在一种新型的连续生物电化学系统中，氧化还原电位的控制导致了显著的代谢和能量响应pasteurianum梭状芽胞杆菌靠甘油生长

背景

电发酵是一种新兴的生物过程强化工具。在使细胞能够直接与电极表面交换电子的生物过程中，其益处尤其值得期待。研究还表明，在BES中使用电能可以通过间接的二次效应提高生物过程的性能。在这种情况下，电被用来改变工艺参数并间接激活所需的路径。在许多生物过程中，氧化还原电位(ORP)是一个重要的过程参数。而c . pasteurianum甘油的发酵已被证明受到显著的电化学影响，其潜在的机制尚不清楚。为此，我们开发了一套连续培养中ORP的电化学控制系统，定量研究ORP改变对细胞生长的影响c . pasteurianum通过代谢通量分析(MFA)、靶向代谢组学、敏感性和调控分析。

结果

在- 462 mV至- 250 mV的ORP范围内，该算法能够在所需的设定点和0.1 h的固定稀释率下实现ORP的稳定阳极电化学控制⁻¹。ORP从- 462 mV增加到- 250 mV, 1,3-丙二醇的摩尔产率提高了57%。MFA认为c . pasteurianum除了底物水平磷酸化外，还具有并利用细胞能量产生机制。敏感性分析表明，ORP对丙酮酸-铁氧化还蛋白-氧化还原酶反应的影响最大。规律分析表明，这种影响主要是直接的。因此，观察到的代谢变化主要是由电化学生产氧气时酶的直接抑制引起的。在ORP水平升高时，对丙酮酸-甲酸-裂解酶也观察到类似的效果。

结论

结果表明，电化学ORP变化是一种合适的工具来控制代谢c . pasteurianum提高了1,3-丙二醇连续培养的产率。该方法也可用于进一步的厌氧或缺氧生物过程的应用。然而，为了最大限度地提高该技术的效率，了解ORP变化背后的化学原理以及微生物系统如何通过传递或直接影响对其作出反应是至关重要的。

电生物技术是生物技术与电化学相结合的一门极具发展前景的技术。在这种情况下，在生物电化学系统(BES)中，细胞能够直接收集电衍生电子的生物过程中，预计会有特别高的潜力[1]。但实验也表明，在BES中使用电能可以提高发酵过程的性能，即使细胞不能直接与电极材料交换电子[2]。然后用电来改变工艺参数，间接激活所需的路径。在这里，最重要的工艺参数是氧化还原电位(ORP)，在培养过程中可以很容易地通过氧化还原探针(通常使用Ag/AgCl电极)在线跟踪。众所周知，ORP有时也被称为E_h在文学中[3.]，是许多生物技术过程中的关键参数之一。此外，它已被证明可以影响不同代谢水平的微生物。这与基因表达有关[4，5还包括信号感知、信号转导和调节[6，7]。

改变和控制ORP的不同策略已被发展和应用[8]。数字1给出了不同方法的概述。一种常用的方法是在发酵培养基中加入高氧化或还原剂(图2)。1A)，如铁氰化物[9]、硫化物[10]，或氧化还原介质[11，12]。虽然在大多数情况下，这种策略可以充分控制ORP，但添加化学品也有一些缺点。一个主要的缺点是添加这些(通常是有毒的)化合物，其数量不可忽略，会改变发酵培养基的组成。在这里，可能会出现研究结果主要反映的不是代谢对ORP参数的反应，而是细胞代谢对添加的化学物质的反应。因此，控制ORP的一个更好的替代方案是通过喷射气体(图2)。1B)，如氧、氢、氮或氦[13，14，15]。为了控制气体溶解度和相应的ORP，搅拌[16，17]或曝气率[18]作为控制器输入。使用气体的优点是它们通常具有低溶解度，(大多数)对细胞无毒，并且不会积聚在反应系统的液相中。然而，带有气体喷射的ORP控制的一个实际缺点是控制算法难以实现。此外，理想的设定值更难实现和维持，特别是当相关气体也被微生物消耗或产生时，发酵液的物理化学性质在培养过程中发生变化。此外，放气会干扰培养过程，导致CO的析出₂或者其他挥发性成分。

控制发酵过程中ORP的第三种选择是在BES中使用电能(图2)。1c).在文献中，能量输入用于ORP改变的例子很少。到目前为止，几乎所有进行的研究都使用阴极电流来降低或控制厌氧或微氧过程中的ORP [19，20.，21，22，23]。只有两篇文章在好氧或微氧条件下处理ORP [24，25]。所引用的研究都没有将ORP在连续培养中以固定稀释率控制在所需水平，这对动力学和生理学研究具有决定性的好处。因此，在本研究中，我们的目标是借助先前开发的“一体式”电极开发电化学ORP控制[26]在连续的BES中。pasteurianum梭状芽胞杆菌是工业生产有价化学品1,3-丙二醇(PDO)和正丁醇的有希望的候选物[27，28]。之前的研究已经证明了这一点c . pasteurianum不能被认为是电活性的，但它的代谢仍然受到电能应用的影响[29，30.]。根据条件的不同，BES培养有利于PDO或正丁醇的产生，但其机制尚不清楚。因此，这项工作旨在获得更多的知识，潜在的代谢变化与发达的连续系统。为了获得定量和可靠的见解，使用了靶向代谢组学分析和代谢通量分析(MFA)。然后使用代谢控制分析(MCA)来确定潜在的控制模式，并通过灵敏度和调节分析来定量研究ORP变化的影响。

电化学ORP控制的实现

连续培养时，细胞在不通电的情况下初始生长至稳态。然后，第一次尝试使用- 100 mA的恒定阴极电流和一个简单的开/关控制器来控制ORP。在这里，第一个发现是ORP可以，与补料分批发酵的结果相反[29]，在0.1 h的固定稀释率下不会进一步减少⁻¹在BES。即使电流(和电化学产氢速率)增加到−1.0 A，情况仍然如此。此外，即使系统在持续使用低电流(阴极或阳极都进行了测试)的情况下运行一夜，也会观察到细胞的冲洗。在这里，假设带电微量元素的电化学吸附可能阻止了细胞在设定的稀释率下达到所需的生长速率。

下一步，为了避免在后续实验中出现细胞冲洗，我们采用脉冲控制算法对ORP进行控制。控制器是一个简单的手动调整pi控制器(通过Labview实现)，使用ORP在线值作为输入变量，应用电流作为输出。脉冲时间为100 ms，然后是100 ms，不用电。结果表明，即使使用恒电位器的最大电流(1.0 A)，初始持续时间100 ms也不能充分增加ORP。在这种情况下，当3 h后ORP没有增加时，手动逐步增加脉冲时间100 ms。不通电的时间保持在100毫秒不变。这种策略使得在0.1 h的稀释率下将ORP维持在所需的设定点成为可能⁻¹(+−10 mV)。总体而言，稀释率为0.1 h时，有四种不同的ORP水平⁻¹，而第一个稳定状态是没有应用电能。测试条件下的在线ORP值，包括控制器的最终输出值，如图所示。2。在每个稳定状态下，假设至少经过五次水力滞留(并通过不变的废气成分进行验证)，进行快速采样和过滤以进行代谢组学分析，并以15分钟的间隔取4个样品用于分析细胞外代谢物。根据后者，计算出利率、收益率和余额。然后将确定的比率和方差用于MFA，随后用于敏感性和调节分析。

不同ORP水平对产物形成和产率的影响

表格1显示各稳定状态下细胞外代谢物的浓度。可以看到，稳态底物浓度随着ORP的增加而持续增加。因此，总体底物摄取(每L培养体积)减少。生物量和主要产物PDO和正丁醇的绝对稳态浓度也有所下降。综上所述，宏观数据表明ORP强烈影响细胞生长和细胞代谢。c . pasteurianum以更正的ORP转化更少的底物，细胞浓度急剧下降。这可能主要是由于电极在阳极模式下运行以控制ORP时产生的氧气。在- 416毫伏时，已在废气中检测到4%的氧。在−337 mV时为6%。在- 250 mV时，由于废气流量低于所用MS所需的最小值(5 mL min)，因此无法测量产气量⁻¹)。这里是估算和平衡的CO₂和H₂得到了计算碳和电子回收率的产率。一般来说，氧气会产生负面影响梭状芽胞杆菌的增长[31]，而氧诱导的应激似乎是产物和细胞浓度总体下降的主要原因。

表格2给出了连续发酵实验数据的计算摩尔产率和回收率。虽然整体底物消耗和产物生成一般随ORP的增加而下降，但某些产物的摩尔产率可以通过ORP的改变而提高。在这里，PDO的产率可以从149 mmol mol提高⁻¹(−462 mV)至最大234 mmol mol⁻¹(−250 mV)，相当于57%的改进。ORP越高，乳酸产率和浓度越高，丁醇产率越低。所得数据的碳和电子回收率通常不令人满意。即使在不用电的情况下(- 462 mV)，碳回收率也只有89%。在这里，一种解释可能是低生长速率给细胞施加压力，并触发了分析方法无法跟踪的产物的形成。但在HPLC图谱中未发现未知峰。

代谢通量分析和代谢组学数据

虽然所进行的实验的产品产量和最终浓度是评估整体工艺性能的重要参数，但这些值只能暗示改变的工艺条件如何影响细胞的不同途径。在这里，MFA生成的数据和随后的监管分析更有帮助。此外，通过假设的反应网络的数学表示和测量速率的实现，MFA允许一致性的统计测试和粗测量误差的检测。用于MFA的生化网络的基础是在先前出版物的框架内开发的[32]。在引用的工作中，原始网络中没有考虑ATP，因为预计它将被直接消耗用于增长。因为，根据以前的结果[29]，了解更多的能量代谢是很有意义的c . pasteurianum，通过底物水平磷酸化产生ATP，以及通过生物量形成消耗。每摩尔ATP的生物量产率取自文献[33]。此外，整个模型是电荷和质量平衡的。首先，MFA结果表明，测量速率和最初假设的反应网络在统计上不一致。这是由测试函数的值得出的结论h，对于网络，其产生的值应为< 7.815(置信区间为95%)，其中具有冗余度三。无法确定包含严重系统误差的具体比率。尽管如此，可以得出结论，细胞内的质子不能被假设的反应以测量的速率充分平衡。质子在网络中的主要吸收是氢的形成₂还原的铁氧还蛋白和质子。主要来源是甘油转化为丙酮酸和酸的生产。在下面，质子缺乏问题的可能原因被更详细地阐明和处理。

在文献中，人们理所当然地认为有机酸主要以膜渗透性、质子化和不带电的形式被动排泄，这种形式依赖于ph。这也反映在大多数代谢模型的转运反应中。尽管如此，这种长期存在的范式目前仍在争论中，因为它已被证明与许多实验结果相矛盾。特别是，有研究表明，大多数代谢模型低估了代谢物分泌的多样性，模拟结果与经验外代谢组学研究的结果不一致[34]。此外，在大多数这些研究中，即使细胞裂解引起的泄漏被认为是外代谢组学研究的一个错误来源，也不能用代谢模型解释大量的细胞外量化代谢物[35]。这指出了未来补充代谢模型的必要性，但未知的转运反应和机制。

在此文中，为c . pasteurianum细胞内pH值预计比细胞外环境更碱性。基于Riebeling等人的数据[36]，假设外部pH为6.0时，细胞内pH为6.5。这导致超过98%的主要有机酸(丁酸、乙酸、乳酸、甲酸)以解离形式存在于细胞内。如果这些去质子化的酸不能被细胞排出体外，这些代谢物就会迅速积累，严重抑制细胞生长，使细胞无法达到稳定状态，甚至在连续培养中导致细胞冲洗。因此，预计c . pasteurianum可以分泌两种形式的代谢物，质子化也可以去质子化。代谢模型相应调整:根据细胞内近似pH为6.5和pk计算去质子化程度_一个对应酸的值。此外，每种酸的质子化/去质子化形式在方程式中仅由一种代谢物表示，这两种代谢物都预期由细胞排出。这使得细胞能够在酸生产的帮助下平衡氢化酶产生的质子缺乏的重要部分。尽管如此，更新网络的MFA结果，包括去质子酸的分泌，仍然没有提供统计上令人满意的结果。质子缺乏症仍然很严重。

随后，atp酶被认为是通过使质子流入细胞来实现质子平衡的进一步选择。F₁F₀的ATP合成酶肽c . pasteurianum很好地描述了[37]，但只有少数研究阐明了它的生理作用。从这些研究中得出结论，ATP酶复合物仅表现出较低的ATP合酶活性，并受到高ATP水平的抑制[38，39]。同时发现细胞内pH值c . pasteurianum比周围环境碱性更强36]，这导致了一种假设，即ATP酶主要利用ATP作为能量驱动来促进质子转出细胞以维持更碱性的pH值。相反，也可能是氢化酶在细胞内建立更碱性的pH值，然后ATP酶可以用于ATP合成。据报道，其他微生物中也存在类似的节能系统[40]。检查这种可能性c . pasteurianum，在代谢模型中加入atp酶的反应方程，再次进行MFA。这一次，当允许质子内流和ATP酶产生ATP时，对假设代谢模型的数据一致性的统计检验在所有测试条件下都是令人满意的。最终模型得到的MFA结果如图所示。3.。所有计算值及最终模型亦可于网上资料库[41]。

在这种情况下，必须指出的是，细胞内pH值，细胞生长所需的ATP，以及每质子化学计量产生的ATP的量(Y_{ATP / H +}= 0.25 mol mol⁻¹)只是从文献中估计的。这就导致了一种情况，在-250 mV的情况下，反应，这代表ATP维持的需求(r₁₅)，在计算中略微产生负值(人工生成ATP)。因此，最有可能的是，实际的ATP增长需求与模型中使用的值不同，并且在测试的场景中有所不同。此外，也可能是低估了atp酶的效率，或者存在额外的atp生成机制c . pasteurianum。因此，在这一关系中，需要进一步的实验验证ATPase效率和更详细的生物质配方方程改进的代谢模型。尽管如此，建议的ATP生成机制(由氢化酶建立的质子缺乏间接驱动)解释了如何产生ATPc . pasteurianum即使只形成少量的酸，也能产生足够的ATP。

代谢数据分析如图所示。4。每个样本的准确测量值也可在在线数据存储库中获得[41]。这里，值得注意的是，NADH/NAD比值在不同测试的ORP水平下没有统计学上的显著差异，表明氧化还原稳态。ORP越阳性，AEC越高。这可能是由于过量产生的氧气抑制了生长。胞内丙酮酸浓度随ORP升高而显著升高。在这里，通过从- 337 mv到- 250 mv的转变，细胞显示丙酮酸浓度增加了五倍。由于乙酰辅酶a浓度在ORP范围内降低，丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)的反应速率也随之降低;r₅在无花果。3.)和丙酮酸-甲酸裂解酶(PFL;r₆在无花果。3.)下降，丙酮酸的积累已经暗示在丙酮酸结的抑制。众所周知，PFOR能被氧抑制，可能是因为所需的辅助因子铁氧还蛋白的铁硫簇在氧化后失活[42，43]。但是，ORP变化究竟如何影响细胞内反应速率，以及这些变化是如何实现的(通过介导或直接影响)，将通过随后的敏感性和调节分析进行更系统和更详细的评估。

敏感性和调节分析

首先，计算细胞内反应的偏差指数r₁来r₁₃以响应三个ORP转换。结果如图所示。5。在这里，必须注意的是，这些值被归一化为新的稳态。因此，对于某些速率的偏差指数与一个非常小的绝对反应速率-特别是r₁₁和r₁₃-显示非常极端的负值。然而，敏感性分析表明，一些反应率对所有转变的反应都具有更正的ORP，且趋势相同:r₄(乳酸形成)和r₇(乙醇生成)增加r₅(PFOR)和r₉(crotonyl-CoA形成)下降。巴豆酰辅酶a (r₁₀来r₁₃)、甲酸酯和醋酸酯地层(r₆和r₈)，并向上反应丙酮酸(r₁来r_3.)呈现出喜忧参半的局面。有趣的是，底物吸收速率(r₁)几乎不受ORP水平变化的影响。

敏感性分析定量地显示了ORP变化对反应速率的影响。然而，它并没有提供任何关于潜在控制模式的信息，也没有提供观察到的反应速率变化是如何实现的。因此，进行了调节分析。为此，首先，将系统简化为块，并重新定义为仅涵盖实验测量中间体(G3P，丙酮酸，乙酰辅酶a和丁基辅酶a)的反应。系统如图1所示。6。对于这些反应，弹性是根据细胞内浓度测量和文献中的动力学数据估计的(见附加文件)2:表S2.1)。结合从MFA得到的稳态通量，可以用符号MCA计算浓度和通量控制系数。补充了所有四种确定的控制模式的数据(附加文件2:表S2.2)。(部分)积分响应形式的调节分析结果列于表中3.，如图所示。7。表中的每一行3.在最后一列中列出部分积分响应及其总和(积分响应)。因此，这些行表明了系统组件(反应块或中间体)受到各自ORP变化的积极或消极影响的程度。柱状图显示通过哪个反应块实现了观察到的变化。例如，对于第一个ORP更改(Δq₁)从−462 mV到−416 mV，反应区J₀表现出轻微的积极反应，如部分积分反应(R \({}{} _{{\δq} _ {1}} ^ {{J} _ {0}}) \)0.07。这里，所有的部分积分响应，除了反应块J₀（\(={}{}^{{ 我J} _ {0}} {R} _{{\δq} _ {1}} ^ {{J} _ {0}} \))，都是零。因此，所观察到的效果不是通过任何反应阻滞而传递的J₀它具有直接的性质。与此相反，J₆表现出积极的反应(R \({}{} _{{\δq} _ {1}} ^ {{J} _ {6}} = 0.73 \))，但反应块本身的部分积分响应(\ ({} ^ {{J} _{6}}我{R} _{{\δq} _ {1}} ^ {{J} _ {6}} \))是消极的。因此，ORP对反应块本身产生了负面影响，但观察到的整体积极反应是通过其他反应块传递的。正面影响最强的是阻滞J₇， ORP从- 462 mV变化到- 416 mV时，稳态通量没有增加。同时，积极的回应J₆是通过J₀，J₄和J₅。数字7说明所描述的反应，并区分积极和消极的反应。为R \({}{} _{{\δq} _ {1}} ^ {{J} _ {0}} \)只画了一条细绿线，它只连接到J₀因为只有一个稍微积极的回应来自J₀本身。为R \({}{} _{{\δq} _ {1}} ^ {{J} _ {6}} \)综合反应的积极和消极部分被显示出来，并通过反应块传递这些信息。注意图中链接的厚度。7指(部分)积分响应的绝对值。

这些数据使我们对微生物系统对ORP变化的反应有了有趣而又高度复杂的见解。第一次跃迁(从- 462 mV到- 416 mV, a)7)，系统的积极反应超过了不利影响。在这里，综合反应所反映的最显著的总体积极影响是J₄，J₆G3P和乙酰辅酶a。而激活J₄主要是直接的，J₆利润，如前所述，大部分来自于增长J₀(系统涌入)和J₇(乙酰辅酶a转化为丁基辅酶a)，当参数从- 462 mV变化到- 416 mV时，其几乎没有变化。此外，PFL (J₄对……有积极的影响J₆。G3P浓度几乎完全受益于系统内流的略微增加。乙酰辅酶a的浓度受到反应阻滞的积极影响J₇，与参考状态相比，它没有显示出增加的通量。因此,通量J₅和J₆并没有增加到足以补偿乙酰辅酶a浓度的局部增加引起的J₄。对于第一个ORP从- 462 mV到- 416 mV的变化，最高的负响应可见J₂，J₉和丙酮酸。而对乳酸生成的负面影响(J₂)完全可以用PFL的通量增加(J₄）的负面反应J₉似乎是直接性质的。效应器变化对丙酮酸的负面影响也可以主要解释为J₄。

外部效应的第二个变化(从- 416 mV到- 337 mV;b)图中。7)对系统整体有负面影响。在这里,J₆表现出最高的负面反应。这种反应可以直接传播，也可以通过J_3.(PFOR)，它被还原，和J₅(乙醇形成)，这是增加的。在这方面，值得注意的是，通量的减少J_3.对几个系统组成部分施加强烈影响几乎只发生在直接反应中。只有一小部分(11%)可以用过渡后系统流入减少来解释。最高的总体积极反应(如总综合反应所示)R \({}{} _{\δq} ^ {} \))可以在J₂和J₉。在这里,J₂(乳酸生成)增加主要是由于J_3.(PFOR)和J₉直接被激活，并受到丁醇产量减少的积极影响(J₈)。观察到丙酮酸和G3P浓度的增加(如图2所示)。4)，主要是由于J_3.和J₁，而乙酰辅酶a则主要受到J_3.。

对于图中第三个ORP变化(从- 337 mV到- 250 mV, c)。6)，系统的负面反应显然占主导地位。只针对通量J₂(乳酸形成)和J₅(乙醇生成)显示出总体积极的反应。这一次，积极的回应J₂再次主要是通过进一步减少J_3.。J₅从直接活化和反应块中大量减少通量中获利J₇。对最高的负面反应进行了计算J₄(PFL),J₆(醋酸酯形成)和J₉(丁酸盐的形成)。在最终ORP变化期间，PFL与PFOR相同，仅受外部效应器变化的直接影响。一般来说，PFOR从事将外部效应物的负面影响传递给其下游的所有反应和中间体。的递减值J_3.是观察到的丙酮酸浓度增加和乳酸生成增加的主要原因(J₂)。

总的来说，结合MFA结果，调控分析描绘了ORP改变的代谢反应的连贯画面。虽然应用的方法受到文献中动力学数据的弹性推导和简单的单底物Michaelis-Menten动力学假设的阻碍，但它仍然能够从系统水平的角度对触发的代谢现象以及它们是如何实现的进行可靠的半定量阐明。从ORP参数第一次变化(- 462 mV到- 416 mV)的分析可以看出，ORP的适度增加刺激了c . pasteurianum导致底物向丙酮酸的流入增加。在这里，PFOR的反应几乎保持不变，PFL捕获额外的流向丙酮酸的通量。为了维持氧化还原平衡，细胞产生更多的乙醇。以下ORP变化(从- 416 mV到- 337 mV)导致PFOR的剧烈抑制，可能是由较高的氧活性引起的，由较高的施加电流驱动。这里，细胞再次利用PFL反应来补偿较低的PFOR活性。此外，在丙酮酸的上游产生更多的乳酸作为反应。在ORP最高水平(−250 mV)和系统中氧活性最高时，PFOR和PFL均受到直接抑制。这两种酶都携带铁硫簇，并受到分子氧的抑制[44，45]。然而，有趣的是，首先在最高效应水平观察到PFL抑制，而PFOR在较低水平已经受到负面影响。作为对丙酮酸转化为乙酰辅酶a的强烈阻碍的反应，细胞将更多分子转向乳酸。尽管在最后一次ORP转移中乙醇产率仍然增加，但调控分析表明，PFOR反应速率的降低对乙醇的形成有很强的负面影响。此外，尽管在上一次ORP参数变化中乳酸产量增加了一倍以上，但细胞显然无法再氧化所需数量的NADH，这些NADH是在甘油转化和生物质形成过程中产生的。因此，外部效应氧直接抑制丙酮酸转化为乙酰辅酶a (PFOR和PFL)间接导致PDO产率的增加。所开发的电化学ORP控制算法可以控制该效应体在系统中的水平。

在本工作中，我们成功地开发了一种在连续培养过程中电化学阳极ORP控制系统c . pasteurianum。在0.1 h的稀释率下，ORP从- 462 mv逐步增加到- 250 mv, PDO产率增加了57%⁻¹。ORP的增加是由电化学产氧驱动的，这一方面直接负向影响丙酮酸转化为乙酰辅酶a，另一方面正向影响丙酮酸上游化合物的产率。因此，所开发的技术也可能对其他厌氧或微氧工艺感兴趣。然而，由于人工ORP的增加也导致了生物量和产品浓度的降低，因此在未来应用这种方法时，必须在产品产量和体积生产率之间找到适当的平衡。进一步，优化工艺，专门为c . pasteurianum，更详细的数据在活的有机体内需要PFOR和PFL的抑制动力学。此外，不从文献中的动力学数据和代谢物浓度中直接得到弹性，而直接从实验中得到相关控制模式的改进数据将是有益的。这可以通过平行短期扰动(类似于Tröndle等)的实验来实现。[46])，或者在稳定状态下测定酶的浓度，这样就可以用林对数法计算系数[47]。然而，第一种方法(短期扰动实验)将需要进一步改进电化学orp控制在更动态的条件下。

微生物和培养基

野生型菌株的电致突变体c . pasteurianum本研究采用DSM 525。菌株由Schmitz等人生成。[32]，并命名为c . pasteurianumR525。两种培养基用于预培养生长和发酵:强化梭状菌培养基(RCM)和Biebl改良培养基[48]。菌种维持和预培养培养基准备遵循Sabra等人描述的相同程序。[49]。首先，从冷冻瓶中取出1ml的培养物在RCM培养基中培养24 h，然后将1.5 mL的培养物转移到第二个预培养厌氧瓶中，瓶中含有50ml的Biebl培养基和5g L⁻¹酵母提取物。然后用第二次预培养接种主培养。主培养基和饲喂液中均含有比伯培养基，但用25µg L酵母浸膏代替⁻¹生物素。主培养中甘油的初始浓度为25 g L⁻¹。饲料培养基含36 g L⁻¹甘油。FeSO₄H·7₂0、生物素和l -半胱氨酸分别配制，经无菌过滤后加入主培养基和进料液中。进料介质在10l罐中进行高压灭菌，用氮气吹扫，同时被动冷却至室温以建立厌氧条件。厌氧条件的验证是通过添加染料蓝靛素。发酵和饲料培养基也含有1 g L⁻¹d -木糖作为计算由自动快速过滤获得的细胞内化合物的细胞特异性浓度的内标准。定期在光学显微镜下检查培养物和喂养液是否有污染。

栽培制度和条件

连续电辅助培养的发酵在生物工程的玻璃生物反应器中进行，该反应器与自行开发的快速过滤系统相结合[50]。这里，反应器的工作体积为1.4 l，这个体积是尽可能小的体积，以确保所使用的“一体式”电极的镀铂泰坦网电极始终被液体覆盖。准备工作(探针校准、灭菌和建立厌氧条件)和工艺条件(pH、温度、搅拌速率)与之前的工作相同[29]。废气成分(H₂、有限公司₂N₂阿,₂)和体积流通过Balzer Omnistart GSD 300质谱仪与Bronkhorst(荷兰)的高精度EL-FLOW质量流量计相结合进行测量。初始批处理阶段为17小时后开始加料。假设在至少5次液压滞留时间后达到稳态条件，并通过不变的废气信号进行验证。然后，在每个测试条件下，每隔15分钟取4个样本用于定量细胞外代谢物浓度和生物量。在第四次采样后，进行快速过滤以获得代谢组学数据。在连续培养中测试了不同的ORP设定点。在实验过程中，电流控制ORP的控制算法还有待进一步开发和优化。因此，ORP控件被认为是结果部分的一部分。OPR控制算法由pid函数通过美国国家仪器公司的Labview软件实现。该控制算法采用在线ORP值作为输入参数控制Gamry Interface 1000电位器。电脉冲的施加电流和持续时间被定义为输出参数。

细胞生长和细胞干重的测定

通过测量外径来追踪细胞生长₆₀₀。细胞干重(c_x2 mL培养液，在70℃下干燥24小时，用重量法测定3份细胞微球。13000 rpm离心5分钟得到微球。

细胞外化合物的定量

甘油、1,3-丙二醇(PDO)、乳酸、甲酸、乙酸、乙醇、丁酸、丙酮酸、琥珀酸和正丁醇采用英国Kontron公司的高效液相色谱系统进行定量。在Aminex HPX-87H柱上分离，60℃，流速0.6 mL min⁻¹5mm H₂所以₄作为移动阶段。为此，细胞以13000 rpm离心5分钟，上清通过0.2µm PVDF过滤器过滤。另外，使用Megazyme公司(爱尔兰)的市售酶“乙醇- kit K-ETOH”验证乙醇浓度。

有针对性的代谢组学

对于代谢组学研究，使用了自动快速过滤系统，da Luz等人对此进行了详细描述。[51]。确切的采样程序、提取程序和分析方法与我们之前的工作相同[29]。简而言之，提取方法和方案借鉴并改进了Lu等人的方法和方案。52]，过滤液用液氮淬火，两轮提取后冷冻干燥。然后将样品重悬在超纯水中，用于后续的绝对LC-MS/MS和酶定量。在每个稳态条件下，分别进行四次过滤和提取。每个样品一式两份测量。测定甘油醛-3-磷酸(G3P)、NAD、NADH、ATP、ADP、AMP、丙酮酸、乙酰辅酶a和丁基辅酶a的浓度。

计算和统计检验

从底物的细胞外稳态测量得到的浓度数据(c_年代)及产品(c_p)来计算细胞对底物的特异性吸收速率(问_年代)及产品形成(问_p)，根据下式:

D是h的稀释率⁻¹和c \({} _{年代}\)入口流底物浓度，单位为g L⁻¹。然后用细胞特异性速率计算碳和还原当量平衡。碳(C_R)和宏观电子(NADH_R)的回收率由下式得到[30.，53]：

一氧化碳的废气率₂（问_二氧化碳)在液相中进行了吸收校正，根据Zeng [54]。测得的H的量₂在废气流中也对电化学产生的气体进行了校正。腺苷酸能量电荷(原子能委员会)由测量的细胞内AMP的摩尔浓度(c_AMP)， adp (c_ADP)及ATP (c_{三磷酸腺苷})由下式[55]：

采用单因素方差分析(ANOVA)检验获得的代谢组学数据的统计学意义，然后进行事后Tukey检验。使用Software Origin Version 2020 (OriginLab Corp.， USA)进行分析。在一个稳态条件下，每种代谢物可获得4个数据点。显著性水平(α)取5%。

代谢通量分析

为了方便和简单地修改和测试不同的生化网络，使用Matlab插件进行MFACellNetAnalyzer(2017.3版本;［56])。最后的生化网络在附加文件中描述1而MFA的结果则载于网上资料库[41]。对于费率估算方差加权最小二乘回归，采用稳态时四次独立测量(间隔三次15分钟)的方差。对于废气值和生物质生成反应速率，假设标准差为5%。用于MFA的最终代谢网络具有冗余度三。这允许测试测量的速率和场景的一致性。在一种情况下(−250 mV)，产气速率太低(< 5 mL min)⁻¹)，由废气质谱仪测量冗余度为1,H₂和有限公司₂，计算C_R和R_H，由MFA估计。

敏感性分析

为了定量描述代谢系统对外部因素大(有限)变化的响应，Small和Kacser [57]引入了偏差指数的概念。在这种情况下，反应对外部因素的大(有限)变化的响应的偏差指数可以用:

在哪里(\ D {} _ {{x} _ {J} ^ {r}} ^ {{J} ^ {r}} \)是通量的偏差指数吗\ (J \)外部效应物浓度的巨大变化\ \ (X)。此外，下列关系适用:

在哪里\ ({J} ^ {0} \)和\ ({X} ^ {0} \)通量和浓度是否处于参考状态和r \ ({J} ^ {} \)和\ ({X} _ {J} ^ {r} \)后面对应的值\ (r \)-外部效应器的倍数变化(\({X}_{J}^{r}=r \cdot {X}^{0}\))。事实上，Eq。6等于通量对外部效应的灵敏度，归一化为新状态下的通量和浓度。为了量化ORP变化对细胞内通量的影响，出现了应该选择哪些物种和值作为外部效应物的问题\ \ (X)。由于预计使用的镀钛电极产生的氧气是ORP值增加的主要原因，因此氧的活性(\ ({} _ {{O} _ {2}}) \)肉汤中不同氧化还原水平的计算公式如下[3.]：

在哪里\ ({E} _ {h} \)为V中测量到的ORP值，\ ({E} ^ {0} \)O的标准降低潜力是多少₂/小时₂O对(1.026 V vs. Ag/AgCl)， F为法拉第常数，R为理想气体常数，T为温度和\ (pH = - \ mathrm{日志}({c} _ {{H} ^ {+}}) \)。对于敏感性分析，\ ({} _ {{O} _ {2}} \)确定了所有测试的ORP值，用作外部效应的值\ \ (X),(\ D {} _ {{x} _ {J} ^ {r}} ^ {{J} ^ {r}} \)计算所有细胞内通量，这些通量是先前从MFA获得的。然而，由于ORP从−462 mV逐步增加到−250 mV(−462 mV→−416 mV→−37 mV→−250 mV)，计算的参考状态分别改变为每个新的稳态。因此，结果并不都反映了对无电参考状态(- 462 mV)的响应，而是对前一个稳态ORP值的响应。

监管分析

关于MCA，调节分析提供了一个参数如何引起代谢系统的通量和代谢物水平的变化以及它们如何通过系统传递的定量描述[58]。为了进行调节分析，必须知道所定义系统的稳态通量、弹性和控制系数。在MCA中，代谢过程的弹性我\ \ ()代谢产物\ \ (x)为:

在哪里\ ({v} _{我}\)表示代谢过程的反应速率我\ \ ()。因此，弹性反映了与代谢物水平有关的局部动力学。在这里，代谢过程可以是单一反应或一系列集中反应。控制系数定义为:

在哪里\ \ ()可以是系统通量或代谢物浓度。当\ \ ()是一个通量，这个系数叫做通量控制系数，什么时候\ \ ()是代谢物的浓度，它叫浓度控制系数。

符号MCA代表了对经典代谢控制分析的扩展，使代数控制系数表达式的解析计算成为可能[59]。基于几种已知的控制系数和弹性之间的总和和连通性关系，对于小型和简单的线性系统，这些表达式可以手工推导。对于更大和更复杂的系统，代数表达式可能包含数百个项，并且可以在适当软件的帮助下进行计算。在本工作中，符号MCA是使用PySCeSToolbox [60，61]。带有符号MCA代码和简化MCA模型的Jupyter Notebook可通过在线数据存储库获得[41]。为了计算控制系数，使用了MFA的稳态通量数据，并根据测量的细胞内代谢物浓度和文献中的动力学数据估计了弹性(详细信息请参见附加文件)2)。之后，作为第一步，每个块的综合弹性(\(我{E} _{\δq} ^{我}\))由[62]：

与元素:

在哪里\ \ (x)和\ (J \)表示受扰动时的代谢物浓度和通量(\({x}^{\ δ q}， {J}_{i}^{\ δ q}\))和参考稳态(\ ({x} ^ {0}, {J} _{我}^ {0}\))。积分弹性量化了观测到的通量中不能用中间介质的变化局部解释的量。它们与部分积分反应(\(^{i} IR_{\ δ q}^{a}\))由预先计算的控制系数[62]：

这些部分集成响应状态，扩展了流程我\ \ ()是否参与了在变量中传递响应\ \ ()(它是通量或中间物)到参数变化(\δq (\ \))。因此，如果观察到的变化是直接的或间接的(传播的)性质，它们允许得出结论。总的来说，部分积分响应的总和量化了观测到的变量响应的总强度\ \ ()对参数的改变\δq (\ \)。这个和称为积分响应(\ (IR_{\δq} ^ {} \))：

支持本文结论的数据集可在以下Mendeley数据存储库中获得:https://data.mendeley.com/datasets/7cwf6mf33z/draft?a=34b0fe00-45fc-421a-bb74-fa37b968a071。

作者衷心感谢汉堡工业大学化学分析中心和王伟博士对代谢组学定量的帮助。

由Projekt DEAL支持和组织的开放获取资金。出版费用由德国研究基金会(DFG) -项目编号491268466和汉堡工业大学(TUHH)在资助计划*开放获取出版*中资助。

作者指出

1. 曾一年

   现址:西湖大学工程学院合成生物学与综合生物工程研究中心，浙江杭州310024

作者及单位

1. 汉堡工业大学生物过程与生物系统工程研究所，德国汉堡Denickestraße 15, 21073

   philip Arbter, Niklas Widderich, Tyll Utesch和Yaeseong Hong

贡献

PA, NW, TU, YH和AZ构思和设计了这项研究。NW和PA进行了实验和MFA。PA, NW, TU, YH和AZ分析了数据。PA主持了symMCA和RA。PA, NW, TU和YH撰写并编辑了手稿。AZ监督工作，修改，定稿。所有作者都参与了稿件提交的讨论和协调。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到曾一年。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

所有作者都同意提交稿件。

相互竞争的利益

不适用。

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