怀孕期间的感染发作，在特定的粘膜部位，增加人体初乳中特定的IgA1或IgA2亚型水平

背景

初乳是新生儿母体免疫球蛋白A (IgA)的主要来源。IgA参与新生儿黏膜免疫应答的保护和调节机制。一些研究评估了怀孕期间传染病和疫苗方案对母乳IgA水平的影响，目的是了解哺乳对新生儿的保护作用。然而，他们的大部分研究结果表明，总IgA水平没有差异。在人类中，IgA有两个亚类(IgA1和IgA2)，它们在黏膜间室中有解剖分布，它们的水平在抗原刺激后变化，也被认为是初乳中不同亲和力的描述。虽然IgA亚类在一些区域存在差异，但这些研究排除了特异性初乳IgA1和IgA2的测定。

方法

我们分析了墨西哥城900名女性的数据。通过Pearson相关，我们比较了她们怀孕期间与黏膜区室(皮肤、呼吸道和胃肠道)和初乳IgA亚类相关的感染发作次数。

结果

我们发现初乳IgA1水平增加与呼吸道和皮肤感染发作数之间存在相关性。相反，胃肠道感染与IgA2数量增加相关。

结论

我妊娠期间某些粘膜部位的感染会增加人初乳中特定IgA亚类的水平。这些结果将有助于了解感染和免疫对母体乳腺IgA的影响，以及它们对新生儿发育和保护的影响。

出生时，人类在一生中接触到最重要和最多样化的抗原接触。新生儿与各种微生物和环境分子相互作用，并学会区分共生菌群和潜在的病原体。这种相互作用被认为推动了急性感染的易感性窗口[1］．

通过初乳，新生儿在产后的前三天从母亲那里获得了最高数量的防御、刺激和发育分子。这些因子包括免疫球蛋白、细胞因子、趋化因子、生长因子等。[2，3.］．在这些分子中，初乳被认为是免疫球蛋白(Ig) A的主要来源[4，5］．通过哺乳，血清中的IgA被认为与新生儿健康的积极益处有关，其中包括对微生物的保护[6]，微生物群的选择[7]以及降低患慢性、炎症和过敏性疾病的风险[8，9］．

怀孕期间的母体免疫可诱导血清和分泌物(如乳汁)产生抗体[10，11，12］．一些对照临床研究评估了疫苗方案和怀孕期间传染病对初乳和乳汁IgA的影响[13，14］．他们的大部分研究结果已确定初乳和乳中IgA水平与怀孕期间感染发作次数无关，在某些情况下也提供了相互矛盾的信息[15，16，17，18］．

在人体中，IgA存在于两个亚类(IgA1和IgA2)中，这些IgA在不同的粘膜束中有不同的分布。它们的分泌物也会根据在这些组织中趋化因子和整合素表达期间浆细胞被招募的位置而变化[19］．IgA1主要存在于上呼吸道、皮肤、血清和唾液中;相比之下，IgA2在小肠和大肠中更丰富。抗原刺激后，远端粘膜区室IgA亚类增多，其分泌物因诱导部位不同而不同[20.］．Ladjeva等人[21]在他们的研究中描述了18个初乳样本中IgA1和IgA2亚类分布的显著个体差异。他们还分析了IgA对多糖和蛋白质的反应性。IgA1和IgA2都对脂多糖有反应，但IgA1对蛋白质有特异性。然而，很少有其他研究也分析了感染发作对初乳IgA亚类水平的影响。

因此，我们的研究主要旨在评估妊娠期间感染对初乳IgA亚类水平的影响。使用定量酶联免疫吸附试验(ELISA)技术测量了墨西哥城900名妇女的初乳Ig同型，重点是IgA1和IgA2水平及其与粘膜感染发作(IE)数的关系。

人口规模计算(n)

人口规模(n)值的计算考虑了墨西哥城抽样期间的出生数量，根据国家研究所Estadística, Geografía e Informática (INEGI)， 95%置信区间(Z = 1.96)， 5%误差，同时考虑到孕妇人群中的传染病发病率。

人口选择

本研究为分析性、横断面和相关性研究。这项研究包括900名临床健康的孕妇(表2)1)在墨西哥城三家不同医院之一分娩的产妇:10月1°ISSSTE地区医院(HR 10月1°，21%)、伊斯塔帕卢卡地区医院(HRAEI, 40%)或la Mujer医院(HMuj, 38.77%)。所有程序都向签署了《赫尔辛基宣言》(2013年)修订版同意书的妇女、亲属或丈夫进行了解释[22］．通过个人访谈和临床研究评估，从每位患者获得了与怀孕期间皮肤、呼吸道、胃肠道或泌尿生殖道感染发作相关的临床信息。个人临床报告中描述的信息在抽样阶段通过他们的访谈获得的数据进行验证。

纳入和排除标准

这项研究包括14至46岁的妇女，足月妊娠(38-42周)，阴道分娩(VD)或剖宫产(C-section)和单品分娩。排除标准包括产妇有慢性疾病、流产史、早产、多产、接受激素治疗或在分娩前三周诊断出急性疾病的妇女。

样品收集

所有样本都是在2016年7月至2017年8月期间从产后72小时内的母亲身上收集的。使用无菌管(Round-Bottom Polypropylene tubes with Caps, Stemcell Technologies©Vancouver, Canada)从每位患者身上获得两毫升初乳，并在冰上运往实验室。随后，这些样品在4°C下以350 g离心10分钟(Allegra™X-22R Benchtop离心机Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, USA)，水相与脂质相及其细胞成分分离。然后水相在4°C下以2000 g重新离心30分钟，并冷冻，在−70°C保存，直到进一步使用。

总免疫球蛋白(总Ig)的定量

采用ELISA法测定初乳IgA、IgA1、IgA2、IgM和IgG浓度。96孔板(免疫板MaxiSorp, Thermo Scientific, NY, USA, Cat。Num. 1132249)转染100 μL捕获单克隆抗体(小鼠抗人Ig轻链，Abcam®，Cambridge, UK, Cat)。1 μg/mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中Num. ab1942)， 4℃孵育过夜。在每个反应步骤之间，用200 μL 0.5%聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯(Tween 20, Sigma-Aldrich Company®，USA, Cat)清洗板。编号9005-64-5)在PBS (PBS- t)中重复8次。用1%牛血清白蛋白(BSA, Sigma-Aldrich Company®，USA, Cat)阻断非特异性结合自由位点。编号9048-46-8)用PBS-T稀释(每孔200 μL)，在37℃孵育30 min。样品按1:100、1:100和1:100 000的比例连续稀释。对于标准曲线100μL of IgA1(人蛋白IgA1, Abcam®，Cat。n . ab91020)， IgA2(人蛋白IgA2, Abcam®，Cat。编号. ab91021)， IgM(人蛋白IgM, Abcam®，Cat。编号:ab91117)或IgG(天然人IgG, Abcam®，Cat。加入标准溶液，37°C孵育2 h。特异性Ig同型检测:100 μL /孔生物素化抗体抗iga(兔多克隆抗体，Abcam®，Cat。编号. ab97218)，抗iga1(小鼠单克隆抗体，Abcam®，Cat。Num. ab99796;1:2500)，抗iga2(小鼠单克隆抗体，Abcam®，Cat。Num. ab128731; 1:2000), anti-IgM (monoclonal mouse antibody, Abcam® Cat. Num. ab49655) and anti-IgG (goat anti-human, Invitrogen®, Massachusetts, MA, USA, Cat. Num. 81–245,062) were added and incubated in the same experimental conditions. Later 100 μL streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) complex (Streptavidin HRP, Abcam®, Cat. Num. ab7403) dilution was added and incubated for 1 h at 37 °C. The presence of labeled antibodies was revealed using 100 μL /孔显色底物3’3″- 5-5-5 -tetramethylbenzidine (TMB ELISA底物，Abcam®，Cat。Num. 171523)，每孔加100 μL 0.2 M硫酸终止反应。在此之后，在分光光度计Microplate ELISA平板阅读器(Sunrise, Tecan®TX, USA)中测量450 nm的吸光度。分别获得各平板的IgA、IgA1、IgA2、IgM或IgG标准曲线，通过吸光度插值法和稀释因子法确定各样品浓度。结果最终以每毫升初乳Ig同型总毫克(mg/mL)表示。

分泌性免疫球蛋白(SC-Ig)的定量分析

ELISA法测定初乳中SC-IgA总浓度。96孔板涂布100 μL抗人IgA (monoclonal antibody, Abcam®，Cat)抗体。Num. ab7400)在PBS中培养，4℃孵育过夜。清洗、封堵、实验样品加入与上述步骤类似。用于标准曲线的是纯化的人初乳IgA(来自初乳的天然人蛋白IgA, Sigma-Aldrich®MO, USA, Cat。编号I1010)。特异性SC-Ig检测，100μL的生物素化抗体抗sc(山羊多克隆抗体，Lifespan Biosciences®，华盛顿，华盛顿州，美国，猫。Num LS-C185086;每孔加入1:8000)的PBS，在37°C下孵育1小时。结果以每毫升初乳中SC-Ig的mg数表示。

统计分析

妊娠期感染数与初乳Ig水平的相关性由Pearson秩相关系数确定。计算各组数据的平均值和95%置信区间。Ig浓度分布采用Kolmogorov-Smirnov检验。两组资料Ig浓度比较采用非参数Mann Whitney U检验，多组资料采用Kruskal-Wallis检验。所有统计测试和图形使用统计程序GraphPad Prism (GraphPad®Software version 7, La Jolla, CA, USA)开发。

人口数据

900名健康妇女，分娩时平均年龄为24岁，被纳入这项研究。50%的产妇通过VD分娩，其余产妇通过剖腹产分娩(49.33%)。第一个孩子占44%，第二个(31.89%)，第三个(16.22%)，其余(7.56%)被认为是多胎妇女。总人口的47%为怀孕期间未登记感染发作的妇女(H组)，总人口的53%为怀孕期间至少有一次与呼吸道、胃肠道或尿道或皮肤相关的感染发作的妇女(IE组;表格1)．

人类初乳中IgA亚类水平

通过比较不同类型的IgA (IgA、SC-IgA、IgA1和IgA2)与其他类型的Ig (IgG和IgM;额外的文件1:图S1)。初乳Ig水平均无正态分布。利用以往研究的结果[23，24]，我们确定IgA是初乳中的主要同型。本研究报道初乳中IgA2(平均= 11.87±2.904 mg/mL)浓度略高于IgA1(平均= 9.893±1.577 mg/mL)。与IgA相比，IgG和IgM浓度较低(IgG = 1.509±0.8227,IgM = 2.643±0.761;额外的文件1:图S1(一))．初乳中IgA总水平(IgA平均值= 24.76±3.472 mg/mL)有助于得出47.61%对应于IgA2, 39.95%对应于IgA1(补充文件)1:图S1(b))。大多数人初乳IgA(90.75%)与SC相关(SC-IgA平均= 22.47±3.15 mg/mL)。

IgA亚类水平在人群描述符之间没有表现出差异

许多描述符在识别所分析人群的特征方面发挥了关键作用。包括以下描述符:

• 招募母亲的医院(HR 1°，HRAEI和HMuj;额外的文件2:图S2(一个))。

• 给药方法:检查不同给药方法之间的生理变化是否会影响结果(附加文件2:图S2(b));

• 产后期:也评估了这一变量，因为蛋白质功能在初乳中随着时间的推移而下降(附加文件2:图S2(c));

• 母亲年龄和分娩次数:年龄和分娩次数(第1胎或单胎，第2胎、第3胎、第4胎或多胎)也被评估，以检查结果是否随年龄变化，或多胎妇女的Ig水平是否与单胎妇女不同(附加文件)1:图S2(d、e))。

各组间IgA亚类水平比较数据无统计学差异。因此，对于描述符结果，我们得出结论，Ig水平独立于用于研究人群分层的描述符。

妊娠期IE患者初乳IgA亚类水平不同

先前的研究报道，初乳中总IgA与怀孕期间感染发作的相关性没有统计学差异。然而，妊娠期IgA亚类的定量及其与IE的关系仍未见报道。因此，随后比较H组和IE组初乳IgA亚类的数量。结果显示，各组间IgA、IgG和IgM水平无明显差异。然而，与H组相比，IE组初乳IgA1和IgA2浓度似乎存在差异(图2)。1)．

H组和IE组间特征的数据分层显示，两组间Ig水平无差异(附加文件3.:图S3)。因此，从这一点来看，分析仅限于评估两组间初乳中的Ig浓度。

在特定的粘膜感染发作增加初乳IgA1或IgA2浓度

接下来，我们确定了初乳IgA亚类在皮肤、粘膜区室和泌尿生殖道相关感染发作次数功能中的浓度差异。结果表明，在呼吸道有感染发作的妇女具有较高水平的初乳IgA1 (H_集团= 9.851±1.569 mg/mL，即₁= 9.925±1.623 mg/mL，即₂= 11.87±2.971 mg/mL，即_3.= 10.43±2.09 mg/mL和IE_{4个或以上}= 12.28±2.174 mg/mL;无花果。2(a))。当感染发作也与皮肤相关时，也记录了类似的行为_集团= 9.851±1.569 mg/mL，即₁= 10.54±0.6067 mg/mL，即₂= 12.71±1.405 mg/mL和IE_{3个或以上}= 15.95±1.864 mg/mL;无花果。2(b))。与之形成鲜明对比的是，IgA2浓度随着胃肠道感染数量的增加而增加(H_集团= 9.851±1.569 mg/mL，即₁= 11.69±3.145 mg/mL，即₂= 12.84±2.594 mg/mL，即_3.= 13.43±2.256 mg/mLIE₄= 14.87±1.359 mg/mL和IE_{5个或更多}5个以上IE = 16.16±0.9687 mg/mL;无花果。3.(a))。然而，在与泌尿生殖道相关的感染发作病例中，与H组相比，IgA1和IgA2的浓度从未显示出任何变化(图2)。3.(b))。

根据这项研究结果，我们发现怀孕期间感染发作的次数影响特定IgA亚类的浓度。然而，解释这些差异的可能机制并没有被研究。解释这一研究结果的机制可能与妊娠期间IgA亚类前体细胞(IgA+ PC)从诱导位点迁移到乳腺有关。

在荷尔蒙调节下[25]，孕激素允许趋化因子(C-C基序)配体25 (CCL25)和CCL28的表达，而这反过来被认为增加了粘膜血管地址细胞粘附分子1 (MadCAM-1)的产生，并在怀孕的最后三个月在乳腺内皮上更高的表达。趋化因子受体和特定的整合素，如整合素α -4/ β -7 (α4β7)表达，可能允许IgA2+ PC细胞迁移到乳腺腺泡并在那里停留直到泌乳[26，27］．同时，雌激素可诱导和增加乳腺血管细胞粘附蛋白1 (VCAM-1)的产生，从而促进IgA1+ PC细胞的产生，并表达整合素α4β1。

妊娠期IE的发生会增加初乳中Ig的含量，这是由于每次感染发作的累积效应。在对感染的反应中，IgA1+或IgA2+ pc的产生和迁移依赖于粘膜区室的诱导位点[28，29］．呼吸道和皮肤是IgA1产生高于IgA2的部位[30.];同时，IgA2是胃肠道中比例较高的亚类[31］．

泌尿生殖道被认为是免疫反应的一个效应位点，没有抗体分泌细胞显著地再循环到远端组织。在这个粘膜的抗原刺激不允许再循环的分泌细胞到其他效应位点。只有感染期间产生的细胞数量增加，才有利于特定IgA亚类分泌细胞的到达。这一特征可能有助于解释泌尿生殖道IE患者初乳IgA亚类没有差异[32]，尽管这一发现还需要进一步的研究。

统计相关性并不一定意味着数据之间的因果关系。结果仅表明机制之间存在密切关系，因为生物过程更为复杂，可能涉及两个以上的可变因素[33］．为了证明因果关系，还需要更多的研究。作为一项临床研究工作，目前的研究存在着重要的局限性:它是基于母亲在怀孕期间记忆和报告的感染发作发生率，没有考虑其他流行病学特征，如怀孕时间延迟、持续时间和感染病原学。为此，有必要进行更系统的临床研究，以证明妊娠期间的感染与其在生命最初阶段母亲和婴儿特定IgA亚类的母体转移中的作用之间的相关性。

这项研究结果提供了一些证据和额外的信息，有助于解决有关怀孕期间感染对母亲和初乳中Ig诱导影响的争议数据。这一结果有助于在怀孕、分娩和/或出生后建立更好的疫苗接种计划，以诱导和改善对母亲和新生儿的保护。

研究结果有助于为了解怀孕期间感染的影响提供证据。因此，同样的结果也可以提示特定IgA亚类的生产可能对新生儿保护产生的影响。本研究提供了妊娠期妇女感染发作影响初乳中IgA1和IgA2水平的实验证据。

剖腹产:

剖腹产

ELISA:

酶联免疫吸附试验

即:

传染性事件

IgA:

免疫球蛋白的

IgA1:

免疫球蛋白A亚类1

IgA2:

免疫球蛋白A亚类2

INEGI:

Instituto de Estadística, Geografía e Informática

ISSSTE:

国家教育和社会服务研究所

VD:

经阴道分娩

作者要感谢参与这项研究的女性。作者还感谢Zeltzin Arisvet Mendoza-Juárez和Maria Inés Valdivia-Hernández分别在HRAEI和HR 10月1°进行了初乳取样过程。

资金

这项研究得到了墨西哥国家科学委员会Tecnología (CONACYT) (PDCPN 2015/900)向LSA和墨西哥国立大学(iit) (IA206117)向JCAM的资助。ESS获得了CONACYT奖学金(592631)。

数据和材料的可用性

本研究中使用和分析的数据集可按要求从通讯作者处获得。

作者及隶属关系

1. 墨西哥墨西哥城，国家理工学院(IPN)分子生物医学系，研究与高级研究中心(CINVESTAV)

   Erick Sánchez-Salguero, Geovanni Kaleb Mondragón-Ramírez, Héctor Romero-Ramírez & Leopoldo Santos-Argumedo

2. 墨西哥墨西哥城，国立理工学院Milpa Alta分部(CICSUMA)健康科学跨学科中心

   Geovanni Kaleb Mondragón-Ramírez

3. 墨西哥国立自治大学萨拉戈萨高等学院，墨西哥墨西哥城伊斯塔帕卢卡高等专科区域医院

   胡里奥·C. Alcántara-Montiel

4. 墨西哥国立自治大学(UNAM)，墨西哥墨西哥城，医学院，医学联合研究计划(PECEM)

   阿图罗Cerbulo-Vazquez

5. 墨西哥墨西哥城卫生部妇女医院

   Arturo Cérbulo-Vázquez & Xóchitl Villegas-Domínguez

6. 墨西哥墨西哥城，国家工作人员安全和社会服务研究所(ISSSTE) 10月1号地区医院妇科和基因组医学系

   Víctor曼努埃尔·孔特雷拉斯-巴尔加斯和María德尔Rocío汤普森-博尼拉

贡献

ESS进行实验，分析数据，解释结果并撰写手稿。GKMR负责样本采集、临床信息收集和数据分析。JCAM, ACV, XVD, VMCV和MRTB监督初乳的取样，提供临床信息并在其机构中注册方案。HRR提供了技术帮助。LSA构思并设计了这项研究，撰写并修改了最终版本的手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到莱奥波尔多Santos-Argumedo．

伦理批准并同意参与

该研究方案已于10月1日HR(编号090201/14.1/086/2017)、HRAEI (FESZ/DEP/CI/163/16)和HMuj (HM-INV/ 2016-015)批准。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者没有报告任何潜在的利益冲突。

出版商的注意

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