出生队列研究中母体和脐带血维生素D水平与婴儿肠道微生物群的关系

背景

越来越多的证据表明，维生素D和早期肠道微生物群都会影响儿童的健康结果。然而，人们对这两种重要暴露之间的关系知之甚少。我们的目的是研究妊娠或分娩时血浆25-羟基维生素D (25[OH]D)水平(脐带血)与婴儿肠道微生物群之间的关系。

方法

在孕妇样本中评估母体和脐带血25[OH]D水平。在1个月和6个月大时，对其后代的肠道微生物群进行了调整后的成分分析。

结果

平均产前25(OH)D水平为25.04±11.62 ng/mL，平均脐带血25(OH)D水平为10.88±6.77 ng/mL。产前25(OH)D水平升高与丰富度降低显著相关(p= 0.028)和多样性(p= 0.012)。产前和脐带25(OH)D与1个月微生物群组成显著相关。6个操作分类单元(otu)与产前25(OH)D水平显著相关(4个为正相关，2个为负相关)，11个otu与脐带25(OH)D水平显著相关(10个为正相关，1个为负相关)。其中，OTU 93 (不动杆菌)及OTU 210 (棒状杆菌属），始终与母体和脐带25(OH)D呈正相关;Otu 64 (瘤胃球菌属gnavus)与产前25(OH)D呈正相关，与脐带25(OH)D负相关。

结论

产前母体和脐带血25(OH)D水平与生命早期肠道微生物群有关。未来的研究需要了解维生素D和微生物群如何相互作用，影响儿童健康。

在怀孕期间，维生素D是母婴最佳健康所必需的[1]然而，维生素D缺乏和不足在这一时期很常见[2]。除了后代可能出现骨骼问题外，母亲的维生素D水平还可能影响儿童的健康结果，包括过敏/哮喘和肥胖的风险[3.，4，5]。越来越多的证据表明，这些儿童健康状况也可能与肠道微生物群有关。6]。

维生素D水平可能会影响肠道微生物群的结构和功能。在维生素D受体敲除小鼠中，与野生型小鼠相比，肠道菌群的群落水平和功能发生了显著变化[7，8]。不能产生1,25-二羟基胆骨化醇的小鼠表现出肠道微生物群失调[8]。有足够的证据表明，人体维生素D水平与肠道微生物组成有关[9]。孕妇饮食中维生素D的摄入量也与分娩后4天测量的孕妇肠道微生物组有关[10]。只有少数研究调查了母亲早期维生素D水平和肠道微生物群之间的潜在联系。在考拉出生队列中，母亲补充维生素D和母亲25-羟基维生素D (25[OH]D)五分位数与计数呈负相关双歧杆菌属母系25(OH)D五分位数与土壤水分含量呈正相关b . fragilis1月龄婴儿肠道菌群计数[j]11]。脐带血25(OH)D与高水平的Lachnobacterium较低水平的Lactococcus维生素D产前哮喘减少试验[12]。这些发现表明，母亲的维生素D水平可能会影响婴儿微生物群中几个关键细菌类群的丰度。

婴儿肠道微生物群最初是由母体微生物群播种的[13];通过对母体微生物组的影响，产前维生素D水平可能潜在地影响婴儿肠道微生物组。需要进一步研究产前维生素D在婴儿微生物群发育中的作用[12]。我们检查了25(OH)D水平是否在怀孕期间(在怀孕25至44周之间测量;在来自种族和社会经济多样化的Wayne县健康、环境、过敏和哮喘纵向研究(WHEALS)出生队列的母婴样本中，平均= 33周)或分娩时(脐带血)与婴儿1个月和6个月时的婴儿肠道微生物群有关[3.，14]。

研究人群

WHEALS招募了2003年9月至2007年12月预产期的孕妇，她们在城市卫生系统的5家诊所中的1家看产科医生，以建立出生队列[3.，14]。所有女性都在妊娠中期或更晚，年龄在21-49岁之间，居住在韦恩县和奥克兰县的预定地理区域，包括底特律市及其周边郊区。所有参与者提供书面知情同意书，研究方案由Henry Ford Health System机构审查委员会批准。最初的WHEALS队列招募了1258对母子。

粪便样本

对1个月和6个月大的婴儿进行了家访。家访前，要求家庭保留最近的脏尿布，粪便样本保存在- 80°C。有关DNA提取方法的详细资料，请参阅其他资料[15]。

测序用聚合酶链反应条件及文库制备

16S rRNA基因的V4区被扩增，如Caporaso, Lauber [16]。简单地说，在25 μL的反应中，使用0.025 U Takara Hot Start ExTaq (Takara Mirus Bio Inc.， Madison, WI)， 1X Takara缓冲液(含MgCl2, 0.4 pmol/μL F515和R806引物)，0.56 mg/mL牛血清白蛋白(Roche Applied Science, Indianapolis, in)， 200 μM dNTPs和10 ng基因组DNA进行16S rRNA扩增。反应分三次进行:初始变性(98℃，2分钟)，30次98℃循环(20秒)，50℃退火(30秒)，72℃延伸(45秒)，72℃最终延伸(10分钟)。扩增子使用2% Tris/硼酸盐/EDTA琼脂糖e-凝胶(Life Technologies, Grand Island, NY)进行验证，使用SequalPrep归一化板(Applied Biosystems, Foster City, CA)进行清洗和归一化，并使用Qubit 2.0荧光仪和双链DNA HS Assay Kit (Life Technologies)进一步定量。样品以5 ng浓度为等摩尔混合，使用AMPure SPRI微珠(Beckman Coulter, Brea, CA)纯化，变性并稀释至2 nM，并将5 pM用40% (v/v)变性12.5 pM PhiX峰值对照品加载到Illumina Nextseq试剂盒中。

序列数据处理和质量控制

使用FLASH v 1.2.7对末端序列进行组装[17]，用条形码解复用，在QIIME 1.8中丢弃低质量读数(Q-score < 30) [18]。如果连续3个碱基< Q30，则截断Reads，只有当截断的序列≥原长度的75%时才保留Reads。UCHIME [19]用于检查嵌合体，嵌合体在操作分类单元(OTU)选择之前从数据集中过滤，使用UCLUST进行97%的序列鉴定[20.]针对GreenGenes数据库版本13_5 [21];未能与参考序列聚类的序列读取将重新聚类。使用PyNAST [22]，以及使用RDP分类器分配的分类[23]和GreenGenes参考数据库版本13_5 [21]。FastTree 2.1.3 [24]被用来建立系统发育树。为了标准化样本间读取深度的变化，数据被细化到每个样本60,000个序列的最小读取深度。为了确保选择具有代表性的子样本，我们实现了前面描述的代表性稀疏算法[25]。

共有580名儿童在最终的纯净OTU表中至少有1份粪便样本;其中，499名独特的儿童(总共700个粪便标本)进行了母体或脐带血25(OH)D检测，并被纳入统计分析。表格1给出了每个时间点(分别为1个月和6个月或产前和脐带)的每种测量(微生物群，25[OH]D)的分解情况。在分析数据集中，收集1个月的粪便标本的平均±标准差(SD)为40±17天(最小= 16，最大= 137)，收集6个月的粪便标本的平均±SD为207±31天(最小= 168，最大= 322)。在整个过程中，“1个月”和“6个月”被用作样本收集预期时间的标签。

维生素D测量

25(OH)D在冷冻(−80°C)妊娠血浆样本中测定(范围= 25 - 44周妊娠;平均= 33周)和分娩(脐带血)在威斯康星大学Neil Binkley博士的实验室使用高效液相色谱法[3.，14，26]。对于25(OH)D水平低于最低检测限度5纳克/毫升的人，给予2.5纳克/毫升的值(N= 11产前和N脐带25[OH]D = 81。关于孕期维生素D的最佳水平，目前还没有全面的共识;然而，高于20 ng/mL的水平可预防骨相关疾病[2]。因此，维生素D水平不足被定义为< 20 ng/mL [2]。

为了解释维生素D的季节性变化，正如Wegienka, Havstad [3.]，我们拟合收集值(25[OH]D值)与时间(月，记为“m”)的正弦模型:

非理性价值[27]是用每个受试者的测量值减去预测值，再加回总体平均值的方法计算出来的。采用非合理性值进行分析。

统计分析

主效应的显著性在p< 0.05，在p< 0.1。母体和脐带血25(OH)D测量的肠道微生物群组成差异通过R包中实施的置换多变量方差分析进行评估“素食主义者”(28]，使用加权和未加权的UniFrac [29]。利用QIIME计算Alpha多样性指数(丰富度、Pielou均匀度和Faith系统发育多样性)[18和R素食包装[28]，并使用线性回归测试了母体和脐带血25(OH)D的相关性。使用零膨胀负二项回归(如果收敛失败，则使用标准负二项回归)对10%或更多样本中发现的所有otu进行单个分类群测试。P-数值用Benjamini和Hochberg [30.错误发现率;调整错误发现率p< 0.05为显著性。我们先验地假设种族可能混淆和/或改变母亲和脐带血25(OH)D与婴儿肠道微生物群之间的关联，因此所有的分析都根据母亲的种族(黑人与白人，排除其他种族)进行了调整，我们还使用分层模型和相互作用项测试了种族特异性影响。

最后，由于母乳喂养与生命早期的肠道微生物群有关[15婴儿时期维生素D水平较低[31]，我们假设母乳喂养可以改变母体和脐带血25(OH)D与肠道微生物群的关系。对于每个微生物群时间点(1个月或6个月)，当前母乳喂养被定义为该时间点的任何当前母乳喂养。拟合母体或脐带25(OH)D与当前母乳喂养之间的相互作用项，以检查潜在的影响改变。

基本描述性统计分析

表格2呈现人口统计信息，比较分析样本中包含的特征和未包含的特征。与未纳入样本的人相比，纳入样本的人年龄稍大，通常是白人，已婚，非城市居住，收入较高，产前接触环境烟草烟雾的可能性较小p< 0.05)。分析样本中儿童的平均出生体重z分数也较高。

产前25(OH)D平均值为25.04±11.62 ng/mL，脐带血25(OH)D平均值为10.88±6.77 ng/mL。在403名产前25(OH)D检测的母亲中，141名(35%)产前维生素D不足(25[OH]D < 20 ng/mL)。产前与脐带25(OH)D高度相关(Pearson ρ = 0.81，p< 0.001)。

产前和脐带血25(OH)D与肠道微生物群α多样性的关系

在调整种族后，较高的产前25(OH)D水平与丰富度降低显著相关(p= 0.028)和多样性(p= 0.012)。在种族因素调整后，产前或脐带25(OH)D水平对1或6个月大的婴儿肠道微生物群没有其他主要影响(表1)3.)。

有证据表明，种族改变了脐带血25(OH)D与婴儿1个月和6个月时肠道微生物群α多样性指标之间的关联(表1)3.)。有证据表明，1个月时脐带25(OH)D水平和微生物均匀度之间存在种族特异性效应(相互作用)p= 0.016)，较高的脐带25(OH)D水平与较高的婴儿肠道均匀度相关，但仅适用于白人妇女(p= 0.044)。虽然有证据表明脐带25(OH)D在1个月时对丰富度有种族特异性影响(相互作用)p= 0.079)，较高的脐带25(OH)D仅在黑人中与丰富度呈负相关;在按种族分层的模型中，这种效应在统计学上不显著。种族也改变了6个月时脐带25(OH)D与婴儿肠道均匀度的关系(相互作用)p= 0.053);在黑人妇女中，较高的脐带25(OH)D与婴儿肠道均匀度降低有关(p= 0.025)，而白人儿童(p= 0.475)。

目前没有证据表明母乳喂养改变了母体或脐带25(OH)D和1或6个月婴儿肠道微生物群α多样性指标(所有相互作用)的关联p> 0.42)。

产前和脐带血维生素D与肠道菌群组成的关系

在调整种族因素后，产前(p= 0.029 (unweighted UniFrac)p= 0.030(加权UniFrac)和脐带25(OH)D (p= 0.028 (unweighted UniFrac)p= 0.044(加权UniFrac)水平与1个月的微生物群组成显著相关，尽管微生物群组成的变化只有一小部分是由母体或脐带维生素D解释的(表1)4)。经种族调整后，未发现产前和脐带25(OH)D水平与6月龄时微生物群组成之间存在显著关联4)。有证据表明，产前25(OH)D对1个月婴儿肠道微生物群组成(相互作用)有种族特异性影响p= 0.089)，与黑色(p= 0.006)，但白人女性(p= 0.375加权UniFrac)。没有证据表明目前的母乳喂养改变了母体或脐带25(OH)D与1或6个月婴儿肠道微生物群组成(所有相互作用)的关联p> 0.40)。

基于成分差异测试，在调整母亲种族后，进行个体OTU测试，仅将产前和脐带25(OH)D水平与1个月婴儿肠道OTU进行关联。1)。在1个月的样本中，共有6个otu与产前25(OH)D水平显著相关，11个otu与脐带25(OH)D水平显著相关。大多数显著otu与产前和脐带25(OH)D水平呈正相关(产前维生素D为4/6;3个OTU与产前和脐带25(OH)D显著相关:OTU 93 (不动杆菌)及OTU 210 (棒状杆菌属），它们与产前和脐带25(OH)D，以及OTU 64 (瘤胃球菌属gnavus)，与产前25(OH)D呈正相关，与脐带25(OH)D负相关。

在这个种族多样化的非选择出生队列中，我们发现了产前和脐带血维生素D水平与生命早期(~ 1个月)肠道微生物群相关的证据。相反，产前或脐带血维生素D与6个月大时测量的肠道微生物群没有关联。这项工作扩展了先前对母亲维生素D和婴儿肠道微生物组的研究[11，12并提供了脐带血维生素D水平与婴儿肠道微生物群之间关系的新数据。

虽然有些关联是独特的，但在1个月的肠道微生物群中有3个otu与产前和脐带血25(OH)D显著相关。产前与脐带血25(OH)D均呈正相关不动杆菌和棒状杆菌属辣子鸡;相比之下，瘤胃球菌属gnavusOTU与产前25(OH)D呈正相关，与脐带血25(OH)D呈负相关。与我们的发现相似，Lundgren, Madan [32发现不动杆菌剖宫产新生儿的粪便样本(收集于6周)与母亲乳制品摄入量呈正相关，假设增加的母亲乳制品摄入量与更高的维生素d有关。8发现老鼠体内有缺陷的维生素D受体与低死亡率有关Ruminococcaceae,这与我们在产前而非脐带血25(OH)D方面的发现一致。

只有另外两项研究将产前维生素D水平与婴儿肠道微生物组进行了比较。由913对母婴组成的KOALA荷兰队列研究评估了产前25(OH)D水平与预先定义的细菌分类群(双歧杆菌、大肠杆菌、脆弱拟杆菌、艰难梭菌和乳酸杆菌)在1个月大儿童的粪便样本中发现[11]。母体25(OH)D五分位数与血细胞计数呈负相关双歧杆菌属种类，但正相关的计数b . fragilis(11]。同样，产前25(OH)D水平在WHEALS中呈负相关双歧杆菌属品种在1个月。我们的研究使用16S rRNA V4测序，没有先验地针对特定的细菌分类群，与此相反，在KOALA队列中只测量了特定的细菌群，因此25(OH)D与该研究中未测量的其他肠道细菌之间的关系可能被遗漏。在一项对333对不同种族的母婴进行的研究中，脐带25(OH)D水平与维生素D水平升高有关Lachnospiraceae和非保密梭菌属的但是降低了Lactococcus(12]。与未入选的WHEALS队列相比，该人群由哮喘风险较高的儿童组成。

从机制上讲，维生素D可能通过几种机制影响肠道微生物群的结构和功能。维生素D受体敲除状态影响小鼠肠道和肠道微生物组的内稳态[j]7]。活性形式的维生素D(1,25-二羟基胆骨化醇)和维生素D受体敲除可以通过减少炎症间接影响肠道微生物群;肠道炎症为病原体提供了底物，使它们能够以牺牲更有益的细菌物种为代价增殖[8]。维生素D还可能通过上调先天免疫、通过巨噬细胞产生抗菌肽、维持肠道屏障功能以及通过改变钙和磷酸盐的吸收来影响肠道微生物群[33]。需要对维生素D影响肠道微生物群的潜在机制进行进一步的研究。

在目前的研究中，在不同的测量时间点上有一些不一致的发现。在怀孕期间，胎儿获得维生素D的唯一来源是母亲。然而，在出生后，儿童转而从阳光直射、膳食补充剂和食物(母乳喂养或配方奶喂养)中获取维生素D。2003年，在WHEALS出生前后，美国儿科学会建议，所有母乳喂养的婴儿，或非母乳喂养的婴儿，如果摄入的维生素D强化配方奶粉或牛奶少于500毫升，每天应摄入400国际单位的维生素D [34]。我们没有关于WHEALS儿童是否在生命早期补充维生素D的信息，因此我们无法解释这种潜在的产后因素。在WHEALS中，尽管产前和脐带血25(OH)D之间的关联很强(r= 0.75)，当母体25(OH)D低于某一阈值(< 15 ng/mL)时，相关性较弱(r= 0.16) [14]。这些发现表明，存在一个母体维生素D阈值，低于这个阈值，母亲可能无法充分贡献脐带血25(OH)D，这可以部分解释为什么产前和脐带血25(OH)D对婴儿肠道微生物群的影响不同。

我们发现了25(OH)D对婴儿微生物群的种族特异性影响的证据。研究表明，不同种族的人体内维生素D的含量不同，新生儿也是如此。35]。此外，黑人儿童产前与脐带血25(OH)D的相关性弱于白人儿童(r= 0.65和r= 0.87) [36]。与白人相比，黑人的25(OH)D水平较低可以由几个因素来解释。较深的皮肤色素沉着和厚度会降低皮肤中维生素D的产生水平，而维生素D是体内维生素D的主要来源[37，38]。一般来说，与白人相比，黑人在饮食中摄入的维生素D和奶制品较少[37]。这些种族差异也可以用遗传因素来解释。黑人的维生素D结合蛋白水平较低，这是一种血清运输蛋白，导致维生素D水平较低[38]。未来的研究需要更好地了解机制，包括遗传，饮食和/或文化因素，这可能解释为什么种族改变25(OH)D和婴儿肠道微生物群的关联。

鉴于我们发现母体和脐带血维生素D与1个月(而不是6个月)大的婴儿肠道微生物群之间存在关联，母体维生素D水平可能通过肠道微生物群以外的机制影响后代的长期健康。除了微生物组，母体维生素D可能影响儿童健康的其他机制包括抑制炎症[39]或表观遗传变化[40]。

除了对这些机制的未来研究外，未来的研究还应考虑将胎便作为生物标本用于测量肠道微生物组，以进一步研究母体维生素D水平和更接近播种时间的婴儿肠道微生物组的影响。

我们的研究有许多优点和局限性。我们的样本具有相当大的种族、教育和社会经济多样性，并且收集粪便样本的早期时间框架(1个月和6个月)允许早期检查婴儿肠道微生物组，可能在外部环境暴露(即饮食多样性)对组成产生重大影响之前。然而，粪便样本只在2个时间点采集;鉴于出生后肠道微生物群的快速发育，未来的研究应该在出生后的第一年收集更多的样本。我们没有婴儿出生后维生素D水平的数据也没有婴儿出生后服用补充剂的数据。然而，由于维生素D水平是在产前和脐带血中测量的，在收集粪便样本进行肠道微生物群测量之前，我们的结果不太可能是由于反向因果关系。分析样本中被纳入和被排除的参与者之间存在显著差异，因此我们的结果可能存在选择偏倚。

产前母体血液和脐带血25(OH)D水平与生命早期肠道微生物群有关。孕妇孕期维生素D水平与儿童健康(包括肥胖)有关[4]、过敏和哮喘[3.]。与维生素D类似，肠道微生物群影响人体健康和疾病，也被证明与肥胖有关[41]、过敏和哮喘[25]。未来的研究应该检查肠道微生物群是否介导维生素D和疾病之间的关联，或者肠道微生物群和维生素D是否可能相互作用，影响健康和疾病。

当前研究中使用和/或分析的数据集可通过通讯作者的合理要求和适当的批准获得。

25 (OH) D:

人体内25 -羟维生素D

OTU:

操作分类单位

SD:

标准偏差

鞭痕:

韦恩县健康、环境、过敏和哮喘纵向研究

不适用。

本研究由美国国立卫生研究院(R01 AI050681, R01 HL113010, R01 HD082147和P01 AI089473)和亨利福特医院基金支持。资助者没有参与研究的设计、数据的收集、分析或解释，也没有参与撰写论文。

作者及单位

1. 美国密歇根州底特律市福特广场5C号1号亨利福特医院公共卫生科学部，48202

   Zeinab Kassem, Alexandra Sitarik, Albert M. Levin, Suzanne Havstad, Christine Cole Johnson, Ganesa Wegienka和Andrea E. Cassidy-Bushrow

2. 美国加州大学旧金山分校医学系

   Susan V. Lynch, Kei Fujimura和Germaine J. M. Yong

3. 加拿大阿尔伯塔大学儿科学系

   安妮塔Kozyrskyj

4. 美国乔治亚州奥古斯塔市佐治亚摄政大学儿科变态反应与临床免疫学研究室

   丹尼斯·r·奥恩比

5. 美国密歇根州底特律韦恩州立大学城市应对环境压力研究中心

   Christine Cole Johnson, Ganesa Wegienka和Andrea E. Cassidy-Bushrow

贡献

ZK和ACB起草了手稿。AS进行了所有的分析。CCJ设计了最初的研究。所有作者都阅读、修改并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Andrea E. Cassidy-Bushrow．

伦理批准并同意参与

所有参与者提供书面知情同意书，研究方案由Henry Ford Health System机构审查委员会批准。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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