改进的馈料批处理Wickerhamomyces anomalusWC 1501用于生产d-阿拉伯糖醇从纯甘油

背景

d-阿拉伯糖醇，一种五碳糖醇，是微生物生物精炼厂的主要目标，旨在使廉价基质稳定。酵母Wickerhamomyces anomalus已知WC 1501在以甘油为基础的限氮培养基中生产阿拉伯糖醇，据报道，用这种酵母进行初步的补料批量工艺可生产18.0 g/L阿拉伯糖醇。

结果

馈料式发酵与w . anomalus采用中心复合设计(CCD)对WC 1501进行优化。溶解氧没有显著影响，而甘油浓度(114.5 g/L)、pH(5.9)和温度(32.5℃)的最佳值为29 g/Ld-阿糖醇在160 h，转化收率为0.25 g阿糖醇每克消耗的甘油，体积生产力为0.18 g/L/h。CCD的最佳条件是进一步改进的基础，包括增加细胞密度(3 × 0)，应用恒定的甘油，并在生产过程中提高温度。表现最好的饲料分批发酵达到265 g/Ld-阿拉糖醇经过325 h后，转化率为0.74 g/g，体积产率为0.82 g/L/h。

结论

w . anomalusWC 1501被确认为优秀的生产者d-阿拉伯糖醇，表现出显著的转化纯甘油的能力。该研究报告了微生物转化甘油的最高数值d-阿糖醇，以阿糖醇滴度、转化率和生产率计算。

图形抽象

甘油是生物燃料工业不可避免的副产品，由于其储量丰富、价格低廉、还原率高，正成为一种有吸引力的生物炼制原料[1］．将甘油转化为更有价值产品的生物方法越来越受到关注，在过去十年中，已经描述了几种利用野生型或工程菌株的微生物过程。已有研究表明，有前途的填充批处理工艺可高产出甘油稳定化最重要的靶标，如乙醇、二醇(1,3-丙二醇和2,3-丁二醇)、有机酸(d-乳酸和羟基丙酸)和三酰甘油[2，3.，4，5，6，7］．还投入了大量的努力，以开发一种发酵过程，将甘油转化为氨基酸、多羟基烷酸盐和多不饱和脂肪酸等化合物[1，8］．压力Wickerhamomyces anomalusWC 1501在一种甘油基限氮培养基中生产多元醇阿拉伯糖醇，因此作为一种可能将甘油转化为增值化学品的菌株而引起了关注[9］．

木糖醇和阿拉伯糖醇等糖醇已被列为从生物质的衍生的前12种增值化学品[10，11］．特别是阿拉伯糖醇，它是一种低热量的抗龋齿甜味剂，还可以作为多种产品化学合成的基质或基石[10］．一些真菌从葡萄糖中产生阿拉伯糖醇的能力已被证实，并提出了有效的过程[12，13，14］．关于从甘油生产阿拉伯糖醇的微生物过程的资料少得多[15，16，17，18，尽管高性能的流程最近被提出Debaryomyces prosopidis而且Yarrowia lipolytica［19，20.］．w . anomalusWC 1501是一种从非传统酵母筛选而来的阿拉伯糖醇生产者[9]，是一项初步研究的对象，该研究评估了阿拉伯糖醇的生产与生长无关，并发生在存在过量甘油的固定阶段[21］．其中，菌株被利用在一个初步的饲料批量过程中，生长和生产阶段是分开的。在平衡培养基中进行生长，然后用浓缩甘油(140 g/L)脉冲触发生产，然后逐步转化为阿拉伯糖醇，最终产量达到18.0 g/L [21］．这种过程允许进行不同的生长和生产阶段，可以分别优化。在本研究中，我们的目标是在不影响生长性能的情况下优化生产阶段，重点是利用中心复合设计(CCD)优化生产条件，将阿拉伯糖醇产量建模为温度、pH、溶解氧张力(DOT)和甘油浓度等相关参数的函数。

利用CCD模型优化生产阶段

利用CCD方法提高了饲料间歇过程中阿拉伯糖醇的产量和甘油转化率(即生产的阿拉伯糖醇与消耗的甘油的质量之比)w . anomalus1501年WC。实验设计涉及4个工艺参数(即甘油浓度、温度、pH和DOT)的研究，每个工艺参数可以假设5个水平(表1)．在平衡培养基(MY)中分批开始发酵，使酵母能够生长，然后将不同的工艺参数组合应用到生产阶段，如表所示2．在输入变量的范围内，不同的发酵流程在阿拉伯糖醇的产量和甘油转化率上都有显著差异(表2)2)．对自变量的响应都用一个二次函数来建模，每个变量都有一个线性系数和一个二次系数，每个变量对都有一个相互作用系数。拟合二次模型的方差分析结果如表所示3.，该报告仅报告基于P值(P < 0.05)保留为显著性的术语。两个模型都不需要响应变换，残差的正态性得到了验证。

描述阿拉伯糖醇浓度的模型高度显著，F值为31.51。性能参数r -平方、Adj - r -平方和Pred r -平方都是足够的(分别为0.89、0.86和0.78)，Adeq精度(21.6)表明模型的信噪比足以探索设计空间(表3.)．除DOT外，其他线性因素均有显著影响，甘油-温度相互作用显著，甘油浓度和温度的二次效应也显著。

尽管所有性能参数都低于阿拉伯糖醇浓度模型，但描述转化率的模型也很重要。缺乏拟合是显著的，即模型误差不仅是由随机变化给出的，而且是由于二次模型没有充分拟合数据，尽管它比线性模型好。对响应的任何转换、对异常值的搜索或对模型项的减少都不能解决这一缺陷，因此报告的模型是可获得的最佳模型。除DOT、甘油-温度相互作用以及甘油浓度和温度的二次效应外，其他线性因素均有显著影响，并在该模型中保持。

报告了阿拉伯糖醇浓度和转化率的二次模型方程4,方程式。(1)和(3)要求用原单位表示的因子，而式。(2)和(4)需要编码值，适合于比较每个因素的相对影响。对阿拉伯糖醇产量和甘油转化率影响最大的一阶项是温度，但甘油初始浓度和pH值的增加也有正向影响。在二阶项中，甘油浓度的二次项和甘油浓度与温度的相互作用对阿拉伯糖醇滴度有很大影响。这种关于甘油的积极主要作用的指示与先前的研究一致表明，高浓度甘油(或其他碳源)与阿拉伯糖醇的产生呈正相关[14，15，16，18]，尽管迄今为止还没有使用CCD方法进行最佳浓度的研究。DOT的不显著影响也与文献中描述的其他酵母在生产阿拉伯糖醇过程中的低需氧量相一致，除非极低的溶解氧浓度或厌氧条件抑制了多元醇产量[15，19］．

图中显示了阿拉伯糖醇产量和转化率随温度、甘油和pH值变化的响应面。1．进行了数值优化，以寻找能导致最佳折中方案的一组因素，同时最大化阿拉伯糖醇和收率响应。在计算期望函数时，根据模型的可靠性，响应分别被赋予5和2的重要值。通过对设计空间的探索，得到了甘油浓度为114.5 g/L、温度为32.5℃、pH为5.875、溶解氧张力为31.2%的最佳溶液。在这些条件下，预测的反应为:阿拉伯糖醇浓度= 25.06 g/L，转化率= 0.29 g/g。进行了三次补料分批发酵，以验证最优因素。

用t检验(P = 95%， n = 3)对结果进行阐述，以比较从重复得到的实验平均值与模型的期望值。发酵140 h后得到的阿拉伯糖醇浓度和转化率的实验平均值均在预测区间内，即与预测值无显著差异，证实了计算模型的准确性(表1)5)．然后允许发酵过程消耗甘油，在160小时耗尽，最终产量为29 g/L，转化产量达到0.25 g/g的平台，生产速率为0.21 g/L/h，整体容积生产力为0.18 g/L/h(图2)。2一个)。

分批培养的上清液冻干过夜。所得到的橙色固体被证实为> 95%阿拉糖醇¹HNMR(附加文件1:图S1)，标识为d-阿拉伯糖醇极性分析。

进料批处理工艺的进一步改进

为了增加细胞数量和产量，生长期尝试在三倍浓缩的MY培养基中进行，但需氧量过高。因此，浓缩的MY培养基被以有限的速率喂养，平均地向培养液提供三倍数量的MY培养基成分。在强化生长阶段结束时，培养物中含有5.5 × 10⁹细胞/mL，生物量33.6 g/L, arabitol < 0.5 g/L，甘油和铵均消耗殆尽。然后在培养培养基中诱导生产阶段，以不同的方式提供浓缩甘油。所有的发酵都进行了三次重复，下面描述了一个代表性的运行。对于每种饲养方式，最终阿拉伯糖醇滴度、产量和生产力的差异小于10%。

首先，将CCD识别的最佳生产条件应用于生长阶段延长的培养培养基上。在发酵24到72小时之间，培养物接受5次浓缩甘油脉冲，使甘油浓度达到114.5 g/L的最佳值(图1)。2B). 165小时后，W. anomaly WC 1501耗尽了供给的甘油，产量为69克/升d阿糖醇。共喂入89 g甘油，转化为22.5 g阿拉伯糖醇。在整个脉冲过程中，转化收率逐渐增加，达到0.30 g/g的平台。另一方面，在最初的几个小时内，产量从0.47 g/L/h逐渐下降到0.18 g/L/h。整个过程的产率为0.41 g/L/h。

在浓缩甘油脉冲后，对生长期延长的培养物进行连续喂饲，而不是脉冲喂饲，为培养物提供总共200 g甘油(图1)。3.)．在第一次尝试(图。3.A)，注入114.5 g/L的甘油脉冲，然后持续注入1.75 g/L/h的甘油，210 h后注入培养基共200 g。pH和温度设置为最佳值。甘油开始迅速消耗，逐渐积累到204 g/L，发酵210 h后停止饲喂，最终消耗。发酵210 h时，阿拉伯糖醇浓度为72 g/L，发酵360 h时，阿拉伯糖醇浓度增加到104 g/L。发酵结束时，175克/升甘油仍未被消耗。转化率为0.43 g/g。在饲喂的最初几个小时内，产量显著地高。3 g/L/h)后急剧下降，稳定在0.36 g/L/h。在整个过程中，容积生产力达到0.29 g/L/h。在生产阶段的最初几个小时，培养物的浑浊度增加，但不伴随着细胞数量的增加。

进一步的实验表明，在生产阶段的最初几个小时，提高温度有提高甘油消耗率的效果，培养可以应对更高的甘油脉冲(数据未显示)，而不会被碳源淹没。在生产阶段在36°C进行的过程中(图。3.B)，以200 g/L的脉冲注入甘油，并以1.75 g/L/h的速率持续注入，直到129 h，注入200 g甘油。此时，培养物已经产生112 g/L的阿拉伯糖醇，甘油由最初的123 g/L上升到177 g/L。发酵325 h后，当阿糖醇浓度达到265 g/L时，残余甘油继续被消耗，直至消耗殆尽。在生产阶段，转化收率和转化率分别趋于0.74 g/g和0.95 g/L/h。该工艺的产率为0.82 g/L/h。

在类似的过程中，生产阶段在38°C进行(图。3.C)，培养也有相同的趋势，但甘油的上升幅度较低(129 h后为155 g/L)。该工艺效率较低，315 h后为230 g/L阿拉伯糖醇，转化率为0.64 g/g，速率为0.90 g/L/h，体积生产力为0.73 g/L/h。

在本文所述的工艺中，这些最佳工艺在甘油基培养基中获得了最高的阿拉伯糖醇效价和转化率，同时也获得了显著的高产率(表1)6) [16，17，19，20.),表示w . anomalusWC1501被认为是在粗甘油工艺中受到挑战的一个很好的候选者。这些结果表明，保持高甘油浓度是触发阿拉伯糖醇生产的关键w . anomalusWC 1501，证实先前研究的证据[16，17，19，20.］．本研究与之前所有报告高阿拉伯糖醇产量的研究的另一个共同特征是，在高碳氮比的条件下，碳源的高浓度伴随着氮源的有限浓度[14，15，16，17，18，19，20.，21］．最近的研究也得出了类似的结论Debaryomyces prosopidis而且Yarrowia lipolytica，报告非常有效的发酵过程[19，20.］．补料分批培养达到了保持高甘油浓度的目的，正如已经用a描述的y lipolytica该菌株的阿拉糖醇浓度(118.5 g/L)、产量(0.49 g/g)和生产力(1.10 g/L/h)都非常高[20.］．然而,不同于w . anomalusWC 1501，由阿拉伯糖醇生产y lipolitica与细胞生长耦合，甘油浓度的影响被解释为对渗透胁迫的适应。

在这个过程中w . anomalusWC 1501在目前和以往的研究中描述，阿拉糖醇的生成主要发生在氮限制条件下的固定相，固定数量的生物催化细胞将过量的甘油线性转化为阿拉糖醇。一致地，生产速率似乎主要与生长阶段获得的生物催化细胞的浓度有关，这由增强生长的饲料批次过程表明，温度在一定范围内对转化动力学发挥积极的影响。的一些特性w . anomalus可以假设解释高阿拉伯糖醇浓度，甘油转化率和生产力。事实上,w . anomalus具有高效的甘油运输系统，能够为这种碳源的快速代谢提供燃料，以及抗氰化呼吸(CRR)机制，可以消除与阿拉伯糖醇一起产生的减少的辅因子，在生长受限的情况下产生低质子动力，从而产生低ATP需求[22］．高渗透压对生长性能和生产力的影响尚未被专门研究w . anomalusWC1501。因此，渗透胁迫本身是否与阿拉糖醇的产生有关还有待澄清y lipolytica但没有在d . hansenii［15，20.]，并可作为调查和过程改进的进一步目标。

另一个值得深入研究的课题是阿拉伯糖醇生产和储存三酰甘油积累之间的代谢关系，因为它们发生在类似的条件下。事实上，高效生产阿拉伯糖醇所需的高碳氮比与产油酵母中贮藏脂类的积累是相同的，包括y lipolytica［23]，但阿拉糖醇的产生是否对脂类生物合成有一定的作用仍有待澄清。w . anomalusWC 1501本身表现出在高达生物量干重23%的脂质体中积累三酰甘油的能力[21］．尽管如此，脂质产量在整个CCD中没有显著影响(数据未显示)。

目前的研究报告中最高值的微生物转化甘油d-阿糖醇，以阿糖醇滴度、转化率和生产率计算。压力w . anomalusWC 1501被确认为优秀的生产者d-阿拉伯糖醇，表现出显著的转化纯甘油的能力。该菌株是生物柴油工业原料甘油的理想候选菌株，值得在生物柴油工业的微生物生物精炼厂中进行更深入的研究。

菌种、培养基和化学品

w . anomalusWC 1501来自我们的实验室收藏品。菌株在30°C的YPD肉汤摇瓶(BD Difco, Sparks, MD, USA)中常规培养，并在4°C的YPD琼脂斜面中保持。MY培养基，含20 g/L纯甘油，3 g/L酵母提取物(BD Difco, Sparks, MD, USA)， 2 g/L (NH₄）₂所以₄， 3 g/L KH₂阿宝₄， 1 g/L K₂HPO₄和1 g/L MgSO₄h·7₂O，用于制备生物反应器种子培养物。除非另有说明，所有化学品均从Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)购买。

生物反应器操作与中心复合设计馈料批量实验

补料分批发酵在实验室规模的高压灭菌生物反应器中进行(500 mL Mini Bio, Applikon Biotechnology, Delft, Netherlands)。在400 mL MY培养基中分批开始，接种5% (v/v)的种子培养物，在30°C生长24小时。培养物保持在30°C，用0.5 v/v/min过滤灭菌空气充气。自动添加4m NaOH使pH值不低于5.0。级联控制搅拌从1000到1700转，以保持溶解氧张力(DOT)在20%。自动添加Xiameter 1520(道康宁，米德兰，MI, USA)和聚丙烯乙二醇的消泡混合物(1:1,v/v)以防止起泡。批生长12小时后，在试验设计中规划的甘油、pH、温度和DOT条件下开始生产阶段的具体发酵运行(见表1而且2)．将体积调整到250ml，并加入150ml甘油溶液，以便为培养物提供所需浓度。调整pH值并相应地改变其设定点。培养物定期取样，以监测生物量、甘油和阿拉伯糖醇浓度。

转化率用每克甘油消耗的阿拉伯糖醇的克数表示。计算瞬时生产速率，考虑每个时间间隔，由于投料的体积变化和随着采样提取的阿拉伯糖醇量。体积生产力计算为最终阿拉伯糖醇滴度，除以时间。

实验设计

实验设计采用design Expert软件(Version 10 Stat-Ease Inc.， USA)进行，目的是优化进给批处理工艺的生产阶段w . anomalus1501年WC。在二阶对称设计中，考虑了生产初期甘油浓度、温度、pH和DOT四个因素。考虑了两种反应:阿拉伯糖醇浓度和转化率，两者都是根据甘油耗尽或在碳源未耗尽的情况下140小时后进行评估的。采用中心复合设计(CCD)，每个因子有5个水平，编码为- α， - 1,0， + 1， + α(表1)1)．该设计包括30个试验运行，随机进行，包括16个阶乘和8个轴向组合和6个中心点重复(表2)．

根据一般方程，对自变量的响应用二次函数建模:

在哪里Y为测量的响应变量，k是因子的数量，β₀是常数项，β_我，β₂而且β_ij分别为线性系数、二次系数和相互作用系数，X_我而且X_j表示因子[24］．

各模型项的显著性采用方差分析(ANOVA)进行检验，变异源比较采用Fisher分布(F检验)，p < 0.05。计算还得出了以下性能参数:模型的决定系数(r平方)，调整的决定系数(Adj r平方，即考虑到模型中参数的数量相对于设计中的点的数量的拟合估计)，预测的决定系数(Pred r平方)，以及适当的精度值(Adeq精度，即信噪比是否足以探索设计空间的估计，值大于4是可取的)。

为了评估模型的有效性，通过最大化期望函数对阿拉伯糖醇浓度和转化率进行数值优化[25］．在接近预测最佳值的地方对得到的验证实验进行了三次重复试验，并将阿拉伯糖醇浓度和转化率的测量值的实验均值与相应的模型预测区间进行比较[26］．

改善馈料式发酵

分批培养在360 mL MY培养基中开始，用9 g/L KH修饰₂阿宝₄和3 g/L K₂HPO₄．12 h后，给予36 mL含有400 g/L甘油，60 g/L酵母提取物，40 g/L (NH₄）₂所以₄和20 g/L MgSO₄，速率为2.5 mL/h。20 h后调整体积至250 mL，根据具体实验调整pH和温度，以800 g/L甘油脉冲开始生产，以达到所需浓度。在生产过程中，为了向培养物提供总共250 mL的甘油溶液(即200 g甘油)，培养物不断被喂入。补料分批发酵进行了三次重复。

化学分析

通过测量600 nm (OD)的浊度来监测生长₆₀₀)、细胞数和生物量干重(DW)。细胞计数在Bürker室;DW用热天平测定(MB 64 M, VWR, Radnor, PA, USA)(20)。

培养上清液中阿拉伯糖醇和残留甘油-离心(10,000 rpm, 4℃，5分钟)澄清，0.22 μm过滤-用折射率检测器(1200系统，Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)在高效液相色谱中进行分析。等距洗脱在60℃，5 mM H, 0.8 mL/min下进行₂所以₄通过离子排除柱(Aminex HPX-87 H, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [27］．¹用布鲁克FT-NMR Advance 400 (400.13 MHz)在298 K记录H谱。化学位移值以相对于TMS的ppm为单位给出，并以同位素杂质信号DMSO-d6 (2.50 ppm)作为参考来确定。在进行核磁共振分析之前，用Alpha 1-2 LD实验室(德国克里斯特)对改良的饲料批培养物的上清进行冻干过夜。使用Polax-2 L型偏振计(Atago，日本)进行偏振分析。

所有材料归作者所有，不需要许可。

不适用。

该研究由摩德纳大学和雷焦埃米利亚大学资助，项目名为“2016年意大利里卡酒的Ateneo per la Ricerca, Progetti Dipartimentali”(FAR2016DIP项目)，意大利大学和研究部(MUR)资助，项目名为“下一代欧盟”(名为REACT-EU - Bando PON Ricerca e Innovazione 2014-2020, DM 1062 del 10/08/2021, Azione IV.6 -意大利里卡酒的绿色Contratti di Ricerca su tematiche Green)。

作者指出

1. Stefano Raimondi和Giorgia Foca对这项工作做出了同样的贡献

作者和联系

1. 意大利摩德纳雷吉奥埃米利亚大学生命科学系，意大利摩德纳41125

   Stefano Raimondi, Giorgia Foca, Alessandro Ulrici, Alan Leonardi, Francesco Candeliere, Maddalena Rossi和Alberto Amaretti

2. 摩德纳大学化学与地质科学系，意大利摩德纳41125

   罗伦萨Destro

3. 费拉拉大学化学、制药和农业科学系，意大利费拉拉44121

   Raissa布吉

4. bioest - siteia，摩德纳和雷焦埃米利亚大学，42124，雷焦埃米利亚，意大利

   Stefano Raimondi, Giorgia Foca, Alessandro Ulrici, Maddalena Rossi和Alberto Amaretti

贡献

GF和AU进行了实验设计和数据分析;对产物进行了LD、RB、AL等化学表征;SR、FC和AA分别进行了发酵实验;AA和SR构思研究;AA和MR撰写了主要的手稿文本;所有作者都审阅了手稿。

相应的作者

对应到阿尔贝托Amaretti．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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