.03)，符合刚性和结构良好的区域(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf). N端和c端残基的平均值为SgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba分别为0.38±0.06和0.32±0.03:内相关次数(τgydF4y2Ba_εgydF4y2Ba)对应于纳秒时间尺度的运动，必须引入这些残差来拟合松弛数据(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag)，与N端和c端区域非常灵活一致。作为无模型分析的结果，引入了两个区域(残基695-702和741-755)和分散在结构区域内的8个氨基酸的显著化学交换贡献(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bah)。这些交换可能是由Pgm CRD的远程三级折叠引起的，这使得N端和c端区域彼此靠近，使它们能够以一种短暂的方式相互作用(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba我)。gydF4y2Ba

没有检测到Pgm CRD与DNA的结合gydF4y2Ba

我们之前已经证明，PB CRD是一个双链DNA结合域，可以特异性识别DNA末端的保守序列基序(5 ' -TGCGT-3 ' /3 ' -ACGCA-5 ')gydF4y2BapiggyBacgydF4y2Ba转座子从gydF4y2Bat .倪gydF4y2Ba［gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。为了检验Pgm CRD是否也是一个DNA结合域，我们进行了DRaCALA实验(配体差异径向毛细管作用测定法)[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]，见材料和方法)，其中我们比较了纯化的GST-Pgm(692-768)和GST-PB(538-594)与携带IES的双链DNA的结合，在没有竞争DNA的情况下，允许检测非特异性DNA结合(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).我们首先选择IESgydF4y2Ba51个gydF4y2Ba1835作为衬底(图5)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，因为它属于30%的ess，其切除仅取决于核心Pgm/PgmL机制，而不取决于表观遗传染色质标记的沉积[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。我们观察到GST- pb(538-594)与该DNA底物可重复结合，而在缺乏蛋白质或单独与GST孵育后未检测到结合。因为不符点gydF4y2Ba51个gydF4y2Ba1835与PB CRD的天然特异性底物无关，这证实了DRaCALA试验可以揭示非特异性蛋白质- dna相互作用。相反，我们没有检测到与Pgm(692-768)或任何PgmL蛋白的CRD的DNA结合。然而，我们发现MBP与全长Pgm或其不同变体(包括MBP-Pgm)融合gydF4y2Ba_{ΔCRDgydF4y2Ba}(其中删除了CRD)， MBP-PgmgydF4y2Ba_{ΔCCgydF4y2Ba}(删除c端扩展名)[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]和MBP-PgmgydF4y2Ba_{D401AgydF4y2Ba}(其中催化三联体的第一个天冬氨酸被丙氨酸取代)-所有结合DNA(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa)表明CRD对于全长Pgm与DNA的结合是不可缺少的，尽管它对于体内Pgm的活性是必不可少的[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。与DRaCALA并行，我们进行了电泳迁移转移实验(EMSA)，并在携带IES的双链DNA底物孵育后，检测到纯化的GST与Pgm(692-768)， PgmL2(540-614)或PgmL4(856-931)的融合没有DNA结合活性gydF4y2Ba51个gydF4y2Ba1835年，也就是IES的左端gydF4y2Ba51个gydF4y2Ba4404(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab和S3)。从这些实验中我们得出结论，Pgm CRD本身在体外没有DNA结合活性。gydF4y2Ba

为了完成这一分析，我们通过NMR测试了Pgm CRD是否能够结合携带IES的双链DNA寡核苷酸gydF4y2Ba51个gydF4y2Ba1835和它的左侧序列，或mac -目标序列，侧翼IESgydF4y2Ba51个gydF4y2Ba4404(无花果。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba）.对应于Pgm(692-768)* in的交叉峰gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba在没有DNA和存在DNA的情况下记录的H NOESY光谱既没有显示化学位移，也没有显示强度变化(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).这再次与我们最近对PB CRD的描述形成对比[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。根据在Pgm(692-768)的一个核磁共振结构上计算的静电电荷分布，Pgm交叉支撑锌指(Pgm(701-749))的整体表面电荷为负(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad)，与计算得到的等电点5.48一致(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.交叉支撑锌指的一个面比另一个面呈现出更多的负电荷分布，这表明Pgm(701-749)的两个面可以与带正电的分子进行静电相互作用，而不是与带负电的分子(如DNA)进行静电相互作用。gydF4y2Ba

总之，我们的研究结果表明，与PB CRD不同，Pgm CRD在体外不与DNA结合，符合全局负电荷模式。值得注意的是，没有检测到任何PgmL蛋白的CRD的DNA结合活性，它们都表现出与Pgm CRD相似的His和Cys残基排列(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

Pgm CRD与组蛋白H3的相互作用gydF4y2Ba

在gydF4y2Bap . tetraureliagydF4y2BaEzl1是负责H3K9和H3K27三甲基化的组蛋白甲基转移酶[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，抑制TEs和大部分ess的消除[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。这表明H3K9me3和H3K27me3修饰参与了将pgm相关复合物靶向到异染色质区域并驱动它们的消除。与Tpb2的CRD相比，Pgm CRD的His和Cys残基排列相似gydF4y2Ba四膜虫gydF4y2Ba同源驯化转座酶(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，它被证明与异染色质相互作用，特别是与组蛋白H3的三甲基化n端尾部[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。由于Pgm CRD不结合DNA，我们研究了它是否具有与Tpb2p CRD相似的组蛋白结合能力。我们首先进行了纯化的gydF4y2Bap . tetraureliagydF4y2Ba组蛋白(无花果。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)与GST-Pgm(692-768)和MBP-Pgm(692-768)，并发现每个融合蛋白沉淀内源性H3(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa - b)。GST或MBP标签单独检测到很少或没有沉淀，表明相互作用是由Pgm(692-768)本身介导的。由于没有特异性，我们无法确定组蛋白H2A/B或H4是否也有沉淀gydF4y2Ba草履虫gydF4y2Ba组蛋白抗体可用。gydF4y2Ba

为了进一步了解组蛋白n端尾部甲基化在Pgm CRD与H3相互作用中的作用，我们使用纯化的MBP-Pgm(692-768)和合成的c端生物素化进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)gydF4y2Ba草履虫gydF4y2BaH3(1-19)和H3(16-35)肽。我们使用了H3(1 - 19)肽，在Lys4或lys9上非甲基化或三甲基化，以及含有与H3(1 - 19)相同氨基酸的两个混乱肽(scramble 1和scramble 2)，但顺序不同(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).我们还使用了两个H3(16-35)肽:一个非甲基化的版本和一个携带三甲基化Lys27的修饰变体。H3(1-19)、H3(1-19)K4me3和H3(1-19)K9me3均与MBP- pgm(692-768)相互作用，而单独使用MBP未检测到信号(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad)。在MBP-Pgm存在的情况下，H3(16-35)和H3(16-35)K27me3仅检测到背景信号(692-768)，这表明无论Lys27是否甲基化，Pgm CRD都不会与H3(16-35)相互作用。在所有测试的H3(1-19)肽中，未甲基化的H3(1-19)和H3(1-19)K9me3与MBP-Pgm(692-768)的相互作用信号最强，但也检测到与H3(1-19)K4me3的相互作用。这表明Pgm CRD能够独立于Lys4和9的甲基化状态与组蛋白H3的n端尾部相互作用。在不同H3肽存在的情况下，与所有PgmL CRDs获得了相似的相互作用信号(图3)。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

为了监测Pgm CRD的正确折叠是否对其与H3(1-19)的相互作用至关重要，我们重复了ELISA实验，并在10 mM EDTA存在的情况下培养MBP-Pgm(692-768)与H3(1-19)的融合，过量浓度会触发该结构域的展开(图1)。gydF4y2BaS1gydF4y2Ba）.在这些条件下，我们观察到相互作用信号的强烈减弱(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae)，表明Pgm CRD的交叉支撑锌指褶皱对于其与H3的相互作用至关重要(1-19)。令人惊讶的是，我们发现Pgm CRD的两个突变版本仍然与H3相互作用，无论是在组蛋白下拉实验中还是在ELISA分析中(图3)。gydF4y2BaS6gydF4y2Ba):单个突变体在其中一个锌配位基序中携带C712S取代，从而降低了整体ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}负载至~ 20%(表1gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)，以及携带C712S和H701S取代的双突变体，预计会破坏两个锌协调基序。过量的EDTA消除了与双突变体的相互作用信号(图2)。gydF4y2BaS6gydF4y2Bad)，表明突变体CRD H701S + C712S仍然能协调足够的ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子维持结构折叠并与H3相互作用(1-19)。gydF4y2Ba

Pgm(692-768)与H3(1-19)的接触分析gydF4y2Ba

我们观察到两种混乱的H3(1-19)肽在Pgm CRD的存在下表现不同(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad和gydF4y2BaS7gydF4y2Baa).与H3(1 - 19)相比，scramble 1与MBP-Pgm(692-768)的相互作用信号更大，而scramble 2只观察到背景信号。肽序列的比较表明，与H3(1 - 19)一样，scramble 1具有一个n端丙氨酸和五个基本残基，而scramble 2在其n端携带一个未带电的STQ序列，这表明n端正电荷对于与Pgm CRD相互作用的重要性(图1)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).与未修饰的H3(1-19)相比，MBP-Pgm(692-768)与H3(1-19)K4me3的相互作用信号降低了30%，这似乎与H3 n端附近的正电荷对相互作用很重要是一致的。值得注意的是，TOCSY实验揭示了Pgm CRD存在时H3的前两个残基(Ala1和Arg2)的共振的化学位移扰动(图2)。gydF4y2BaS7gydF4y2Bab)，证实H3的n端残基参与了相互作用。gydF4y2Ba

为了进一步表征Pgm(692-768)和H3(1-19)之间的接触，我们再次使用核磁共振波谱。加入H3(1-19)的效果gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban标记Pgm(692-768)*用gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN HSQC(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa和b)。在组蛋白肽存在的情况下，我们观察到信号子集的差异展宽和化学位移扰动(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac).这些扰动的映射突出显示了两个区域(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad)。第一个(695-702)位于球状锌指结构上游的柔性n端延伸内(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa)。第二个区域(739-753)包括来自结构褶皱的几个酸性残基(来自螺旋α1和α2之间连接的Glu739和Asp741以及来自螺旋α2的Glu750(743-753))。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab)，其中Glu739的化学位移变化最大。有趣的是，这两个与H3肽接触的区域对应于我们获得构象交换证据的区域(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf)，可能是由于彼此之间的瞬态相互作用造成的(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bae)。这个实验使我们能够计算表观解离常数(KgydF4y2Ba_DgydF4y2Ba)为289±70 μM(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bae)，假设为1:1结合，说明Pgm CRD与H3(1-19)的相互作用较弱。gydF4y2Ba

综上所述，我们的研究结果表明，Pgm CRD与H3(1-19)的相互作用是弱的，不依赖于Lys4和Lys9的甲基化，而主要依赖于静电相互作用，Pgm(692-768)的酸性残基与H3的带正电的n端接触。gydF4y2Ba

Pgm CRD形成一个不寻常的锌指结构gydF4y2Ba

程序化基因组重排gydF4y2Bap . tetraureliagydF4y2Ba为转座子对宿主基因组可塑性和进化的影响提供一个很好的例证。Pgm是具有催化功能的驯化转座酶的一个例子[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。然而，人们对其不同区域的结构-功能关系知之甚少。在这项研究中，我们首次深入了解了Pgm的结构，并证明了它的CRD，之前被证明是体内活性所必需的，可以结合两个ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}从而形成一个交叉支撑的锌指。此外，我们发现Pgm CRD不结合DNA，但能够在体外结合组蛋白H3的n端残基，尽管对甲基化赖氨酸没有特异性亲和力。gydF4y2Ba

锌指通常是已知的在几乎所有细胞过程中发挥作用的较大蛋白质的一部分。这些结构域以其锌结合残基及其各自的缠结或二级结构的折叠为特征，被分为40个科[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]，其中人口最多，实验上表征良好的“真正有趣的新基因”(RING) [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]、植物同源域(PHD) [gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]和五个家庭[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。即使RING、FYVE和PHD结构域具有共同的结构褶皱和两个Zn的结合模式gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}离子(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaF)，它们在选择目标方面表现出显著的多样性。博士指[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]，例如，在已知的染色质修饰蛋白和许多染色质调节因子中发现。它们通常作为表观遗传效应物或读取器与修饰或未修饰的组蛋白H3尾部相互作用[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。在与PHD结构域相互作用后，H3尾部通常采用延长的β链状构象，并与PHD锌指的β片对齐，作为第三条反平行β链(图2)。gydF4y2BaS8gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。我们在这里表明，Pgm CRD不会折叠成任何典型的RING、FYVE或PHD结构，这与我们在PB CRD中观察到的相反[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。它采用类似于C1交叉支撑锌指基元的拓扑结构，在蛋白激酶C (PKC)超家族成员中高度保守，这些成员对磷脂具有共同的激酶活性需求[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]，但具有不同数量的β链和α螺旋(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad e和gydF4y2BaS9gydF4y2Ba）.尽管有类似的褶皱，但Pgm(701-749)的长可达弯曲发夹并没有表现出DAG/ phobol酯靶向的典型C1结构域中发现的疏水口袋(图2)。gydF4y2BaS10gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

Pgm和PB CRDs与不同的底物相互作用gydF4y2Ba

我们观察到全长Pgm与DNA结合，正如预期的一个活性内切酶，其催化位点负责IES边界的切割(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.然而，与我们为PB CRD所作的报告相反，[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，我们在DRaCALA, EMSA或NMR分析中未检测到Pgm CRD的DNA结合活性，我们也未发现其PgmL伴侣的CRD的DNA结合活性。Pgm CRD缺乏DNA结合活性可能反映了剪切-粘贴转位和Pgm介导的IES消除之间的重要差异。事实上，尽管gydF4y2Ba草履虫gydF4y2Ba至少有很大一部分人是祖先的遗留物gydF4y2BaTc1 /海员gydF4y2Ba转座子(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]，它们的切除是由piggybac相关的驯化转座子介导的，它属于一个独特的II类转座子家族[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。此外，IESs没有保守的基序，可以作为切除复合体的特定识别序列。现有的实验证据表明，IES识别是由母体通过非编码rna和表观遗传染色质标记的联合作用来控制的[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。我们的结果表明，与PB转座酶相反，是什么驱使PgmgydF4y2Ba草履虫gydF4y2BaIES不是将其CRD与IES DNA直接结合。gydF4y2Ba

相反，我们观察到Pgm CRD与组蛋白H3的相互作用具有弱的结合亲和力。Pgm CRD的组蛋白而非dna结合活性与折叠结构域表面的电荷分布一致，主要是带负电荷(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.相比之下，确实与DNA结合的PB - CRD则整体带正电[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。我们将相互作用映射到Pgm CRD的两个不同区域:一个主要是疏水区域，位于侧翼n端部分(残基695-702)，第二个区域(743-753)包含酸性残基，大约对应于最后一个α-螺旋(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.当添加过量的EDTA后，交叉支撑锌指褶皱被破坏时，这两个区域可能无法正确地折叠在一起，导致与H3接触的强烈减少(图3)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.值得注意的是，Pgm CRD含有两个β-片，它们可能与H3的n端尾部以延长的β链状构象相互作用，正如在PHD结构域中观察到的那样，但它们似乎不参与与H3的相互作用(1-19)。gydF4y2BaS8gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

对于组蛋白H3尾部，一些证据表明H3的n端正电荷参与了与Pgm CRD的接触(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2BaS7gydF4y2Ba）.考虑到组蛋白甲基转移酶Ezl1在程序化DNA消除过程中催化H3K9和H3K27三甲基化的重要作用，对Lys9和Lys27三甲基化缺乏特异性有些出乎意料gydF4y2Bap . tetraureliagydF4y2Ba［gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。以前的假设是H3K9me3和/或H3K27me3驱动Pgm复合体到ezl1依赖的ess和其他异染色质相关区域，并以消除它们为目标。我们在这里表明，Pgm CRD与H3(1-19)相互作用独立于Lys9甲基化，不与Lys27周围的区域相互作用。综上所述，我们的结果表明，观察到的Pgm CRD与H3的n端尾部的弱相互作用是通过静电荷介导的，我们可能没有确定该结构域的特定底物。pmg相关复合体的另一个组分仍有待鉴定，它可能携带特定的H3K9me3和/或H3K27me3识别结构域，并将切除复合体定位于ezl1依赖的IES切除位点。gydF4y2Ba

PBLE转座酶和驯化PGBD蛋白的CRDs的结构-功能变异性gydF4y2Ba

我们最近鉴定了5组同源的PgmL样蛋白(PgmL)gydF4y2Bap . tetraureliagydF4y2Ba(PgmL1 - PgmL5) [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，其中没有一个含有完整的DD(D/E)活性位点，这表明pgml没有催化活性。所有的PgmL都携带一个CRD，其中与锌结合的Cys/His相对于Pgm是保守的，这表明尽管PgmL CRD具有不同的初级序列，但它们可能具有相同的三级褶(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.每个PgmL都能够与Pgm形成复合物，在IES切除中起重要作用，并且是正确完成自配所必需的。由于其不同的初级序列，PgmL CRD具有非常不同的等电点，只有PgmL4 CRD具有接近Pgm CRD的酸性等电点(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.尽管存在这些差异，但在ELISA检测中，所有PgmL CRDs都与未甲基化或甲基化的H3(1-19)肽具有相似的相互作用信号，而它们既不与H3(16-35)也不与H3(16-35)K27me3相互作用。gydF4y2BaS5gydF4y2Ba）.我们得出结论，Pgm和PgmL CRDs与H3的n端尾部具有相似的结合特性，而不依赖于Lys9和27的甲基化状态。未来的研究应该解决Pgm和PgmL CRDs之间的合作相互作用是否可以为Pgm相关复合物识别组蛋白尾部提供更高的亲和力和/或特异性。gydF4y2Ba

在有远亲关系的纤毛虫中gydF4y2Bat . thermophilagydF4y2BaTpb2驯化转座酶在有性生殖过程中催化异染色质驱动的DNA消除[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。Tpb2 CRD能够结合异染色质并与组蛋白H3的n端尾部相互作用，并优先选择Lys9或Lys27上的三甲基化蛋白[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。Tpb2p CRD的折叠尚未被表征，先前提出了7个组氨酸和半胱氨酸残基参与PHD锌指的折叠[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。基于序列比对(图1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，我们在这里发现Tpb2和Pgm CRDs的初级序列具有相似的组织，具有1个组氨酸和7个半胱氨酸残基，这表明这两个CRDs可能采用相似的交叉支撑锌指结构。Pgm CRD与H3的n端尾的弱相互作用似乎需要Zn的配位gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}参与CRD折叠的离子(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.同样，突变体Tpb2 CRD具有两个潜在的ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}结合半胱氨酸/组氨酸残基转变为丙氨酸在拉下试验中失去了结合H3 n端肽的能力[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。因此，全长突变体Tpb2不能触发异染色质体的形成，并且在体内对DNA消除不活跃，这表明Tpb2在与异染色质相互作用中的重要性[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。尽管结构相似，但Pgm和Tpb2 CRDs具有不同的等电点和区分甲基化和非甲基化组蛋白尾部的能力，这可能反映了两种纤毛虫在程序性DNA消除机制和/或控制方面的主要差异。的确,gydF4y2Ba草履虫gydF4y2BaIESs都是从基因和非编码区精确切除的，而只有一小部分依赖于H3三甲基化被切除。相比之下，所有gydF4y2Ba四膜虫gydF4y2Ba它们都是基因间的，需要异染色质形成来不精确地消除它们。gydF4y2Ba

pble存在于许多生物体中，如真菌、植物、昆虫、鱼类和哺乳动物[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]，其中一些在换位时很活跃[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。对PBLE转座子的大规模调查允许根据末端DNA重复序列的不同组织定义四个结构组[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。特别是，gydF4y2BapiggyBatgydF4y2Ba转座子来自蝙蝠gydF4y2Ba鼠耳蝠lucifugusgydF4y2Ba，属于第一组，其末端携带简单的15 bp的tir [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),而gydF4y2BapiggyBacgydF4y2Ba从gydF4y2Bat .倪gydF4y2Ba和gydF4y2BaPLE-wugydF4y2Ba来自昆虫gydF4y2BaSpodoptera frugipedagydF4y2Ba［gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，是第四组的代表，携带具有多个内部重复的复杂tir，并且可能需要复杂的相互作用才能使其转座体正确构象[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。虽然所有的PBLE转座都有一个特有的保守结构域(PF13843，或DDE_Tnp_1_7)，其中包括它们的催化位点，bouall等人的研究。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]强调了在c端crd中发现的Cys/His基序的多样性。我们以前的[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，目前的研究表明，不同的Cys/His基序可能采用不同的结构褶皱。两个活性PBLE转座酶的序列比对(PLE-wu [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]和PiggyBat-Mlu [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba])表明它们共享一个保守的His(与Pgm His701对齐)，后面跟着7个Cys或His残基(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明它们的CRD可能采用Pgm CRD褶皱。因此，Pgm CRD的变异折叠，也可能在其他纤毛虫驯化转座酶(PgmL或Tpb蛋白)中发现，可能是从祖先的活性纤毛虫PBLE转座酶遗传而来的gydF4y2Bat .倪gydF4y2BaPB转座酶，而不是在驯化过程中进化而来。在人类中，虽然Pgbd1和5不携带可识别的CRD，但Pgbd2, 3和4在其CRD的初级序列中显示出类似pgm的His和Cys残基排列(图5)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，再次表明它们可能起源于携带Pgm CRD折叠的活性PBLE转座。目前可获得的数据显示，PBLE转座子末端的DNA序列组织与其各自转座座的CRDs的推定折叠之间没有直接的相关性。例如，即使在第四组pbel中，PLE-wu CRD也可能采用与Pgm CRD褶皱相似的结构(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.PLE-wu CRD是否像PB CRD一样，与DNA重复序列特异性结合或与组蛋白相关尚未确定。更一般地说，类似结构的存在使我们无法预测PBLE转座或其驯化的PGBD对应物的crd的首选底物，强调这些结构域的多功能性和它们可能参与的相互作用的多样性。gydF4y2Ba

序列分析gydF4y2Ba

使用MUSCLE 3.8 (gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/gydF4y2Ba)，手动调节。gydF4y2Ba

肽gydF4y2Ba

未标记和生物素化合成gydF4y2Ba草履虫tetraureliagydF4y2Ba组蛋白H3肽(图3)gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)由Proteogenix (Schiltigheim, France)合成，无需进一步纯化即可使用。gydF4y2Ba

gst标记CRDs的表达和纯化gydF4y2Ba

对编码Pgm(692-768)及其C712S和H701S + C712S突变衍生物PB(538-594)、PgmL1(463-539)、PgmL2(540-614)、PgmL3a(471-550)、PgmL4a(856-931)和PgmL5a(761-840)的合成DNA片段(Integrated DNA Technologies)进行PCR扩增和克隆gydF4y2Ba生态gydF4y2Ba国际扶轮和gydF4y2BaXhogydF4y2Ba质粒pGEX6p1的限制性位点(产生的质粒序列在文件中)gydF4y2BaS2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

用于核磁共振光谱，BL21-Gold (DE3)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达GST-Pgm(692-768)的细胞在M9最小培养基中37°C培养gydF4y2Ba^15gydF4y2BaNHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaCl (1g /L)(美国剑桥同位素实验室)和d -葡萄糖-gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba(Cambridge Isotope Laboratories, USA)或未标记的d -葡萄糖(3g /L)进行表达gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC /gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN -或gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban标记的Pgm CRD。在ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6 ~ 0.8，用0.2 mM异丙基β- d -1-硫代半乳糖苷(IPTG)在1 mM ZnSO存在下诱导细胞3h30gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba然后收集并悬浮于缓冲液A (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.15 M NaCl, 10%甘油，10 mM 2-巯基乙醇)中，并添加0.5 mM苯基甲烷磺酰氟(PMSF)。用法式压滤机裂解细胞，清除后的上清通过0.45 μm注射器过滤器过滤，然后上样于2.5 ml Glutathion Sepharose™4B树脂(GE Healthcare)上，在室温下孵育1小时。用30ml缓冲液a洗涤树脂5次。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae)使用100单位的precisision蛋白酶在4°C的10 mL缓冲液a中过夜，从gst标签上切割。上清液在25 mM HEPES pH 7.6, 5%甘油缓冲液(真空脱气溶液)中稀释3倍，并上载到1 mL的HiTrap™Q HP柱(GE Healthcare)上。在25 mM HEPES pH 7.6, 5%甘油缓冲液(25柱体积)中，用50 ~ 1000 mM NaCl线性梯度洗脱CRD肽。用SDS-PAGE对含crd的样品进行鉴定，然后在5 mM (if)的NMR溶液中进行池化和透析两次gydF4y2Ba^15gydF4y2Ban标记)或0.5 mM(如果未标记)HEPES pH 7.5, 25 mM NaCl)，使用Spectra/Por3透析膜，在- 80°C保存之前。整个纯化过程如图所示。gydF4y2BaS11gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

用于DNA或组蛋白结合试验，BL21-Gold (DE3)gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达GST- crd融合或单独表达GST的细胞在添加0.1 mM ZnSO的LB培养基中于37°C培养gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba．在0.1 mM IPTG存在的16°C或0.5 mM IPTG存在的30°C条件下诱导表达每种GST融合蛋白的指数生长细菌过夜，然后收集并悬浮在缓冲液B中(10 mM Tris pH 7.4;500 mM NaCl;100 μM ZnSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba;1mm DTT;1% Triton + 1 cOmplete™片EDTA-Free Roche EasyPack)。使用BioRuptor (Diagenode)超声进行细胞裂解。500 μl浆液谷胱甘肽sepharose微球4B (GE healthcare)在2.5 ml缓冲液b中预平衡3次，清除的裂解物(10 ml)装在微球上，在4°C的转轮上孵育过夜。孵育后，用2.5 mL缓冲液B洗涤4次(最后一次在车轮上清洗10分钟，4°C)。在室温下，用500 μl 10 mM Tris pH 8和20 mM谷胱甘肽洗脱2次，洗脱15 min。用BiCinchoninic acid Assay (BCA kit ThermoFisher)测定纯化蛋白浓度。整个纯化过程如图所示。gydF4y2BaS11gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

MBP融合蛋白的表达和纯化gydF4y2Ba

合成DNA片段(Integrated DNA Technologies)编码MBP-PgmL1(463-539)、MBP-PgmL2(540-614)、MBP-PgmL3a(471-550)、MBP-PgmL4a(856-931)、MBP-PgmL5a(761-840)以及野生型和突变型的MBP-Pgm(692-768)，通过pcr扩增并插入gydF4y2Ba生态gydF4y2Ba国际扶轮和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BapMAL-c2X载体的I个位点(新英格兰生物实验室，见文件中的质粒序列)gydF4y2BaS2gydF4y2Ba）.MBP-CRD融合体在BL21-Gold (DE3)中的表达和纯化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba对细胞进行如上所述的GST-CRD融合处理，除了每个清除的上清被加载到1 ml MBP-Trap HP预填充柱(GE-Healthcare)上进行亲和纯化，并用10 mM麦糖糖洗脱MBP-CRD。所有纯化的制剂如图所示。gydF4y2BaS11gydF4y2Ba．对于那些在过表达或细菌裂解过程中释放一些游离MBP标签的制剂，通过从Instant blue染色凝胶或western blots获得的条带强度比来估计全长蛋白的比例。使用Imagelab软件(BIORAD)对波段强度进行量化。在组蛋白结合试验中，仅考虑全长融合蛋白的量来计算输入CRD的量。gydF4y2Ba

对于MBP-PgmD401A的表达，在质粒pVL1392-MBP-PGM中编码Asp401的GAC密码子被丙氨酸密码子(GCC)取代[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。为了产生重组杆状病毒，产生的质粒(文件gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)和先前构建的表达MBP-Pgm、MBP-Pgm的基因gydF4y2Ba_{ΔCRgydF4y2Ba}和MBP-PgmgydF4y2Ba_{ΔCCgydF4y2Ba}［gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]与BD baculoold线性杆状病毒DNA (BD Biosciences)一起转染到High Five昆虫细胞中。从重组杆状病毒感染的细胞中纯化mbp标记的Pgm衍生物，方法如下[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，最后在添加了10 mM麦芽糖的缓冲液a中进行洗脱。gydF4y2Ba

核磁共振光谱学gydF4y2Ba

Pgm(692-768)*获得了高质量的核磁共振数据。NMR蛋白样品在90% H中浓缩至0.15-0.5 mMgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO / D 10%gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO含有5 mM HEPES, 25 mM NaCl, pH 6.8，或在99.99% D中冻干重悬gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba核磁共振实验在293 K下进行，800 MHz或950 MHz配备TCI冷冻探针的AVANCE III HD布鲁克光谱仪。gydF4y2Ba

^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba在800 MHz、90% H下获得Pgm(692-768)*的N HSQC光谱gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO / D 10%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与阿gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN载体设置为120 ppm，以观察主酰胺基团。为了观察单键耦合，将INEPT半延迟设置为2.8 ms (gydF4y2Ba^1gydF4y2BaJgydF4y2Ba_{接下来的gydF4y2Ba}≈90hz)。gydF4y2Ba

优化远程gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba在90% H下记录N HSQC光谱gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO / D 10%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba选择性观察组氨酸(Hδ2和Hε1)-氮(Nδ1和Nε2)之间的远端相关性(gydF4y2Ba^2gydF4y2BaJgydF4y2Ba_{接下来的gydF4y2Ba}= 6 - 12hz)和gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN载波设置为200ppm。gydF4y2Ba

^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba获得了Pgm(692-768)*的C HSQC光谱gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与阿gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC载波设置为45 ppm和半延迟1.72 ms对应于agydF4y2Ba^1gydF4y2BaJgydF4y2Ba_HCgydF4y2Ba= 145 Hz，以便观察脂肪族质子。gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC HSQC光谱的半延迟为1.25 ms，对应于agydF4y2Ba^1gydF4y2BaJgydF4y2Ba_HCgydF4y2Ba为观察组氨酸Cδ2-Hδ2和Cε1-Hε1的交叉峰。在这种情况下gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC载体放置在130 ppm，光谱宽度为40 ppm。共获得256个数据点，每个点4个瞬态，在间接维上进行回波-反回波正交。gydF4y2Ba

主链(N, H, CO, Cα， Cβ， Hα， Hβ)和侧链(Cγ， Cδ， Cε， Hγ， Hδ， Hε)的配位采用标准三重共振实验[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba在…上gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN -gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba用C标记的蛋白质样品:CBCA (CO) NH、HNCACB、HNCA、HN (CO) CA、HNCO和HN (CA) CO的主链共振，以及H (CCO) NH、(H)C (CO) NH和(H)CCH-TOCSY来指定给定残基中的所有碳原子和质子原子。侧链分配使用冻干样品溶解在99.99%的D中完成gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO。gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN -和gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba在90% H下对样品进行c编辑的3D NOESY实验gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO / D 10%gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO或99.99% DgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO，混合时间为150 ms，以获得用于结构测定的核Overhauser效应串音(NOEs)。采用TOPSPIN 3.5软件(Bruker)对核磁共振数据进行采集和处理，并使用CcpNmr软件进行分析[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。除Lys740外，其余非脯氨酸氨基酸均有主链酰胺共振，其在序列中未检测到交叉峰gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN HSQC。我们能够分别确定组成Pgm(692-768)的96%和81%的主链和侧链碳原子，97%和84%的主链和侧链氢原子以及96%的氮原子。Pgm(685-768)*分配已存入BMRB (BMRB ID:gydF4y2Ba34527gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

氢-氘交换实验通过氢键来确定溶剂保护残留物的方法如下。将500 μ l 0.5 mM蛋白样品在质子化核磁共振溶液中冻干。样品以99.99% D的等体积重悬gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO并迅速转移到核磁共振管中。第一次gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba溶解后20分钟记录N HSQC，溶解后3天记录第二次HSQC，观察主酰胺质子氢-氘交换。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN RgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba松弛率和{gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH} -gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba在配备TCI冷冻探针的950 Avance III HD光谱仪上，在20°C下测量N异核NOE。的gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN R1和R2弛豫实验基于重新聚焦gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN HSQC松弛实验，并以交错伪三维方法记录，扫描间延迟为5 s。来测定RgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba在松弛延迟时间为10、50、100、200、300、400、600、800、1100、1500、2000、2500、3000 ms时采集松弛速率常数，共13组数据集。来测定RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba速率常数，13个数据集的延迟时间分别为16.96、33.92、50.88、67.84、84.8、101.76、118.72、135.68、152.64、169.60、220.48、271.36、323.24 ms。RgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba光谱记录为128 × 2126个复杂数据点。对于主干{gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH} -gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba在有和没有5 s质子饱和脉冲的情况下，记录了N异核NOE两种不同的光谱，以512 × 2048个复杂数据点交错的方式记录。RgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和RgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使用CcpNmr软件从峰值强度中测定速率和异核NOE值及其相关误差[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。用Lipari和Szabo的无模型形式分析松弛参数[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，使用TENSOR2程序[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]提取内部动态参数:阶参数SgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba描述运动幅度的;内相关时间τgydF4y2Ba_εgydF4y2Ba在ps-ns时间标度和R上gydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}反映μs-ms时间尺度上的交换贡献。由于各向异性模型没有改进，因此选择各向同性翻滚模型。gydF4y2Ba

核磁共振结构计算gydF4y2Ba

质子间距离约束由二维NOESY谱导出gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba嘈杂和三维gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN -和gydF4y2Ba^13gydF4y2BaC-NOESY)。Pgm(692-768)*结构使用CYANA 2.1以半自动迭代方式计算[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。从三维NOESY实验中手动提取残馀内和残馀间的NOEs。脊骨二面角约束(gydF4y2Ba_ΦgydF4y2Ba和gydF4y2Ba_ΨgydF4y2Ba角度)，使用化学位移分析软件TALOS+ [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。氢键约束通过氢-氘交换实验和α-螺旋和β-片的NOE交叉峰特征来确定。NOE峰值列表、二面角约束、氢键约束和化学位移赋值作为CYANA 2.1的输入。我们使用了标准的CYANA方案，即7个迭代周期的NOE分配和结构计算，然后进行最终的结构计算。在每个循环中，结构计算从200个随机形体开始，使用标准的CYANA模拟退火程序，每个形体有10,000个扭转角动力学步骤。第一次只用NOE约束的计算定义了畴的一般褶皱，并揭示了两个ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}协调模式。在最后的细化阶段，对Zn- s - γ (2.25-2.30 Å)、Zn- n- δ1 (2.35-2.40 Å)和Zn- nε 2 (2.35-2.40 Å)以及4个高度配位原子之间的其他键进行了距离约束，以保证Zn的四面体结构gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}协调几何。用PyMOL [gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。将结构沉积到wwPDB (PDB ID)中gydF4y2Ba6 zopgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

体外DNA结合测定gydF4y2Ba

配体的微分径向毛细管作用试验(DRaCALA)是一种简单快速的过滤结合试验，可以检测蛋白质与配体的相互作用[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。该方法包括无洗涤步骤，通过避免样品损失和限制复杂的解离，它代表了优于标准过滤器结合分析的优势。简单地说，蛋白质和标记配体的混合物被直接标记在硝化纤维素膜上。当与蛋白质结合时，配体保持在斑点的中心，而自由的未结合的配体通过毛细作用从中心移动到斑点的外围。我们进行了如下所述的DRaCALA测定[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。一个gydF4y2Ba^32gydF4y2Bap标记的80 bp双链底物携带来自表面抗原的IES 51A1835gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba对互补的顶部和底部链寡核苷酸进行退火后获得基因(Eurofin MWG Genomics，图2)。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba）.只有顶端的链在其5 '端使用gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP-γ ATP和T4多核苷酸激酶(新英格兰生物实验室)。退火是通过加热到95°C，然后缓慢冷却到室温进行的。将标记的dsDNA底物(终浓度为25 nM)与25 mM HEPES pH 7.5, 0.1 mg/ml BSA, 0.5 mM DTT和100 mM含nacl的缓冲液中混合，并在以下终浓度下过量纯化蛋白:GST (5 μM);n端GST融合PB(538-594)， Pgm(692-768)， PgmL2(540-614)和PgmL4a(856-931, 1至3 μM)， n端MBP融合PgmL1(463-539)， PgmL3a(471-550)或MBP- pgml5a(761-840, 400至900 nM);全长Pgm或其突变体衍生物(400 nM)。配合物被加载到硝化纤维素混合ECL膜上。空气干燥后，将膜暴露在磷成像仪屏幕上，使用台风扫描仪(GE Healthcare Life Sciences)对其进行扫描。gydF4y2Ba

使用纯化的CRDs进行电泳迁移率转移测定(EMSA)，方法如下[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，使用相同的gydF4y2Ba^32gydF4y2Bap标记的80 bp dsDNA底物如上所述，用于IES 51A1835和agydF4y2Ba^32gydF4y2Bap标记的70 bp dsDNA片段携带IES 51A4404的左端及其两侧的mac目标序列(图2)。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba）.在5%丙烯酰胺、0.5倍TBE凝胶中电泳后，将干燥的凝胶暴露在磷成象屏幕上(见上文)，可以看到游离DNA和蛋白质-DNA复合物。gydF4y2Ba

Pgm(692-768)*与DNA和组蛋白H3相互作用的核磁共振分析gydF4y2Ba

两个双链DNA底物(Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany)。gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)，用于核磁共振相互作用研究。它们是通过互补寡核苷酸的退火，加热到95°C，然后缓慢冷却到室温得到的。在一维中，在12 ~ 14 ppm存在微量质子，证实了适当的退火gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH-NMR谱图(图1)gydF4y2BaS12gydF4y2Ba）.这些DNA分子与Pgm(692-768)*之间的相互作用用gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba激励雕刻水抑制的噪声实验[j]gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，混合时间为200 ms，谱宽为18043 Hz, t2中有2202个复点，t1增量为688个。在Pgm(692-768)*上获得了等摩尔量DNA缺失和存在的光谱。gydF4y2Ba

滴定100 μMgydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-Pgm(692-768)*加入50 ~ 1000 μM的H3(1-19)组蛋白肽后gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^15gydF4y2BaN-HSQC在5 mM HEPES pH 6.8, 25 mM NaCl, 95% HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba0 / 5% dgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO在20°C时，在AVANCE Bruker 800 MHz光谱仪上进行24次扫描，11,160 Hz和2k复点，2513 Hz和240点gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH和gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba分别是N维。在傅立叶变换前应用π/2相移平方正弦钟窗函数gydF4y2Ba_DgydF4y2Ba)通过最小二乘拟合确定了自由和束缚态之间的化学位移变化(ΔδgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba})到非线性方程(改编自[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba):gydF4y2Ba

在ΔδgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}和ΔδgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}分别为给定共振的测量和最大化学位移微扰;和(H3)gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba和[P]gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba分别为H3(1-19)和Pgm(692-768)*浓度。gydF4y2Ba

最终滴定点(100 μM Pgm(692-768)*和1000 μM H3(1-19))观察相互作用对肽的影响。gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH -gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba在相同的缓冲液中，在pH 6.8下，对该样品和1000 μM的H3(1-19)样品进行H TOCSY实验。这些实验是在布鲁克800 MHz光谱仪上获得的，混合时间为60 ms，光谱宽度为11,160 Hz，扫描96次，2 k和512个复点gydF4y2Ba^1gydF4y2BaH和gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba分别是N维。gydF4y2Ba

草履虫gydF4y2Ba细胞培养，分离细胞核，提取组蛋白gydF4y2Ba

的自婚文化gydF4y2Ba草履虫tetraureliagydF4y2Ba株51new [gydF4y2Ba67gydF4y2Ba都是根据[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]。50%的细胞自交10小时后，离心收获细胞。得到的细胞颗粒在液氮中快速冷冻，并在- 80°C保存，然后进行核提取。用2体积裂解缓冲液(0.25 M蔗糖;10mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba;10 mM Tris pH 6.8;0.2% Nonidet P40;4X CalbioChem蛋白酶抑制剂鸡尾酒组I)。细胞用Potter-Elvehjem均质机裂解。将裂解液置于埃彭多夫管中，随后在摆动离心机中以1000 g离心2分钟，含核颗粒在5体积洗涤缓冲液(0.25 M蔗糖，10 mM MgCl)中洗涤3次gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba;10 mM Tris pH 6.8;4X CalbioChem蛋白酶抑制剂鸡尾酒组I)。根据[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]。在SDS凝胶上监测组蛋白制剂的纯度(图2)。gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)，用BCA法测定蛋白质浓度。从1-L细胞培养中提取约100 μg组蛋白。gydF4y2Ba

谷胱甘肽s -转移酶(GST)和麦芽糖结合蛋白(MBP)下拉测定gydF4y2Ba

GST-CRD和MBP-CRD融合物的表达方法如上所述。在缓冲液B中分别取400 μl含MBP/MBP- crd的裂解物或200 μl 1/10稀释GST/GST- crd的裂解物分别装于100 μl预平衡浆液谷胱甘肽sepharose beads 4B (GE healthcare)或淀粉树脂(New England Biolabs)上，在4℃下孵育1 h。用200 μl缓冲液b洗涤3次gydF4y2Ba草履虫gydF4y2Ba用100 μl缓冲液B稀释组蛋白，加入到珠上，在4°C的转轮上孵育过夜。由于缓冲液B含有500 mM NaCl，我们可以排除任何观察到的组蛋白/CRD相互作用是通过DNA结合间接介导的，因为，如NMR和DRaCALA实验所示(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，在低至100 mM NaCl的存在下，Pgm CRD与DNA之间没有检测到相互作用。孵育后，用200 μl缓冲液B洗涤4次(最后一次在轮上清洗10 min, 4°C)。在加入25 μL 4X Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)中添加1.4 M β-巯基乙醇后，将小球(~ 50 μL)煮沸10 min。gydF4y2Ba

酶联免疫吸附试验(ELISA)gydF4y2Ba

每孔用200 μL缓冲液C (25 mM Tris pH 7.4)洗涤3次;150mm NaCl;0.1% BSA;0.05%吐温20)。将c端生物素化的H3肽(4 μM in 100 μL Wash Buffer)加入孔中，使孔表面饱和，室温孵育1 h。用200 μL缓冲液C洗涤3次，每孔加入纯化的MBP-CRD或GST-CRD融合蛋白100 μL (10 ~ ~100 nM)。在4°C下孵育过夜，然后如上所述洗涤以去除未结合的蛋白质。单克隆抗mbp - hrp抗体100 μL (neb# E8038S;每孔加入稀释过的1/ 10000缓冲液C)，室温孵育30分钟，洗涤3次。过氧化物酶活性用tetramethylbenzidine (1-Step™Ultra TMB-ELISA, ThermoScientific)测定，使用TECAN Infinite 200 pro读取器，波长450 nm。gydF4y2Ba

微波等离子体原子发射光谱gydF4y2Ba

采用微波等离子体原子发射光谱法测定了gst -熔融Pgm(692-768)及其携带H701S、H738S和C712S突变的突变体的相对锌络合量。用谷胱甘肽-sepharose beads从细菌裂解液中提取蛋白质，并用如上所述的裂解缓冲液洗涤。然后用2mm EDTA洗涤珠子以去除多余的非络合锌。然后用硝酸处理以溶解谷胱甘肽-sepharose小球。采用Agilent 4200 MP-AES光谱仪对溶液进行微波等离子体原子发射光谱分析。通过与标准曲线的比较确定锌浓度，并根据初始蛋白质浓度进行归一化。gydF4y2Ba

Pgm(685-768)*分配已存入BMRB (BMBR ID:gydF4y2Ba34527gydF4y2Ba）.将结构沉积到wwPDB (PDB ID)中gydF4y2Ba6 zopgydF4y2Ba）.本研究中使用和分析的所有数据集均可应相应作者的合理要求获得。gydF4y2Ba

te:gydF4y2Ba

转座的元素gydF4y2Ba

行动:gydF4y2Ba

末端反向重复gydF4y2Ba

t .倪gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

Trichoplusia倪gydF4y2Ba

铅:gydF4y2Ba

PiggyBac转座酶gydF4y2Bat .倪gydF4y2Ba

PBLE:gydF4y2Ba

PiggyBacgydF4y2Ba例如元素gydF4y2Ba

PGBD:gydF4y2Ba

PiggyBacgydF4y2Ba转座的element-derivedgydF4y2Ba

麦克风:gydF4y2Ba

微核gydF4y2Ba

麦克:gydF4y2Ba

大核gydF4y2Ba

IESs:gydF4y2Ba

内部消除序列gydF4y2Ba

的Pgm:gydF4y2Ba

PiggyMacgydF4y2Ba

PgmL:gydF4y2Ba

PiggyMac-likegydF4y2Ba

CRD:gydF4y2Ba

Cysteine-rich域gydF4y2Ba

核磁共振:gydF4y2Ba

核磁共振gydF4y2Ba

我们要感谢ssambastien Thomine与我们分享他在微波等离子体原子发射光谱方面的专业知识。我们感谢Cindy Mathon和Pascaline Tirand出色的技术援助，以及Loïc Escoriza和Coralie Zangarelli在处理过程中的帮助gydF4y2Ba草履虫gydF4y2Ba文化。非常感谢Emeline Dubois和b termier和Duharcourt实验室的所有成员激发了讨论，并感谢Joël Acker, Olivier Arnaiz和Linda Sperling对手稿的批判性阅读。gydF4y2Ba

这项工作得到了法国国家科学研究中心(CNRS)[硕士研究生的校内资助]和法国国家研究机构[资助ANR-14-CE10-0005给E.G.和m.b.s以及ANR-18-CE12-005给m.b.s]的支持。S.M.由Institut de Chimie des Substances Naturelles授予。感谢IR-RMN-THC Fr3050 CNRS为开展本研究提供的资金支持。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Marc gusamine, Luiza Bessa和ssamine Moriau对这项工作做出了同样的贡献。gydF4y2Ba

作者及单位gydF4y2Ba

1. 法国巴黎萨克莱大学，CEA, CNRS，细胞整合生物学研究所(I2BC)， 1 Avenue de la Terrasse, 91198, gisur Yvette CedexgydF4y2Ba

   马克·古斯曼，娜塔莉·马西，朱利安·比舍尔和米雷耶·巴斯曼gydF4y2Ba

2. 巴黎萨克雷大学，法国科学研究中心，自然物质化学研究所，UPR 2301, 1 Avenue de la Terrasse, 91198, gisur Yvette CedexgydF4y2Ba

   Luiza Bessa, ssamverine Moriau, Ewen Lescop, franois Bontems, Eric Guittet和Nelly MorelletgydF4y2Ba

3. 目前地址:格勒诺布尔阿尔卑斯大学，法国国家科学研究中心，CEA，结构生物研究所(IBS)，格勒诺布尔烈士大道71号，38000，法国gydF4y2Ba

   Luiza BessagydF4y2Ba

4. 生殖与植物遗传变异研究UMR 5667，里昂高等师范学院，46意大利遗传变异研究中心，69364，里昂Cedex 07gydF4y2Ba

   娜塔莉数学gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

概念化，调查，可视化，写作-原稿。LB:概念化，调查，写作-原稿。SM:概念化，调查。EL:概念化，调查。FB:概念化，调查。纳米:调查。例如:监督、概念化、资金获取。JB:监督、概念化、调查、形象化。硕士:监督，概念化，调查，可视化，写作-原稿，资金获取。NM:监督，概念化，调查，可视化，写作-原稿。 All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba麦勒BetermiergydF4y2Ba或gydF4y2Ba耐莉MorelletgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

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