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早产儿粪便微生物组研究方法综述

产妇保健、新生儿和围产期体积7、物品编号:11（2021）引用本文

摘要

早产儿肠道微生物群在婴儿的健康和发育中起着重要的作用，认识到早产儿微生物生态失调的影响促使了对这些问题的重要研究。设计微生物种群调查的方法多种多样，每种方法都有自己的优点和局限性。所使用的技术可能会影响结果，导致研究的异质性。本综述旨在描述用于研究早产儿微生物组的最常用技术，详细说明其各种局限性。目的是为进入该领域的人提供对现有方法的广泛理解，以便在文献解释和未来的研究设计中考虑使用这些方法的可能影响。我们发现，尽管许多技术用于表征早产儿微生物组，但16S rRNA短扩增子测序是最常见的。16S rRNA短扩增子测序具有精度高、可发现性好、通量大等优点。然而，这种技术有局限性。协议的每个阶段都提供了注入偏见的机会。偏倚可能导致在整个测序过程中使用16S rRNA高值的研究之间存在差异。 Thus, we recommend that the interpretation of previous results and future study design be given careful consideration.

介绍

早产儿肠道微生物群已成为新生儿重症监护领域一个重要的、可改变的因素。与足月出生的婴儿相比，早产儿(妊娠<37周出生)的特征微生物群是生态失调的:高度可变[1，2，3.]，多样性低[4，5，6]，低的common commensals [1，6，7]，并藏有更多潜在的病原体[8，9]。这种益生菌群失调使免疫功能受损的早产儿患急性和慢性疾病以及发育异常的风险增加[10，11，12]。早产儿也更有可能通过剖腹产出生，被配方奶喂养，接受抗生素治疗，并在早期的临床环境中度过大部分时间，所有这些都有可能加剧微生物生态失调[1，2，13，14]。

不幸的是，由于所使用的调查方法的多样性，对这种微生物组成的理解受到了干扰。检测微生物组的方法很复杂，技术上具有挑战性，各实验室之间也各不相同。因此，不可能排除方案偏倚是导致研究间差异的一个因素。事实上，许多研究已经证明了方法偏差在影响微生物组分析结果方面的作用[15，16]，从而导致研究结果存在显著的异质性。

这篇综述旨在描述研究早产儿微生物组最常用的技术。尽管这些技术也可以应用于足月婴儿的微生物组研究，但由于对这一领域的兴趣激增，我们选择关注那些调查早产儿的研究。这种被放大的兴趣可能源于对早产儿施加的不成比例的健康负担及其与微生物组的联系。本综述的目的是为那些进入该领域的人，特别是新生儿临床护理的人，提供对所使用的不同方法的广泛理解，以便加强文献解释和未来的研究设计。本综述确定并描述了最常用的检查早产儿微生物组的方法，并将这些信息与比较技术功效的研究相比较。这个过程的目的是阐明哪些技术将是最适合检查早产儿的微生物组

方法

查询及资格准则

PRISMA(系统评价和荟萃分析的首选报告项目)方法(图2)。1)，检索截至2020年8月的相关文献。研究过早微生物组的研究通过SCOPUS和PubMed数据库中使用搜索词进行检索;“微生物群”、“婴儿”、“早产儿”和“粪便”。本综述纳入了描述各种研究设计、样本量、干预措施、比较物和结果的期刊文章。如果文章不是原创研究，是案例研究，不是英文的，无法访问或没有专门调查早产儿微生物组，则排除。在最初的搜索中找到的评论也被用来定位其他论文，这些论文解决了评论问题。

图1
图1

描述研究收集和纳入过程的PRISMA流程图

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数据收集流程

建立了标准化的数据收集方案，提取所有相关信息进行定性分析。记录作者，出版日期，目的/假设，方法总结，结果总结和局限性。还收集了一级技术、二级技术、储存和DNA提取的方法特定信息。重点是16S rRNA短扩增子测序，因为该方法是最常见的主要技术，并进一步收集了目标可变区域、平台、管道和参考数据库的信息。

结果

文献综述探讨了早产儿微生物组研究中使用的方法多样性，并对研究中使用的主要技术进行了总结，如图2所示。2。系统评价的结果总结在图中。1。鉴定出217种物品。其中137篇文章在删除重复后保留下来，另外45篇文章在评估全文的合格性后被删除。共审阅92篇文章。尽管在工作流程的每个阶段都有几种技术选择，可能会导致偏见，但在许多研究的方法部分显示的细节却令人惊讶地缺乏。摘要信息仅基于所提供的数据。

图2
图2

描述早产儿微生物组分析的不同工作流程和技术比例的流程图

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主要技术

确定了13种表征早产儿肠道微生物组的技术(图2)。2)。广泛的技术已被用作微生物成分分析的主要工具，包括:

分子技术占主导地位，特别是16S rRNA短扩增子测序，占主要技术的53.2%。qPCR是第二常用的技术，在13%的研究中使用，其余技术分别被≤10%的研究使用。使用选择性和差异琼脂培养基的传统非分子技术只占使用的主要技术的很小一部分(5.4%)，另外四项研究使用培养技术作为次要方法。

分子技术中DNA的储存条件和提取方法

不同分子技术的样品存储方案是一致的。然而，所使用的DNA提取技术变化很大。在-80°C冷冻是粪便(71.4%)和DNA(50%)的主要储存方法，而非冷冻方案仅在2.9%的研究中使用。DNA提取是表现出最大变异性的领域，使用了15种不同的方法。QIAamp DNA粪便试剂盒是一种结合热、化学和酶解的试剂盒，是最常用的(40.3%)，其次是不使用试剂盒(14.9%)。PowerLyzer PowerSoil试剂盒排名第三(10.4%)，其余12个试剂盒占34.4%。

16S rRNA扩增子测序-特异性技术

最常用的分子技术是16S rRNA短扩增子测序。然而，所使用的方法在测序平台、可变靶区和管道中变化很大。罗氏454(57.8%)测序平台是这四个平台中最常用的，其次是Illumina(31.1%)。近年来，这个平台的使用有所增加。V4是使用最多的可变靶区(22.7%)。然而，在92项研究中使用了16种独特的组合。在使用的8条管道中，QIIME/QIIME2 (Quantitative Insights Into Microbial Ecology) [96占所用管道的一半，而mother [97远远排在第二位(20%)。核糖体数据库项目(46.3%)是使用的主要参考数据库，其余大多数研究使用SILVA(19.5%)和Greengenes(17.1%)。尽管16S rRNA短扩增子测序是最常用的方法，但其技术差异很大。

随时间变化的趋势

许多过时的技术和工具正在被更新、更健壮的方法所抛弃。随着时间的推移，高通量分子技术变得越来越普遍，特别是在16S rRNA扩增子测序中，该技术于2004年首次使用。16S rRNA扩增子测序的上升趋势与指纹和基于培养的技术的下降相结合，所有基于培养的研究都发生在2015年之前。还有一种趋势是使用Illumina平台和管道，在16S rRNA扩增子测序中使用错误建模。

讨论

检测微生物组的技术可分为两大类，分子和非分子。分子技术因其分析深度、速度和成本降低而成为主导。尽管如此，即使在分子方法中也有几种技术可供选择，并且在给定的分子技术中，协议可能存在变化。这种缺乏一致性可能导致对早产儿微生物组的研究结果不一致。

基于文化的方法

很少有研究仍然完全依靠传统的非分子方法来表征微生物组，最近的研究发生在2014年。非分子技术是基于传统的微生物学方法，包括在严格的实验室条件下，在预定的培养基上培养微生物群落，以优化生长。方法因存在的微生物类型和下游应用而异。技术包括肉汤培养、富集和微生物鉴定。生长培养基的例子包括Luria Broth，也称为Lysogeny Broth [98]，通常用于栽培大肠杆菌和选择性琼脂，如血，麦康基[99]或木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂[One hundred.]，这是胃肠道中普遍存在的其他分类群所特有的。微生物被放置在培养基中，在严格的条件下生长，给它们时间生长成单个菌落。菌落形态可以用来确定特定的分类群和菌落计数，并用于计算浓度和连续稀释。由于其特异性，这些技术主要用于鉴定感兴趣的特定微生物，并被用作检测致病物种的诊断工具。

尽管非分子技术在敏感性和特异性方面存在局限性，但它们仍然是有用的，特别是对于厌氧物种，以及发现和缩放。它们可以通过识别感兴趣的特定物种或识别可能属于已知生物体的未知序列来提高结果的稳健性[101]，当与16S rRNA高通量测序等分子技术结合使用时。非分子技术的其他主要优点包括材料便宜，并且该方案需要的设备有限。然而，特定的培养条件选择了特定的微生物，这必须有先验知识，这意味着许多物种可能不被发现[102，103]。此外，如果大规模进行，它们是耗时和劳动密集型的。因此，由于这些时间和劳动力问题，以及这些旧技术对微生物群落的限制，传统的培养技术在很大程度上已经被分子技术所取代。

基于分子的方法

分子技术，包括16S rRNA高通量测序、指纹图谱、微阵列和定量pcr，是快速、敏感和高度特异性的，特别是对共生生物。由于这些优点，分子技术自问世以来已迅速取代非分子技术用于鉴定微生物组组成。2)。利用遗传信息来区分分类群使得更详细的探索成为可能，并可能提供超出实验室常规生长的这些微生物群落的丰度和组成的信息。描述最多的微生物群包括细菌群落，它们可以通过利用16S核糖体RNA (16S rRNA)基因的可变区域来识别，该区域的两侧是高度保守的区域。用这种方法从粪便中提取DNA，通常使用商业衍生的提取试剂盒。通过PCR扩增，然后根据相似性划分类群，以确定存在的分类群，从而进行深度群落采样。样品必须首先收集和储存，并为所有16S和其他分子技术提取DNA。

样品收集

样本收集方案将根据研究设计而有所不同。然而，在比较研究结果或在研究设计期间，收集时间是一个重要的考虑因素。大多数研究根据婴儿的胎龄或胎龄后提供具体的时间点。然而，也有研究将样本更广泛地分类在一起，例如，将样本归类为“早期婴儿”或胎粪。胎便是哺乳动物婴儿最早的粪便，由一种粘稠的焦油状物质组成，排列在未出生婴儿的肠道内。通常，胎便直到出生后才释放。然而，有时它会在出生前释放到羊水中。它也可以在分娩后的不同时间点释放，通常在前三到五天内。当使用如此宽泛的定义时，可能无法在研究之间进行准确的比较，因为婴儿微生物组是动态的，其组成会发生精心设计的突然变化[34，104]。因此，在解释文献和规划未来的研究设计时，收集时间是一个重要的考虑因素。

分子技术中DNA的储存条件和提取方法的影响

样品存储

储存条件对粪便微生物群落稳定性和组成的影响[j]。105]，这可能会影响研究结论。不充分的储存可能导致特定生物的持续生长，改变样品中分类群/属的比例，并可能导致DNA/RNA断裂。研究表明，样品在室温下保存24小时后，DNA/RNA就会发生断裂[105]，并且在此之后，样品中的细菌群落可能会发生重大变化[105，106，107]。正如Gorzalek等人所证明的那样，变化可能在短短30分钟内发生。[qh]108]。目前，可用的储存方法包括在不同温度下冷冻或冷藏，以及使用厌氧培养系统，水储存/运输介质和粪便隐血试验。

冷冻和冷藏

最佳的样品储存条件取决于储存的时间。如需立即处理样品，应在冰上保存48小时[109]，或4°C存放24小时[110似乎足以保存样品。然而，立即冷冻粪便样本以抑制细菌生长是长期储存的最佳方法。粪便样本在-80°C下长期储存已被证明产生的微生物群与新鲜样本相似[106，111，112]。在几项研究中，在-20°C下储存粪便样品也显示出类似的样品保存效果[105，113，114]。然而，这似乎是有时间限制的，一些研究报告了在-20°C的长期储存(储存时间超过一周)中分类群的变化，导致了显著的变化拟杆菌spp。115]而厚壁菌门与拟杆菌门的比例则可维持53天[116]。在-80°C下保存产生最一致的结果，似乎是最常见的保存方法(图2)。2)。通常将样品暂时储存在-20°C或4°C，或者使用非冷冻方法，直到在无法立即冷冻的情况下(例如在家中收集)可以在较低的温度下储存。

其他存储技术

粪便样本的立即冷冻在后勤上可能很困难，特别是对于大规模的基于人群的研究，冻融效应可能会显著降低样本的完整性。因此，其他保存方法可能更适合某些协议。这些保存技术包括化学和干燥保存，如DNA/RNA屏蔽和厌氧培养系统。保存缓冲液，稳定和保护细胞DNA/RNA的水性试剂，如DNA/RNA Shield (Zymo Research)和RNAlater (Thermofisher)，也可以在不冷藏或冷冻的情况下保存基因完整性数周[117，118，119，120，121，122，123]。使用这些缓冲液可确保样品免受冻融效应引起的潜在应力的影响。当冷冻不可行时，这些缓冲液和其他非冷冻保存方法是一个很好的选择。

尽管非冷冻保存方法是一种更实用的选择，但一些潜在的问题已经被强调。保存缓冲区可能导致多样性降低[124，125相对于立即冻结。此外，一些较旧的保存缓冲液可能阻碍下游DNA的提取和靶基因的扩增[117]。厌氧培养系统，如Anaerocult®，仅对厌氧菌株的储存有效，因此具有明显的局限性。目前的大多数研究仍然支持保存缓冲液的功效，尽管有几项研究强调了它们的局限性。因此，在考虑所有可用的存储选项时，在-80°C冷冻和在稳定缓冲液中悬浮都是可接受的做法。

DNA提取

分子分析的第一步是DNA提取，这可以使用市售试剂盒进行。提取是分子技术中的一个重要步骤，它涉及到将DNA从其他细胞物质中分离出来。这一过程包括细胞裂解或细胞壁的破坏、DNA与其他细胞成分的分离以及随后的分离。DNA提取可能是费力的，并且具有很高的样品污染风险，因为涉及大量的生物材料处理。幸运的是，由于对人类微生物组的广泛兴趣，有几种商业上可用的提取试剂盒使这一过程不那么费力，更精简，更可重复性。

DNA提取和测序所需的组织量分别取决于提取方法和下游应用。一般来说，全基因组测序需要100至1000纳克DNA，扩增子测序只需1至10纳克DNA [126]。所需的粪便量将取决于提取DNA的方案的有效性，这取决于用于给定方案的方法。QIAamp DNA粪便试剂盒是早产儿微生物组领域最常用的试剂盒，优化后可检测190-220毫克的粪便，但如上所述，所需的粪便量取决于试剂盒。

不幸的是，不同的提取方案和试剂盒会极大地影响微生物群落结构的变化[127，128]，对结果引入偏见[115，129，130]。在一项研究中，提取方法被证明是造成变异的第二大因素[127]。这种变化在很大程度上是由于均质化和裂解方法的不同而引起的。这些步骤是至关重要的，因为不同的粪便组分可能含有不同的微生物组成，不同的微生物通过不同的技术可以更好地裂解。

革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞壁结构不同，需要不同的裂解方法提取DNA。革兰氏阴性菌的细胞壁很薄，由肽聚糖和含有脂多糖的磷脂双分子层组成，而革兰氏阳性菌的肽聚糖细胞壁很厚。因此，革兰氏阳性微生物需要更有力的裂解方法，而革兰氏阴性微生物更容易被裂解[115]。

因此，不同形式的均质化或裂解可能导致偏差，因为它们不能有效地破坏样品中存在的所有微生物的细胞壁，或者相反，通过破坏容易裂解的细胞的DNA。机械、化学和酶解方法也可以产生不同比例的分类群，其中机械方法产生的细菌数量更多，多样性更大[115]。两项综合研究探索了几种试剂盒，包括QIAamp DNA粪便试剂盒，发现国际人类微生物群标准(IHMS)方案Q，包括机械裂解，在几个参数上表现最好[128，131]。尽管如此，我们的综述发现，在早产儿微生物组研究中最常用的提取方法是Qiagen QIAamp DNA粪便试剂盒。这种方法结合了热、化学和酶解，一些研究采用了通过头加热加入机械裂解的方法。不幸的是，不同的检测仪器会产生偏差[128，132，133]。尽管如此，机械破坏对于人类肠道微生物群的全面分析是必不可少的[133，134]，在标准化方案建立之前，研究人员必须仔细考虑不同试剂盒产生的偏差。

分子技术

指纹识别方法

16S rRNA扩增子测序的使用越来越多，而其他技术的使用却越来越少，比如不同的指纹识别方法。指纹识别方法更具成本效益，执行起来也更快[135]，尽管高通量测序技术提供了微生物群落的广泛详细分析。与传统的培养方法相比，这些技术更受青睐，因为它们为单个生物体提供了更高的灵敏度和特异性，并且可用于分析大量样品[135]。一般来说，指纹图谱方法通过扩增目标基因(通常是16S rRNA基因)并利用凝胶电泳观察扩增子的物理分离，从而提供微生物群落的概况，从而探索高度丰富的分类群。指纹识别方法已被用于探索早产儿微生物组(18.5%)的研究，尽管它们目前不太常见。这些技术包括变性/温度梯度凝胶电泳(D/TGGE)和末端限制性片段长度多态性(TRFLP)，以及变性高效液相色谱(dHPLC)。dHPLC采用液相色谱法鉴定多态性[136]，而其他的则依靠电泳来区分序列，尽管它们都被认为是指纹识别方法。

变性/温度梯度凝胶电泳

梯度电泳是通过丙烯酰胺凝胶对分散的核酸进行大小依赖的运动和分离。由于DNA带负电荷，它以与核酸序列大小成反比的速度通过丙烯酰胺凝胶或分子网向正极移动，从而允许不同大小的序列分化[137]。更详细的探索是通过应用温度(TGGE)或化学梯度(DGGE)来使样品在丙烯酰胺凝胶中移动时变性，基于序列的化学组成[138，139]。

DGGE和TGGE在DNA变性机制上存在差异。在DGGE中，核酸暴露于越来越极端的化学条件下，导致DNA在一个逐步的过程中变性。这允许通过它们在凝胶上的位置可视化序列差异。该方法依赖于碱基变性能力的差异，这是由碱基对序列决定的，以大小分离基因。相比之下，TGGE使用温度梯度与电泳相结合。链在凝胶上的分离取决于碱基对的含量，越小的分子移动得越快。139随着温度的升高。

末端限制性片段长度多态性(TRFLP)

TRFLP还使用电泳技术根据末端限制性片段大小来区分序列，如TGGE和DGGE。这允许进行微生物群落分析的序列鉴定[140]。该方法包括用荧光标记引物对目标基因进行PCR扩增，然后用限制性内切酶进行酶切。然后通过毛细管或聚丙烯酰胺电泳在测序凝胶中分离荧光标记的末端片段来确定不同末端片段的大小，从而产生独特的条带模式，从而可以识别微生物[141]。T-RFLP具有高通量和高灵敏度，但由于不完全或非特异性消化可能导致对多样性的高估，其准确性也有限。序列的同源性可能导致对现有分类群的低估[142]。此外，库必须在分析之前构建。

dHPLC

dHPLC采用液相色谱法鉴定DNA多态性[143]，不像TGGE、DGGE和T-RFLP。用离子对反相液相色谱法在聚烷基柱基质上将DNA链分离成异双链和同双链。143]。，following partial heat denaturation. The presence of polymorphisms is revealed by the differential retention of these homo- and heteroduplex DNA fragments [144]。异双链是在PCR扩增过程中形成的在突变位点不匹配的双链DNA。不匹配的双链DNA片段在柱基质上的保留减少，随后保留时间减少，从而允许多态性的鉴定。因此，dHPLC可用于筛选可能与疾病有关或与抗生素耐药性有关的突变[136，145]。该方法也被用于在物种深度上区分分类群，方法是将相同的扫描突变的基本原理应用于检测pcr扩增的细菌16S rRNA基因之间的序列差异[146]，也可以作为重新测序基因组的工具[144]。

限制(利与弊)

一些人认为dHPLC是最佳的指纹识别方法[70]，有可能在物种和/或生物型水平上识别细菌[146]。然而，这些技术需要大量的下游加工，可能产生PCR偏倚[102，147并且检测深度有限，因为很难将凝胶中产生的带状图案与指纹识别方法产生的物种或血统联系起来[135]。因此，指纹识别方法通常仅限于在目/科水平上进行识别[148]，而且只适用于最丰富的有机体。这种方法也使得很难将多个研究的数据合并为一个单一的分析[135]。指纹技术可用于探索微生物群落的优势成员，包括基于优势成员的群落聚类[149]。然而，它们在描述整个微生物群落方面的应用是有限的。

系统芯片

微阵列最初用于监测基因表达，但其应用已扩展到包括比较基因组学、DNA测序分析、单核苷酸多态性(SNP)分析和微生物检测[150]，包括对早产儿微生物组的研究[77，78]。微阵列是用预先定义的与小亚基(SSU) rRNA互补的寡核苷酸序列制成的探针打印的显微载玻片。寡核苷酸探针检测基因表达或特定基因表达的mRNA转录物，并从靶生物中提取。逆转录酶将mRNA转化为互补DNA (cDNA)，该cDNA片段化并荧光标记并添加到微阵列中[151]。然后，cDNA通过杂交结合互补寡核苷酸探针，在给定探针上观察到的荧光强度的测量表明，在分析之前选择的预定序列的丰度是感兴趣的[151]。这使得系统发育寡核苷酸阵列(phyloarrays)，包括HITChip，适合微生物群落的分析。

HITChip是一种用于人类胃肠道微生物检测的生态系统特异性系统发育微阵列[152，153]，并且是唯一用于早产儿肠道微生物群研究的微阵列。HITChip是一种寡核苷酸微阵列，使用基于16S rRNA基因的两个高变区(V1和V6)的4,800个寡核苷酸探针，鉴定1,140种类型。在分析了16,000个人类胃肠道16S rRNA基因序列后设计了种型[153]。因此，HITChip对人类胃肠道微生物组具有高度特异性，并提供了高度的多样性。

限制(利与弊)

微阵列的优点包括易于使用，速度快，成本低[154]，以及研究微生物基因功能的潜力[155]。这些中间方法允许处理大样本量，同时提供更多的分类深度，如指纹识别方法。微阵列针对核糖体RNA基因，允许比较多样性和分类学，因此显示类似的稳健性[156，157，比如16S rRNA测序。然而，与高通量技术相比，系统发育阵列在评估新谱系时受到限制，因为它们只能检测预定义的分类群[135，158]。当有潜在的分类学或基因发现时，其他方法更适合，因为微阵列仅限于预定义的分类群。微阵列并不常用于早产儿肠道微生物组的研究，因为这是一个相对较新的研究领域，其他方法可能更适合于表征这一生态位。

qPCR和荧光原位杂交

聚合酶链反应(PCR)是一种高灵敏度的分子技术，最初是为检测DNA/RNA序列而开发的，但后来发展到超越了纯核酸检测。定量聚合酶链反应(qPCR)建立在标准PCR的基础上，提供扩增基因的数量。qPCR也不同于标准方法，因为它实时或在PCR过程中而不是在最后监测目标DNA分子的扩增。这个过程不仅可以检测，还可以定量和表征核酸[159]。在基于染料的qPCR中，荧光染料被加入到PCR反应中，荧光信号与被复制的DNA数量成比例地增加。这样就可以在每个周期后对DNA进行定量。然而，qPCR一次只能检测一个靶点，因此通量有限。更精确的基于探针的qPCR提供了一种绕过这一缺点的方法，通过识别序列特异性探针同时检查多个目标。在基于探针的qPCR中，来自探针的荧光信号与反应中存在的目标序列成正比[160]，因为它是基于染料的qPCR。

荧光原位杂交(FISH)是另一种基于探针的技术。FISH是一种利用互补结合来鉴定或量化可用于微生物鉴定的cDNA的分子技术，如微阵列和qPCR [161]。FISH使用荧光标记的DNA探针，与显微镜下可以观察到的特定DNA序列相匹配，从而可以直接量化特定的分类群。荧光寡核苷酸探针创建的目标，无论是16S或23S rRNA序列。靶和探针序列用热或化学物质变性，并在杂交之前混合在一起。然后在互补的靶和探针序列之间发生杂交，荧光显微镜通过观察荧光标记的cDNA来方便地检测杂交。这种针对特定目标的方法有助于在针对特定微生物时提高准确性。

限制(利与弊)

qPCR和原位杂交都能提供高度精确的定量[162]，可能非常敏感[163]，在考虑主要肠道微生物群时，可以得出与宏基因组方法相似的结果[24]。然而，它们的应用是有限的，因为需要序列的先验知识，如指纹和微阵列。因此，这些方法没有发现能力，也没有评估多样性的能力。FISH的设计目的是检查早产儿中存在的主要微生物群，但它是基于足月婴儿中的微生物群[79，80]。然而，以这种方式预先定义分类群是一个重大的局限性，因为众所周知，早产儿与足月出生的婴儿具有明显不同的微生物种群[24，26]。此外，qPCR和FISH都不具有可扩展性，因此仅对低目标数量有效。qPCR或原位杂交方法在定位特定人群时可能是有益的，因为它们与测序方法相比具有有限的偏差和更便宜，但它们不适合绘制整个微生物生态系统的项目，如早产儿肠道微生物组。

测序技术

DNA测序是核酸序列测定的过程，涵盖了三代测序技术的广泛范围。第一代测序始于低通量的Sanger测序技术，该技术一次只能测序单个DNA片段[164]。Sanger使用了一种劳动密集型的基于细胞的扩增步骤，包括在提取和纯化之前将克隆序列放入质粒中进行扩增[164]。第二代测序技术，通常被称为下一代测序(NGS)或高通量测序(HTS)，涉及16S rRNA元条形码和元基因组学(鸟枪测序)。NGS是指任何使用并行处理概念的排序方法。这种并行处理将每次运行的读取量增加到数百万，极大地提高了效率，就像开发无单元系统一样。NGS还将延伸和检测步骤并行运行，再次提高了效率[165]。然而，NGS技术的局限性在于它们使用短读数(bp)，这在组装或绘制基因组时产生了计算上的挑战。为了克服这一挑战，第三代测序被开发出来，即长读取或单分子直接测序。所有测序技术都有能力产生大量相对准确的数据，再加上成本的不断降低，导致它们在大多数调查微生物种群的现代研究中得到采用。16S rRNA高通量扩增子测序(元条形码)是目前用于研究早产儿肠道微生物组特征的最常用方法。2)。然而，其他方法，包括霰弹枪宏基因组学和第三代单分子直接(长读测序)，也被应用。所描述的所有技术都有其优点和局限性。

下一代测序

16S rRNA扩增子测序

自2004年首次使用以来，16S rRNA扩增子测序或元条形码已成为表征早产儿微生物组的最常用技术。16S rRNA元条形码利用高通量测序来定位16S rRNA基因的可变区域，从而准确鉴定微生物群落组成[166，167，168]。16S rRNA基因编码16S核糖体RNA，是原核核糖体30S小亚基的一个组成部分。16S rRNA基因在整个分类群中高度保守，但由于进化速度缓慢，也有几个可变区域允许分类群之间的分化。可变区足够保守，以至于大多数分类群可以被描述，但也足够可变，以至于分类群可以被区分。这些高变区中有9个碱基对长度不等，与小核糖体亚基的二级结构有关。这些区域的保护程度不同，因此不同的区域与不同的分类分辨率相关。16S rRNA基因扩增子测序方案包括DNA提取，可变靶区PCR扩增，将序列分组为otu、asv或等效序列，然后将这些序列变体映射到参考数据库中进行分类鉴定。

16S rRNA元条形码是表征早产儿最常用的技术。然而，尽管如此，没有一个主要的协议。在工作流程的所有阶段都有无数的选项，所有这些都可能引入改变输出的偏差，这得到了样本通过研究聚类的观察的支持[15]。在样品收集和储存方式、DNA提取方式、选择引物和针对可变区域、测序平台、生物信息学管道和参考数据库等方面的技术差异，都可能产生掩盖生物学差异的系统性偏见[15，16]。由于16S rRNA方案是表征早产儿肠道微生物组最常用的技术，下面将对其各种方案进行更详细的解释。在解释文献和研究设计过程中都应谨慎，直到标准化方案达成一致。

可变区域的选择和引物偏差

一旦DNA被提取，在测序之前，必须通过PCR扩增来自感兴趣的可变区域的目标DNA。然而，对于该针对哪个可变子区域以及使用匹配引物，存在很多争论。索引引物是“选择”和扩增可变子区域所需的互补碱基对序列。这些16S rRNA可变子区域在同一管道分析的样品之间的分类群差异可达40% [169]，有人认为，准确扩增子分析的最关键步骤是引物的选择[170]，因为引物的选择可以改变覆盖度[171]。

具有相同提取和存储协议的样本已被证明可以通过引物选择聚类[15]。这是因为引物选择不当会影响数量丰度[172]，并导致分类群的代表性不足或代表性过高[173，174]或针对特定分类群的选择[135，175，176]。例如，大多数引物可能无法充分检测双歧杆菌[177]，可能过度夸大了已经在早产儿中观察到的低水平。对于物种识别，这些高变异子区域的目标是有限的，因为不同的子区域由于子区域本身的有限变异而对它们可以识别的分类群表现出偏见。因此，虽然V1-V3可能适合于埃希氏杆菌属和志贺氏杆菌物种,克雷伯氏菌将需要V3-V5，和梭状芽胞杆菌和葡萄球菌要求V6-V9测序[178]。因此，针对高变子区域的研究必须在属水平上解决分类分辨率问题。因此，考虑到这些限制以及可变区域和引物选择可能带来的偏见，确保良好的分类鉴定的唯一方法是对整个16S基因进行测序。然而，高错误率和高成本仍然是主要的阻碍。

有关于瞄准V4-V6的争论[179]， v4 [172，179，180]，以及V3-V4 [169，171，181]子区域，当针对高可变子区域进行高通量测序时，V4是表征早产儿微生物组最常见的(图2)。2)。地球微生物组计划[182]推荐V4子区，由于配对末端序列完全重叠，已被证明具有较低的PCR和测序误差[180]。其他研究也表明，基于V4的系统发育关系最接近整个16S rRNA基因[179]。然而，一些证据表明，瞄准V4区域可能不像以前认为的那样准确[178]。关于哪个区域最好的争论正在进行中，但Almeida等人的研究为V3-V4区域的使用提供了令人信服的论据。它比较了模拟社区和模拟的不同管道组合和参考数据库的可变区域[169]，并发现V3-V4区域始终产生最可靠的分类推断。总而言之，在标准化发生之前，频繁使用V4和针对V4或V3-V4子区域的研究结果可能是最佳实践。此外，在对使用不同可变区域的研究进行比较时，应考虑到这一点。

总会在平台

有几个测序平台可用于16S rRNA短读扩增子测序，Illumina MiSeq，罗氏454(原454生命科学)和赛默飞世尔的离子激流个人基因组机(PGM)都用于早产儿微生物组的背景下。从历史上看，罗氏454一直是主导平台，因为NGS技术就是从它开始的。然而，Illumina现在占据了市场主导地位，其持续增长并最终在2016年放弃了罗氏454测序平台。尽管大多数现代测序技术都会选择Illumina测序，但重要的是要了解不同平台的不同方法，以及它们的局限性和偏见，以准确地解释文献。

Illumina测序技术利用光信号实时检测碱基对，实现了大规模并行测序。包含100-150bp片段的DNA文库被装载到流动池中，并放置在测序仪中进行此过程。序列通过互补接头与流动细胞结合。一个被称为克隆桥扩增或簇生成的过程然后放大每个读取，在流动细胞(载玻片)上产生一个点(簇)，其中包含数千个相同的DNA链拷贝。然后，通过合成测序的过程，荧光标记的核苷酸通过重复的单碱基延伸循环与DNA链上的互补碱基结合。在每个核苷酸结合时发出荧光信号(其颜色取决于碱基)，并拍摄一张照片，表明添加了什么核苷酸。一旦正向DNA链被读取，读取的DNA链就会被洗掉，而反向DNA链则会重复这个过程。然后，计算机通过检测每张图像中每个位点的碱基来构建序列。

罗氏454依赖于序列簇的生产，像Illumina一样，但通过一种称为克隆乳液PCR (emPCR)的过程。在emPCR中，来自DNA文库的单链DNA片段(最多1kb)附着在一个头的表面，而不是一个载玻片，每个DNA片段有一个头。读卡器通过互补适配器连接到磁头上。然后将微球分成含有乳化油的单孔，并进行热循环以实现克隆扩增。这个过程产生原始模板的许多副本，如Illumina的克隆桥扩增。载玻片含有孔，然后被四种核苷三磷酸(NTP)中的一种淹没，这些核苷三磷酸与它们的补体结合，在添加时释放光信号。原来的NTP混合被洗掉，下一个NTP被添加，循环重复。然后将每个读取序列的光强度绘制在图形上，然后使用图形来计算确定序列。

离子洪流PGM也使用克隆- empcr，但与罗氏454的不同之处在于它如何确定核苷酸序列和DNA片段的大小。离子激流PGM或质子测序使用约200bp的DNA片段，这些片段通过接头再次与珠子结合。然后进行PCR，并用不同的ntp洗涤。然后，它利用氢离子的释放，这是通过在DNA聚合物中添加NTP来测定核苷酸序列而发生的。氢离子的释放会引起pH值的变化，从而确定DNA序列。

限制(利与弊)

任何平台都有其局限性:这些局限性可能导致与平台相关的偏差和基于研究的聚类[15]，尽管测序领域取得了重大进展。例如，罗氏公司与A和T碱基相关的测序错误率可能很高[183]，均聚物区域的高错误率是由于光照强度的累积差异造成的[184，185，186]，并且可以有多达15%的序列是由人工扩增产生的[187]。离子激流也受到高均聚物错误率的影响[186，188，189]，以及生物特异性读取截断，因为Roche和Ion Torrent采用了类似的方法，在单个循环中可以纳入多个核苷酸[190]。Illumina仍然有自己系统的基础召唤偏见[191]，尽管平台的错误率相对较低[186]。这些包括产生与均聚物相关的测序错误[183]，不同序列片段的读取质量不同[192]，与GGC基序相关的单碱基错误增加[193]和不同读端不同的测序错误率[194]。在早产儿研究的两个主要平台Roche 454和Illumina中，平台造成的差异很小[172，183]。然而，错误率越低，吞吐量越高[186]和更高的阅读质量[190]，从而获得更高质量的数据。这允许严格的质量控制参数，为下游分析提供更可靠的输出[172]。

生物信息学与参考数据库

生物信息学是生物学、计算机科学和统计学相结合的跨学科科学领域，目的是处理大量的生物数据，如16S rRNA基因扩增子测序产生的数据。生物信息学工具如QIIME [195]和母亲[97在测序后和下游分析之前，需要从人类无法读取的数据中清理和推断微生物组成。生物信息学工具或管道需要既精确又可靠，以便利用测序产生的大量基因数据得出准确的生物学结论。这些工具通过比较otu、asv或等效序列(代表真实序列的序列变体)的形式，将原始数据转换为可解释的分类丰度[196]输入已定义的参考数据库，通过分配最可能的分类谱系来识别样品中存在的分类群。所产生的分类法分类的准确性取决于参考数据库中注释序列的多样性和广度[169]，以及生物信息管道使用的不断改进的算法的准确性。

尽管生物信息管道正在迅速变化和改进，而且许多研究人员没有意识到与使用不同工具相关的偏见，但对于最佳实践尚无一致意见。在检查模拟社区和运行模拟时，不同软件包、数据库和目标区域的组合可能产生截然不同的准确性[169]。比较几种生物信息学工具:QIIME、QIIME 2、mother和MAPseq [197]， Almeida等人发现QIIME 2在检测灵敏度和成分预测方面是最佳工具。QIIME 2的分类序列比例最大，相对丰度最精确[169]。然而，MAPseq更为精确，丢失的属更少。最近的一项研究比较了目前最流行的16S rRNA基因扩增子测序的生物信息管道，发现DADA2是需要最高生物分辨率的研究的最佳选择，但usearc - unoise3 [198有最好的整体表现[199]。贯穿USEARCH-UNOISE3、DADA2和QIIME 2(使用DADA2/deblur插件)的共同主题是它们的去噪或聚类算法。

去噪和聚类是通过将相似的序列变体分组到一个bin中来纠正序列错误的方法。这最初是通过OTU聚类完成的，其中序列是基于97%的相似性阈值聚类的。然而，有几种方法可以实现这个阈值:封闭参考、开放参考和从头聚类[200]。与基于参考的方法不同，de-novo方法基于阈值对彼此进行集群读取，而不需要参考数据库。相反，封闭引用方法对数据库进行聚类读取，并排除那些不对齐的序列。开放参考集群也针对数据库进行集群，但随后集群的读取不会从头对齐。最成功的方法是有争议的。200，201]，但可能取决于研究设计。尽管如此，对更可靠数据的追求已经从otu聚类转向了误差建模，它同时考虑了丰度和误差。

去噪器，如DADA2 [202]和deblur [203]，生成从读取中学习到的错误模型，并将这些模型用于asv (DADA2)或subotu (deblur)的序列变异分配。误差建模方法允许聚类到序列区域的单核苷酸差异水平，提高分辨率，并允许具有内在生物学意义的标签始终可重复[196]。这些改进使研究人员能够区分真正的序列和在PCR扩增和序列中产生的序列，并在不同的工具中产生可比的一般群落结构。然而，仍然存在一些可变性，产生的数字序列变异存在差异，从而导致α多样性[204]，尽管有这些改进。在进行交叉研究比较和研究设计时应考虑到这些差异。

研究早产儿肠道微生物组最常见的生物信息学管道是QIIME。QIIME对OTU聚类的使用及其产生的大量伪OTU和膨胀的alpha多样性[j]199在考虑古代文学作品时应该考虑到这一点。然而，QIIME在2018年被QIIME2取代(首次发布于2019年)[96]，它使用了一种更新的错误建模方法，带有DADA2或去模糊插件。大多数关于早产儿微生物组的研究早于QIIME2的发布，因此将使用较旧的版本。目前尚不清楚新的研究是否会实现这一转变，因为自该管道发表以来发表的论文数量有限。然而，为了产生更可靠的数据，这一领域的研究需要朝着这些新的和改进的方法发展。

除了选择最佳的生物信息学工具外，所使用的参考数据库也是一个重要的考虑因素。管道可以使用基于同源性或贝叶斯方法将序列变体与参考数据库中的序列相匹配。最初的相似性阈值为>95%序列匹配被认为代表同一属，>97%的序列匹配被认为代表物种水平鉴定[205]。然而，最近的研究表明，这些阈值太低，无法准确分配[206]。参考数据库包含FASTA文件，其中包含分配给分类学节点的参考序列。然而，不同数据库之间在命名法和分类谱系方面存在差异[206，207]，这对样本中识别的分类群有明显的影响。核糖体数据库项目(RDP)是最常用于早产儿微生物组研究的数据库。SILVA可能比更常用的RDP有更好的回忆和更精确(图2)。2)，以Almeida等人的基准论文为基础，研究人类微生物组。[169]。然而，需要对最佳实践进行更多的研究，以及跨数据库的标准化。

生物信息学-污染

污染是引入研究间可变性的另一种方式。来自采集、提取和测序方案(和试剂盒)的DNA污染可能影响结果的解释[208，209]。许多这些污染物可以被认为是人类胃肠道的正常居民，因此采取措施减轻污染的风险，并采取步骤来解释或消除这种污染是很重要的。当与适当的生物信息学工具相结合时，阴性对照、峰值对照和微生物标准是解释技术准确性和污染的有效方法。生物资讯工具如microdecon [210可用于去除均质污染。这对研究设计和文献解释都很重要，因为如果没有适当的缓解策略，污染可能产生不寻常或新颖的发现[208]。

描述性指标

由于数据的数量和复杂性，分析微生物数据可能会带来重大挑战。此外，很难为微生物组数据的统计分析提供最佳实践方法，因为它高度依赖于研究的假设和目标。然而，通常在微生物分析中考虑三个主要指标:α多样性，β多样性和差异丰度。不幸的是，找到一种有意义的方法来进行这些分析可能是一个复杂的过程。

Alpha多样性是指一个样本内的多样性，概括了生态结构的丰富度(分类类群的数量)、均匀度(类群的丰度分布)或两者的结合[211]。Alpha多样性可以用丰富度、Chao 1指数、Shannon-Weiner指数、Simpson指数、Pielou均匀度或Faith系统发育多样性来表示。所有这些指数所代表的内容各不相同，丰富度和Shannon-Weiner指数在微生物组研究中很常见。丰富度仅仅是指序列变异的数量，而Shannon-Weiner指数同时考虑了丰富度和均匀度。Chao 1指数是经过偏倚校正的丰富度估算[212随着新管道(如DADA2)的出现，这种情况已经变得不那么常见了，因为它们处理单例，这是基于假设许多是虚假的测序变体。

多样性是指样品或群体之间的微生物差异。和alpha多样性一样，beta多样性有几个指标表示样本之间的距离。Beta多样性指标包括Jaccard距离、Bray-Curtis距离和UniFrac距离。雅卡德距离是样本共有的序列变异数除以共有的序列变异数。布雷-柯蒂斯距离(Bray-Curtis distance)是微生物组研究中最广泛使用的一种方法，它在此基础上考虑了丰度，而UniFrac距离，无论是加权的还是未加权的，都代表了基于系统发育差异的样品之间的差异。这些距离矩阵都可以通过直接比较样本或组之间的距离、分层聚类或排序技术来表示。排序是最常见的，因为它将复杂的距离数据简化为2D或3D图，便于解释。

α和β多样性，以及差异丰度，都需要在分析之前进行归一化。差异丰度只是对样本或元数据之间的分类丰度进行比较。然而，这个过程比简单地计算每个样本的读取次数要复杂得多。这是因为使用读取计数作为丰度的度量是有缺陷的，因为读取数实际上是测序的人工产物，因此不能很好地表示丰度[213]。Alpha和beta多样性也考虑了读取计数，因此它们对测序深度也很敏感。为了进行有效的分析，两个多样性指标都要求每个样本的读取次数相等。这意味着如果不采取适当的措施，库的大小可以决定多样性的结果[214]。因此，在分析之前，必须对读取进行规范化，以解释每个样本的不同读取数量。然而，尽管标准化是解决方案，不同的分析需要不同的方法。

旧的归一化方法包括总和缩放/归一化(TSS)和细化。在TSS中，通过将每个序列变体的读取数除以总读取数，将数据转换为比例，而rarefying通过分配测序深度阈值来调整文库大小的差异，随后对深度高于阈值的样本进行子采样，并丢弃低于阈值的样本。然而，这两种方法都不是差分丰度测试的好选择，并且可能有很高的1型误差[215，216，217，218]。此外，TSS没有考虑到异方差[17]和细化丢弃了可能有用的数据。因此，其他的现代方法已经开始取代旧的方法。

较新的方法包括使用DESeq2的方差稳定变换[219]，上分位数正常化[215]、CSS规范化[220]和带EdgeR的m值裁剪均值[221]。像DESeq2和EdgeR这样的方法通常受到青睐，因为它们在几篇比较论文中的表现[215，216，217]。然而，这些比较是特定于样本内方差的标准化，数据在排序中聚类的能力，以及它们在差异丰度测试中的表现，但有几个重要的局限性[222]。这些方法倾向于将样本内方差标准化，因为它们是为差异丰度测试而创建的。因此，较新的方法不能保证跨样本的读取次数相等。它们抑制了物种的均匀性，并高估了低丰度分类群的重要性(通过对数变换)[222]。对低丰度分类群的过高估计和对均匀性的抑制可能导致对群落的不准确表示，并且与不相等的读取计数一起，可能导致样本之间的不准确比较。

因此，虽然比例，特别是TSS和稀薄化，不适合差异丰度测试，但它们更适合多样性分析，因为它们在考虑读取深度差异的同时更准确地表示微生物群落[218，222]。此外，使用DESeq2的方差稳定转换等方法更适合于差分丰度测试。至关重要的是，研究人员意识到标准化方法的优势和局限性，以准确解释和稳健的研究设计以及后续分析之间的差异。

宏基因组鸟枪测序(全基因组测序)

霰弹枪宏基因组学是另一种NGS方法，已被用于描述早产儿肠道微生物组的少数次。霰弹枪宏基因组测序针对样本中的所有DNA，而16S rRNA测序针对特定区域/基因。该方案与16S rRNA测序略有不同，尽管它们使用相同的测序技术。霰弹枪宏基因组学不需要扩增，因为没有目标区域/基因，但它需要在绘制之前去除宿主DNA，因为样本中提取的所有DNA都被测序。这种替代的NGS方法提供了更高的分类分辨率和基因注释，允许更全面的分析。因此，使用这种技术的研究通常是在寻找功能基因谱或病原体菌株与疾病的联系。

限制(利与弊)

鸟枪测序虽然有明显的好处，但也有其局限性。在每一步中都可以进行许多实验和计算方法，如16S rRNA测序[223]。DNA提取方法已被证明会影响成分[224]，由于试剂盒和试剂中含有微生物[225]和裂解技术的差异[226]。文库制备和测序可通过PCR扩增引入错误[223]和平台的选择[227，228]。此外，特别是宏基因组分析可能导致方案相关的可变性，生物信息学有几种选择，因为所有宏基因组分析技术都有自己的局限性[223]。

宏基因组分析有两种方法:无装配方法和基于装配的方法。无装配方法，也称为基于读取的分析或“映射”，与包含全基因组的参考数据库进行比较，例如Kraken [229]或离心机[230]，或选择标记基因，如mOTU [231]。另外，基于程序集的分析使用像Meta-IDBA [232]和SOAPdenonovo2 [233来重新构建基因组。基于装配的方法可以构建多个全基因组并解析新生物体，但可能是一个巨大的计算负担，并且在评估复杂群落方面受到限制。另外，基于读的分析计算效率高，可以处理更复杂的群体，假设参考数据库中有足够的测序深度和基因组。然而，鉴定仅限于那些先前定义的微生物，因此群落结构/功能是有限的。这两种方法都有各自的优点和缺点，哪一种是最好的可能取决于所提出的问题。

在将NGS霰弹枪方法与其他测序方法进行比较时，也有利弊。相对于元条形码，宏基因组学具有更可靠的物种鉴定和更广泛的分析潜力，但生物信息学更复杂，需要更多的时间、技能和计算能力，而且测序成本更高，因为测序的是整个基因组而不是单个基因。因此，使用霰弹枪方法的较早研究往往样本量较小[2或者只对队列中的一小部分使用该技术[74]。此外，当细菌基因组片段与宿主物种和其他生物体的污染物混合时，16S rRNA扩增子测序对细菌具有特异性，不需要完整的参考基因组，也不需要大量或高质量的DNA [234，235，而不是鸟枪测序。然而，随着霰弹枪宏基因组测序的价格持续下降，再加上计算方法的改进，这种技术的采用可能会变得更加广泛。然而，针对可变区域的16S rRNA扩增子测序仍然是目前该领域研究的主导。

第三代测序

长读测序是另一种测序方法。随着第三代测序技术(也称为长读测序)的出现，16S基因的全长测序成为可能。这种方法可以通过Oxford Nanopore Technologies Minion等平台实现。236]和Pac Bio的循环共识和连续长读测序等技术[237]。这些技术允许在数百万个读数之间进行区分，这些读数可能只有一个核苷酸的不同[178]，并有能力产生超过10,000个碱基对(bp)的读取[238，239]。这使得整个1500 bp 16S基因测序成为可能，并将分类分析的分辨率提高到物种和品系水平。

第三代测序可以产生这些长读数，因为它们的设计与以前的测序方法不同。纳米孔技术通过将单个DNA分子穿过DNA孔，测量膜上电流的变化，从而产生长序列。通过膜的电流是由通过孔的碱基对序列的大小决定的。另外，PacBio的SMRT(单分子，实时)测序反复将DNA分子通过附着在孔上的DNA聚合酶，读取短序列，直到有足够的重叠读取来识别整个序列。

长读技术还可以应用于全基因组测序(WGS)和霰弹枪宏基因组学，以及16S rRNA基因的全长测序。WGS或霰弹枪宏基因组方法允许更大的测序深度，这意味着可以实现对早产儿微生物组的物种水平检测，如对整个16S基因进行测序。Legget等人证明了这种能力，他们利用Oxford Nanopore在开发早产儿微生物组样本宏基因组筛选平台时产生近实时数据的能力[94]。此外，由于霰弹枪宏基因组测序针对样本中的所有基因组DNA，因此这些数据可用于其他分析，如功能分析和抗生素抗性基因分析。这提供了对微生物生态学的全面调查。

限制(利与弊)

这两种技术产生的长读数是它们的主要优势。纳米孔可以产生的reads一般在10Kbp到1Mbp之间，最长的序列可以产生>2Mbp [240]。这些较长的读取，以及相关计算方法的进步，允许比短读取技术更大的测序深度，具有更高的准确性[241]，因为它们可以区分测序人工制品和实际的生物序列[178]。然而，高错误率[242，243，244]在TGS中仍然是个问题，尽管声称精度很高。对于Oxford Nanopore来说，这种高错误率来自于利用电流的变化来识别碱基对[245]。在PacBio的单分子实时测序技术中，目前没有任何技术可以精确地捕捉到产生信息的速度(DNA聚合酶增加100bp/s)，这就是为什么DNA必须通过多次酶才能克服这个问题的原因之一。因此，尽管这些技术显示出了希望，但高错误率和高成本仍然是阻碍，这可能就是为什么它们在早产儿微生物组的研究中很少使用的原因。

结论

在研究早产儿微生物种群时，结果的可变性将继续是一个限制，直到有标准化的方案。本综述旨在描述用于研究早产儿微生物组的最常用技术及其局限性。目的是为进入该领域的人提供一个广泛的理解，以便为文献解释和未来的研究设计提供考虑。16S rRNA扩增子测序是最常用的方法，因为它比长读和散弹枪宏基因组测序更便宜，比非分子技术更详细，并且允许在广泛的样品中存在的分类群特征。然而，这种方法有几个局限性，可能会引入偏差。16S基因的全长测序或散弹枪宏基因组学方法可能提供更好的选择，特别是随着准确性的不断提高，以及成本的降低。然而，在这些选择变得更加可行之前，针对高可变子区域的16S高通量测序将继续占据主导地位。

在16S测序方法的不同阶段，有许多选项可能会导致偏差，并且由于有大量可用的工具和数据库，决定最佳方法可能是一项艰巨的任务。在这项工作中，我们简要地描述了不同方法的偏见，重点是16S技术。16S rRNA高通量测序中最常用的技术是-80°C保存样品，QIAamp DNA Stool Kit进行提取，在Roche 454平台上测序，靶向V4区，使用QIIME或QIIME2管道结合Ribosomal Database Project参考数据库。然而，16SrRNA测序的最佳组合可能是储存在-80°C，提取试剂盒包括机械裂解，如(IHMS) Protocol Q或Power Faecal Pro (Qiagen)，使用Illumina平台，针对V3/V4区域，使用QIIME2管道(或至少错误建模)结合SILVA数据库。然而，研究问题，以及跨研究的可重复性和一致性也应该考虑。总之，在微生物组研究标准化之前，需要给予重要的考虑，以确保对文献的正确解释和稳健的研究设计。

数据和材料的可用性

本研究中使用和/或分析的数据集可根据通讯作者的合理要求提供。

缩写

16 s-trflp:

16S末端限制性片段多态性

ASV:

扩增子序列变异

DGGE:

变性梯度凝胶电泳

dHPLC:

变性高效液相色谱法

背景:

脱氧核糖核酸

核苷酸:

Deoxynucleoside三磷酸

emPCR:

乳液聚合酶链反应

鱼:

荧光原位杂交

InviMag工具:

InviMag粪便DNA试剂盒

该款工具:

MoBio Powersoil细菌DNA试剂盒

OTU:

操作分类单位

PacBio SMRT:

Pac Bio单分子，实时测序

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

但是脉冲场凝胶电泳的出现:

脉冲场凝胶电泳

PowerLyzer工具:

PowerLyzer PowerSoil工具包

QIAamp工具:

QIAamp DNA粪便试剂盒

QIIME:

微生物生态学的定量见解

qPCR:

定量聚合酶链反应

RAPD:

随机扩增的多态DNA

RDP:

核糖体数据库项目

RNA:

核糖核酸

散弹枪:

猎枪宏基因组

TGGE:

温度梯度凝胶电泳

TGS:

第三代测序

WGS:

全基因组测序

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致谢

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资金

不适用。

作者信息

作者及单位

  1. 詹姆斯库克大学，麦格雷戈路1号，史密斯菲尔德，QLD, 4878，澳大利亚

    Jacob A. F. Westaway & Catherine M. Miller

  2. 詹姆斯库克大学，1詹姆斯库克博士，道格拉斯，昆士兰州，4811，澳大利亚

    Roger Huerlimann和Donna Rudd

  3. 汤斯维尔大学医院，安格斯史密斯博士100号，道格拉斯，QLD, 4814，澳大利亚

    瑜伽Kandasamy

  4. 病理学昆士兰，100安格斯史密斯博士，道格拉斯，QLD, 4814，澳大利亚

    罗伯特·诺顿

作者
  1. 雅各布·a·f·韦斯特威
    查看作者出版物

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  2. 罗杰Huerlimann
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  3. 凯瑟琳·m·米勒
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  4. 瑜伽Kandasamy
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  5. 罗伯特·诺顿
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  6. 唐娜陆克文
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韦斯特威，J.A.F，胡尔里曼，R.，米勒，C.M.et al。早产儿粪便微生物组研究方法综述。产妇保健、新生儿和围产期7， 11(2021)。https://doi.org/10.1186/s40748-021-00131-9

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  • 微生物组
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