两个不同实验室圆锥生物测定结果的比较按蚊蚊作拟除虫菊酯杀虫剂处理蚊帐的质量保证

背景

提供给疟疾流行国家的驱虫蚊帐的质量保证是通过测量理化参数进行的，而不是对疟疾蚊子的生物功效。本研究探讨了锥体生物测定法在拟除虫菊酯itn分娩前质量保证中的效用，以检验锥体生物测定法在不同地点、不同蚊子品系和不同实验室的一致性假设。

方法

对4个品牌的20个未使用的拟除虫菊酯驱虫蚊帐(100网，每网5个子样本)进行了双盲生物测定，这些蚊帐已交付巴布亚新几内亚大规模分发，并通过了发货前检查。根据世界卫生组织(世卫组织)的指导方针，巴布亚新几内亚医学研究所(PNGIMR)使用拟除虫菊酯易感物，在相同的网片上进行锥形生物测定按蚊farauti美国这篇(轮上.)和在坦桑尼亚伊法卡拉卫生研究所(IHI)使用易感拟除虫菊酯冈比亚疟蚊轮上．此外，在IHI对未达到锥生物功效阈值的itn进行了世卫组织隧道试验。采用Spearman秩相关、Bland-Altman (BA)分析和一致性分析对IHI和PNGIMR结果进行比较。对利用锥生物法检测未使用拟除虫菊酯ITNs的文献进行了综述。

结果

在圆锥生物测定中，IHI的13/20网(65%)和PNGIMR的8/20网(40%)符合世卫组织生物有效性标准。所有蚊帐都符合世卫组织在IHI进行的锥形/隧道联合试验的生物效能标准。IHI和PNGIMR的结果与60分钟敲除(KD60)相关(r_年代= 0.6,p= 0.002,n = 20)和24小时死亡率(M24) (r_年代= 0.9,p< 0.0001,n = 20)，但BA结果之间存在系统性偏差。在IHI和PNGIMR结果有差异的5个蚊帐中，有3个的置信区间重叠80%的死亡率阈值，平均值在阈值的1-3%以内。包括这些作为通过，预测ITN失效的结果之间的一致性很好，kappa = 0.79(0.53-1.00)和90%的准确性。

结论

基于这些研究结果，WHO锥生物测定法对> 80% M24的itn是一种可重复的生物测定法，并且对所有itn都考虑了固有的随机变异和系统偏差。文献综述证实，以前所有拟除虫菊酯itn(未洗涤)均已达到世卫组织锥生物测定生物药效标准，无需进行额外的隧道试验。80% M24阈值仍然是使用拟除虫菊酯易感蚊判断拟除虫菊酯ITN质量的最可靠指标。在没有替代试验的情况下，锥形生物测定法可作为产前质量保证的一部分。

拟除虫菊酯驱虫蚊帐是为控制疟疾病媒而建议的公共卫生干预措施之一[1]并估计在2000年至2015年期间在非洲预防了超过4.5亿例疟疾病例[2］．而对杀虫剂的抗药性[3.]及蚊子的行为改变[4]是有助于降低拟除虫菊酯驱虫蚊帐有效性的因素，但它们仍可提供高度的保护[5，尤其是在按蚊在巴布亚新几内亚，蚊子仍然易受拟除虫菊酯的影响[3.，6］．

重要的是提供有效的驱虫蚊帐，以保护那些面临蚊虫叮咬和疟疾风险的人。为保证在疟疾流行国家分发的驱虫蚊帐的有效性，有必要对驱虫蚊帐的质量进行独立的交付前质量保证(QA)和交付后业务监测[7］．发货前，检查ITN产品规格，包括ITN杀虫剂含量。分娩后、ITN杀虫剂含量、生物功效、物理完整性和ITN存活率是用于ITN质量监测的指标[8］．生物功效是对ITN产品在实验室条件下诱导死亡、击倒(亚致死丧失能力)或防止蚊子吸血的能力的测量。实验室化验的最低生物功效阈值[8]，已设定在实验性棚屋试验中测量的水平[9]，这是根据在非洲进行的临床试验估计的，当时蚊子媒介仍易受拟除虫菊酯的影响[10］．因此，为驱虫蚊帐制定的蚊子死亡率基准不仅是为了确保对使用者的个人保护，也是为了驱虫蚊帐杀死足够的蚊子以提供社区保护[11］．

在实验室条件下，利用锥状生物测定和隧道试验对拟除虫菊酯ITN的生物有效性进行了实验评估[8］．生物疗效评价可确保对易感病媒的可能影响[8，12，13，14］．新的或未使用的拟除虫菊酯itn应符合世界卫生组织(世卫组织)的标准生物功效标准，即在60分钟内≥95%的蚊子击倒率(KD60)和/或在24小时内≥80%的锥形生物测定死亡率(M24) [8］．许多研究表明，新的或未使用的拟除虫菊酯itn在这两种或其中一种生物功效端点上的表现通常为100% [15，16，17，18，19，20.，21，22，23，24，25，26］．锥生物测定法的实用之处在于它们可以估计出杀虫剂的微小变化[18]和生物功效[27，可以告知干预措施的有效性。对于无法达到锥状生物功效标准的拟除虫菊酯驱虫蚊帐，采用世卫组织隧道试验进行第二次评价，该试验是为评价使用具有兴奋驱蚊作用模式的杀虫剂处理过的驱虫蚊帐而设计的，例如氯菊酯或乙菊酯[28］．然而，在现实中，隧道试验用于所有itn，而不管活性成分的作用方式。WHO隧道试验的性能阈值是诱导≥90%的供血抑制(BFI)和/或≥80%的M24。

ITN质量保证目前采用理化测试[29，假设产品性能是可预测的，基于在交付前检验中测量的产品规格。现有证据表明，绝大多数驱虫蚊帐在分发给家庭时可能含有足够的杀虫剂[30.］．虽然这是令人鼓舞的，但应该记住，分娩前检查测量的是蚊帐纱的总化学成分，而落在蚊帐上的蚊子只暴露在表面的杀虫剂中。KD60或M24的生物功效终点对杀虫剂表面浓度的微小变化非常敏感，产品之间，有时产品内部的杀虫剂表面浓度可能不同，尤其在itn暴露于高温时可能发生变化[31，32］．已有研究表明，杀虫剂的总含量并不总是与生物功效相关[33］．

ITN生物功效的差异可能是由于蚊帐内活性成分的空间呈现和/或分布的差异，或作为制造过程一部分的表面处理。驱虫蚊帐由聚酯或聚乙烯制成，须进行精心的产品设计和质量控制的制造，以确保有效成分在产品的使用期内具有足够的生物利用度[31］．普遍认为，QA迫切需要一种经过验证、低成本、易于实施的实验室方法来评估表面AI内容[30.］．然而，表面浓度的化学测定，如聚氰菊酯现场试验和化学测定，如高效液相色谱和气相色谱与质谱联用，尚未发现与生物功效结果很好对应[34］．

为了确保成功控制疟疾，有必要在产前检查和/或分发前确认itn的生物功效。锥生物测定法仍然是测定拟除虫菊酯ITN生物功效的标准[8，35]，因为这是一种简单而具成本效益的方法[21］．建议在分发蚊帐前使用锥生物测定法例行评估蚊帐，并用于常规处理蚊帐的质量控制[36，37]，并在世界卫生组织除害剂评估计划第十次会议上提出建议[35］．然而，世卫组织第11次会议报告的结论是，"世卫组织标准生物测定法不能在全世界用于质量控制目的，因此必须改用理化试验" [13］．最近一份“为全球基金编写的ITN生物功效报告”建议对ITN装运前和装运后的质量进行生物功效检测[30.］．即便如此，当锥生物测定结果不同时，其可变性仍存在一些争议按蚊物种。理想情况下，一项稳健的试验应能在不同的测试设施对同一净样品与各种不同的样品进行可重复的生物功效结果按蚊特别是具有类似拟除虫菊酯敏感性水平的菌株。锥生物测定结果是否受系统偏差的影响，目前尚不清楚按蚊物种使用。

本研究探讨了锥体生物测定在两个使用不同的测试设施的产前质量保证中的效用按蚊物种，以测试锥生物测定方法在不同地点、不同蚊株和不同实验室之间是否一致和可重复性。还对锥生物测定法在未使用拟除虫菊酯杀虫剂杀虫剂检测中的应用进行了文献综述，以收集使用锥生物测定法对新使用或未使用的拟除虫菊酯杀虫剂杀虫剂测定的平均生物功效值的额外信息。

研究设计

通过世卫组织锥生物测定法对拟除虫菊酯ITN的生物功效进行了双盲比较。根据世卫组织准则，在实验室条件下评估了通过产前检查的4个品牌的20个未使用的拟除虫菊酯驱虫蚊帐(100个子样本，即每网5个子样本)[8］．ITN亚样本首先采用世卫组织锥生物测定法进行评价，那些不符合世卫组织锥生物测定性能标准(≥95% KD60或≥80% 24小时死亡率)的亚样本按照标准程序在IHI采用世卫组织隧道试验进行检测[8］．

测试设施

这些实验是在巴布亚新几内亚医学研究所(PNGIMR)的病媒传播疾病单元(VBDU)和坦桑尼亚Ifakara卫生研究所(IHI)的病媒控制产品检测单元(VCPTU)进行的，该单元已获得良好实验室规范(GLP)认证，南非国家认可体系(SANAS) G0033 [38］．

五种产品(矩形网)被纳入研究(附加文件1)．

1. 我。

   申请人^®2.0，蓝色多丝聚酯，75旦，涂1.8克/公斤(55毫克/米)²)溴氰菊酯，由越南Vestergaard于2019年生产;

2. 2

   申请人^®2.0，黄色多丝聚酯网，75旦涂1.8克/公斤(55毫克/米)²) 2012年生产的溴氰菊酯(生产地点未在标签上注明);

3. 3

   拦截器^®，一种蓝色多丝聚酯网，100旦，涂有5克/公斤(200毫克/米)²)甲氯氰菊酯，由泰国巴斯夫于2020年生产;

4. 4

   SafeNet^®，一种蓝色复丝聚酯网，100旦，涂有5克/公斤(200毫克/米)²甲氯氰菊酯(2019年和2020年生产，标签上未注明生产地点);

5. v。

   Yorkool^®一种蓝色复丝聚酯网，75旦，涂有1.8克/公斤(55毫克/米)²)溴氰菊酯，由中国天津约克库尔国际贸易有限公司于2019年生产。

阴性对照网:未处理的SafiNet^®由坦桑尼亚的A到Z纺织厂和未经处理的宝美生产^®在IHI和PNGIMR中分别使用了中国生产的net。

的申请人^®2.0于2012年生产(PermaNet^®2012年)通过在巴布亚新几内亚的大规模分发运动，于2012年分发了蚊帐。2012年至2018年期间，这些未开封包装的驱虫蚊帐在热带温度和湿度下存放在马当省卫生局的一个仓库中。2018年，这些蚊帐被转移到PNGIMR的一家商店，保存在27°C左右。其他itn，即永久网络^®2.0于2019年生产(PermaNet^®2019),拦截器^®, SafeNet^®和Yorkool^®在抵达巴布亚新几内亚后立即从集装箱中收集，并在分发之前储存在约27°C的PNGIMR储藏室中。

采样的itn在PNGIMR上从001到020连续标记。从这些网中，切割了5个网片样本(25 cm × 25 cm)。从位置1到5切割样本，如图5所示(图5)。1) [8］．这些网在PNG进行了测试，然后同样的部件被送到IHI进行测试。因此，在坦桑尼亚的PNGIMR和IHI各测试了100个网片。每网的5个子样品都有独特的代码，分别为A、B、C、D和E，分别用铝箔包好，保存在温度控制在4℃的冰箱中。

分样品于2020年12月从PNGIMR收到IHI，并立即用新铝箔包装，储存在4℃的温控冰箱中。在研究结束前，项目调查员和设备技术人员对产品的身份一无所知。在所有实验完成并输入数据后，PNGIMR锥生物测定的数据被发送到IHI，并将盲法披露给IHI的研究人员，以匹配每个净样品的结果并进行分析。

坦桑尼亚

未生育的雌性拟除虫菊酯易感冈比亚疟蚊美国这篇(轮上.) (Ifakara品系);在锥体生物试验中3-5天龄饲养的糖饲料，在世卫组织隧道试验中5-8天龄饲养的糖饥饿6-8小时。蚊群按MR4指引维持[39]在27±2℃，相对湿度40%-100%，环境(约12小时:12小时)明暗循环。幼虫饲喂四曲明鱼片，成虫自由饮用10%蔗糖溶液和牛血产卵。

PNG

未生育的雌性拟除虫菊酯易感按蚊farauti轮上。使用;糖饲喂，在2-5天龄之间在圆锥生物测定。菌落维持在28±4°C和68±25%的相对湿度，大约11 h的黑暗和12 h的光照周期，包括30 min的黄昏和30 min的黎明。幼鱼被喂食地面鱼片(海洋大师热带鱼片，澳大利亚)。为成虫提供10%的蔗糖液和人血供其产卵。

在每个25厘米× 25厘米的网片上，四个标准的世卫组织锥固定在塑料锥板上，切割孔并以60°角固定[40在坦桑尼亚的IHI(图4)。2A)最大化空间和蚊子与ITN的接触，并放置在45º的板上[8在PNGIMR(无花果。2B).网片从冰箱中取出，在室温下保存2小时后进行测试。5只实验室饲养的易感蚊子被放置在每个锥体中3分钟后，用口腔吸入器轻轻地将蚊子从锥体中取出，保存在分别标有标签的纸杯中，每个锥体一个。在保持期间，给蚊子提供10%蔗糖溶液湿润的棉絮。在5个蚊帐片上每片重复5只蚊子，使每个蚊帐共暴露100只蚊子。测量的终点为KD60和M24。暴露于未经处理的蚊帐片(阴性对照)的蚊子在每个重复的同时进行检测，以监测生物测定的质量。生物测定和保存期在坦桑尼亚27±1°C、55%-82%相对湿度和巴布亚新几内亚28±4°C、53%-71%相对湿度条件下进行。如果阴性对照中M24超过10%，则重复试验2)如果阴性对照的死亡率等于或低于10%，则使用“雅培公式”对结果进行调整[8］．

世卫组织隧道试验只在坦桑尼亚国际卫生研究所进行，因为目前在PNGIMR没有建立隧道试验(表1)．在不符合世卫组织锥体生物测定效力标准的五个蚊帐亚样本中，有两个被选择用于世卫组织对易感病毒的隧道试验一个。冈比亚按蚊的轮上。根据世界卫生组织的指导方针，这些亚样本的死亡率最接近圆锥生物测定法的平均死亡率。根据世界卫生组织的指引进行隧道试验[8］．5-8日龄、糖饥饿6-8小时、不供血喂养的初产母鼠被放入长度为60厘米的玻璃隧道中。在隧道的两端，安装了一个25平方厘米的蚊帐，上面盖着聚酯网。在三分之一的长度处，贴上25厘米× 25厘米的网样样本。蚊子“可利用”的蚊帐表面为400厘米²(20厘米× 20厘米)，孔直径9 × 1厘米:1孔位于方形中心;其他八个是等距的，位于距离边界5厘米处。在隧道较短的部分，一只背部剃毛的小兔子被放在一个网状隧道中作为诱饵。每只兔子在用作诱饵后休息3天以上，以确保福利。在较长的隧道末端的笼子中，于21:00引入100只雌性蚊子。次日上午09:00，用口腔吸入器将蚊子取出，并在隧道的每一段单独计数，记录死亡率和吸血率。蚊子被放置在纸杯中，并提供蘸有10%糖溶液的棉絮。M24于翌日9时左右录得。暴露于未经处理的蚊帐片的蚊子作为对照，以监测生物测定的质量。生物测定和保存时间在27ºC±2°C和60%-100%相对湿度下进行。总死亡率是通过收集隧道两段的蚊子死亡率来衡量的。 Acceptable feeding success and M24 in controls were > 50% and < 10%, respectively. Any tests that did not achieve the specified control cut off were repeated, all results were adjusted for control mortality using Abbott’s formula [8］．

根据世卫组织准则，每个被测试产品的样本量为4个蚊帐[8]以测试itn。科恩kappa的事后功率分析表明，有90%的统计功率可以检测到设施之间高达20%的差异[41］．

使用纸质数据收集表记录数据，并在Microsoft Excel中重复输入^®．数据分析使用Stata^®Stata统计软件:版本14。德克萨斯州大学城:StataCorp)。比例KD60和M24，或BFI和M24以其各自的95%置信区间(CI)的算术平均数表示。每个网的通过或不通过是根据WHO标准疗效标准计算的，即锥试验≥95% KD60和/或≥80% M24, WHO隧道试验≥90% BFI和/或≥80% M24。然而，我们也认为WHO锥生物测定法的80% M24和95% KD60阈值受随机变化的影响。如果按照世卫组织指南，每蚊帐使用100只蚊子进行检测，我们预计在80%死亡率阈值附近的检测固有95% CI为71%和87%，在95% KD60阈值附近的95% CI为89%和98%。itn的平均值低于生物功效阈值，但95% ci超过95% KD60或80% M24的生物功效阈值的itn也被归类为合格。

采用线性回归分析KD60与M24之间的关系。斯皮尔曼秩相关系数(r_年代)，以估计IHI与KD60和M24的PNGIMR锥生物测定结果之间的相关性程度。Bland-Altman方法(42]用于评估来自IHI和PNGIMR测试设施的KD60和M24的单个测量之间的一致性。Cohen 's kappa (κ)用于评估各设施之间的一致性程度，以预测蚊帐是否通过或未达到WHO锥生物测定阈值标准。

由于本研究的蚊帐数量有限，因此有必要对未使用的拟除虫菊酯蚊帐的锥生物测定法进行文献综述。该文献综述的目的是调查世卫组织锥状生物测定法用于检测新的未洗拟除虫菊酯itn的频率，以及锥状生物测定法是否被认为是一种适合于此目的的方法。2021年10月，在PubMed和PubMed Central网站上使用关键词“生物功效”或“锥状生物测定试验”和“隧道试验”或“杀虫剂处理过的蚊帐”和“长效杀虫蚊帐”和谷歌Scholar网站使用关键词“WHOPES工作组会议”，对2001年至2021年发表的关于ITN功效研究、耐久性研究或WHOPES规范报告的文献进行了搜索。

总的来说，文献搜索确定了2362种书名(PubMed: 87种书名，PubMed Central: 1604种书名，谷歌Scholar: 671种书名)。使用世卫组织关于未使用拟除虫菊酯itn的标准评价方法进一步筛选报告标题按蚊报告KD60和M24的蚊子。这导致70份出版物得到全面筛选，60份列入最后的选择。从选定的出版物中提取的数据包括ITN类型(品牌名称、有效成分、生产工艺、生产日期或年份、批次/批号)、生物测定结果(主要是KD60和M24)、按蚊在生物测定中使用的菌株以及研究进行的时间和地点。

未使用的itn对易感菌的生物功效一个。冈比亚按蚊在坦桑尼亚易感一个。farauti在PNGIMR

在坦桑尼亚国际卫生研究所，13/20蚊帐(65%)满足世卫组织锥生物测定生物有效性标准≥95% KD60和/或≥80% M24。7个未达到锥生物测定标准的蚊帐在WHO隧道试验中达到了≥90% BFI和≥80% M24的生物效能标准。在PNGIMR, 8/20蚊帐(40%)符合世卫组织锥生物测定生物有效性标准(表2)．

圆锥生物测定中60min击倒与24h死亡率的关系

在IHI中，由回归测量的敲除和死亡率之间的关系为0.36 (95% CI: 0.15-0.57)p= 0.002)表明KD60与M24关系不密切。而在PNGIMR中，两者的关系为0.78 (95% CI: 0.64-0.93)p< 0.001)，说明被击倒的蚊子死亡的可能性很大。

WHO锥生物测定中KD60和M24的IHI和PNGIMR之间的相关性水平

IHI和PNGIMR结果之间的相关性在统计学上非常显著，但M24结果之间的相关性更强(r = 0.9，p< 0.0001, n = 20)比KD60结果(r = 0.6，p= 0.002, n = 20)(图3.)．虽然KD60和M24的结果有一些差异，但生物测定可以预测通过或失败。除2个蚊帐(5个和12个)外，在IHI中未达到世卫组织生物有效性标准的蚊帐在PNGIMR中也未达到。申请人^®2012年，itn在两个设施中都超过了KD60或M24的阈值，即，除网2外，那些蚊帐在IHI中通过了世界卫生组织的生物有效性标准(KD60或M24)，在PNGIMR中也通过了(图2)。3.)．总体结果显示，与PNGIMR相比，IHI的敲除率更高，死亡率更低。

基于KD60和M24的IHI和PNGIMR测试设施的锥生物测定协议

使用Bland-Altman Plot, M24结果比KD60结果更一致(图1)。4)．两个终点的一致性界限很宽:KD60的平均差异(一致性界限)为15.5(−25.4 ~ 56.5)，M24−17.0(−61.4 ~ 27.3)。正如预期的那样，在KD60和M24高的最有效的蚊帐中，一致性最高。

根据世卫组织通过/不通过标准，在IHI和PNGIMR检测设施进行锥生物测定的协议

为了考虑锥体生物测定法固有的可变性，死亡率合格率设置为71%，KD60率设置为89%(即，两者较低的95% ci)。此后，IHI和PNGIMR数据一致认为n = 18个itn(90%)(基于5个净量的综合估计)，将n = 6个(30%)归为“不合格”，将n = 12个(60%)归为“合格”(表3.)．同样值得注意的是，在使用世卫组织标准生物功效阈值(忽略可变性)证明设施之间通过或失败不一致的5个蚊帐中，有3个itn在PNGIMR中使用修订的阈值被重新归类为通过。这些蚊帐在IHI中通过了KD60，虽然在PNGIMR中没有达到生物功效标准，但其95%置信区间与最佳生物功效阈值80% M24重叠(图4)。5)．

IHI和PNGMR的生物疗效结果对ITN通过或失败的预测具有良好的一致性，κ = 0.79(0.53-1.00)，准确率为90%。两个差异网(网5和网12)通过了KD60的IHI，但没有通过M24(图4)。5)．在这两家工厂，M24含量超过80%的蚊帐都没有失效，而在IHI通过的大多数蚊帐只通过了KD60(图1)。6)．

锥生物测定法用于拟除虫菊酯ITNs检测的文献综述

使用WHO锥生物测定法进行拟除虫菊酯ITN检测的文献综述显示，绝大多数未使用的拟除虫菊酯ITN的KD60和M24得分较高(图1)。7)．平均KD60为96% (95% CI: 94-98)， M24为92% (95% CI: 88-96)。从83个未洗itn的观察中，包括KD60和M24的观察，主要是一个。冈比亚按蚊s.s(63/83)和主要使用溴氰菊酯涂层ITNs(51/83)的只有12个报告KD60低于95%(表4)．有趣的是，在2008年至2017年发表的研究中，即使是氯菊酯itn也有非常高的击倒率89% (95% CI: 74-100)和死亡率89% (95% CI: 68-100)。

本研究探讨了锥生物测定法在两个使用不同方法的试验设施对拟除虫菊酯itn的产前质量保证中的应用按蚊以验证锥生物测定在不同地点、不同蚊子品系和不同实验室是一致和可重复的假设，并且可以在目前建议用于itn质量保证的理化测试之外进行[31］．本研究特别比较了巴布亚新几内亚未使用的拟除虫菊酯itn的检测结果一个。冈比亚按蚊的轮和敏感一个。farauti轮上。世卫组织隧道试验被用作国际生物监测的补充试验，以确认在锥形生物试验中未达到生物功效阈值的蚊帐的生物功效。IHI和PNGIMR检测itn的生物疗效结果一致(κ = 79和90%的准确性)，基于通过/失败的分类(表3.)，虽然没有观察到IHI和PNGIMR测试设施之间的绝对一致，特别是对于那些M24较低的网。

在本研究中，在考虑了固有的随机变异和系统偏差后，对通过标准进行了修改，结果表明锥生物测定法是一种敏感的方法，可以识别那些在网表面有足够杀虫剂剂量的蚊帐，以杀死和致残拟除虫菊酯类敏感蚊子。因此，它可能提供一种方法，以确定蚊帐表面杀虫剂剂量次优，即使使用不同的杀虫剂按蚊不同实验室的菌株。使用锥状生物测定试验通过文献综述确定的大多数以往研究报告，未使用拟除虫菊酯itn的生物功效超过了世卫组织的临界阈值[15，16，17，18，19，20.，21，22，23，24，25，26］．然而，少数研究报告说，贝宁的生物功效低于世卫组织的临界阈值[43)、伊朗(44马达加斯加],[45]、PNG [46］．原因尚不清楚，但我们的研究证实了巴布亚新几内亚最近的发现[46］．然而，已知锥体生物测定结果会受到ITN特性的影响，即生产工艺[47，48，49]，以及可能恶劣的运输或储存条件[50];以及生物测定方法，包括样品制备，例如使用直接从冰箱取出的净样品，蚊子的年龄[51，52]和健康[53]，测试程序[40)、温度(54，55，56和运算符间的可变性[31］．

由于锥体测试使用生物系统，有许多因素会影响得到的结果，需要仔细控制。这些可分为:(1)蚊虫饲养，(2)感染控制，(3)环境条件，(4)蚊虫相关因素，(5)进行锥状试验。

蚊子饲养

标准化温度至关重要，因为幼虫的饲养温度会影响蚊子的适应能力，并可能改变它们对杀虫剂的抵抗力[57］．用不正确的光暗周期饲养蚊子可能会降低蚊子的存活率[58］．蚊子幼虫的营养状况会影响蚊子的体型，因此也可能影响它们对杀虫剂的敏感性[52］．最佳蚊类饲养程序载于MR4指引[39］．

感染控制

在进行锥状试验之前，必须准备好试验室和蚊虫聚集区。实验室和接待室需要保持清洁，以防止蚊虫感染可能改变观察到的死亡率的微生物[59］．蚊子感染病原体会减少寻找宿主和产卵[60］．

环境条件

有一些证据表明，湿度也会影响接触杀虫剂后观察到的蚊子死亡率[61]，并会影响蚊子的生存[62]，因此在接触蚊子后应小心保持。蚊子的解毒有周期性[63，遵循蚊子的自然昼夜节律[64因此，在每天相似的时间进行研究是很重要的，以减少观察之间的异质性。

蚊子

使用具有标准化年龄和营养状况的蚊子，对于实现实验室之间化验的可比性至关重要。年龄(65，66]和营养状况(血液[65和糖[67)改变了蚊子对杀虫剂的敏感性。蚊子进食的时间相对于接触昆虫生长调节剂或幼激素类似物的时间会影响生物测定结果[68］．用密封容器小心地将蚊子从食虫者运送到试验室，并在生物测定前让蚊子适应试验室，将最大限度地减少生理压力及其对代谢和生理状态的影响，从而避免观察到的死亡率可能的偏差。重要的是要避免过度使用蜂群，这样蜂群就会耗尽，个体蚊子的适合度就会降低。

进行锥形测试

对于冷冻的ITN样品，在测试前让ITN回到室温是很重要的。这是因为拟除虫菊酯具有依赖温度的毒性[69]以及未能在正确的温度下测试itn可能会对观察到的死亡率产生偏差。WHO锥生物测定的角度对蚊子与蚊帐接触的时间和随后24小时的死亡率有很大影响。建议以45º或60º的角度进行锥状试验，以尽量使蚊子接触经处理的ITN表面[40］．在板上放置ITN样品时，不应拉伸或聚集ITN材料，因为这会影响锥下处理过的蚊帐的数量，因此处理过的表面可被蚊子利用。为了使来自不同测试设施的结果具有可比性，应使用标准锥(直径12厘米，世卫组织可提供)来标准化蚊子可获得的蚊帐表面积。在板上切一个洞并使用塑料塞子，这样蚊子在暴露时间内只能停留在ITN样本上(正如在IHI所做的那样)，有助于最大限度地减少结果的异质性。为了测试设施和时间点之间的可比性，在27±2℃的标准温度下评估itn是至关重要的。在不同的温度下进行研究会影响观察到的结果。据报道，在几种杀虫剂和蚊子种类中存在双峰温度-活性分布[54，55，70，7127±2℃是死亡率的保守测量值。温度影响拟除虫菊酯在昆虫中的作用方式。I型拟除虫菊酯的初始症状与温度呈正相关，毒性作用(神经递质和传导阻滞的释放)与温度呈负相关[69]而其他种类的杀虫剂在高温下毒性更大[72］．

对于同一ITN样品，在不同设备之间测量的KD60或M24绝对值的结果差异可能是由于研究中的随机误差和/或系统偏差。在其他多中心研究中也观察到类似的差异，以比较确定同一蚊帐生物功效的三种测试方法[35］．观察到的一些差异可能是由于两个设施的检测条件、程序和不同的蚊子株所致。不能排除的差异是已知会影响死亡率的温度[55，56］．的温度PNG为28±4°C，而在IHI组为27±1°C，尽管两处对照组死亡率均可接受。锥生物测定程序的可变性，即锥角为45°[46]根据PNGIMR中的世卫组织指南，而在IHI中，锥体试验在锥体试验板中以60°的温度进行，以最大限度地增加蚊子与itn的接触，尽管这已被证明是无关的[40］．网片由快递员用绝缘包装从巴布亚新几内亚运到坦桑尼亚，运输时间非常短。因此，运输不太可能影响它们的生物功效。操作人员的技能可能导致了结果的可变性，但应该注意的是，在不同时间点对相同碎片进行的锥生物测定得到了相似的结果。的一个。冈比亚按蚊的轮而且一个。farauti轮上使用的菌株对拟除虫菊酯杀虫剂完全敏感，年龄相似，暴露于相似的菌落维持条件;这些菌株不是兄弟物种，它们的形态不同[73］．的一个。冈比亚按蚊在世卫组织锥生物测定中，用于该试验的菌株对几种ITN品牌(包括本研究中测试的品牌)的死亡率很高[74，75］．蚊子品系的变异，例如大小和适合度，可以解释所测绝对值的某些变化。在测试时，对这两种菌株进行了杀虫剂耐药性评估。两株菌株均对1 × WHO诊断浓度的拟除虫菊酯完全敏感[76]，但可能需要的浓度是击倒而不是杀死一个。冈比亚按蚊的轮上。(Ifakara)均低于1 ×诊断浓度。目前尚不清楚实验室饲养的敏感蚊子品系的选择如何影响世卫组织锥体生物测定结果，需要进行更多的研究以建立可靠的比较参数。即便如此，本研究中的世卫组织锥生物测定法对M24最高的蚊帐显示出非常好的一致性。不出意料的是，对于KD60或M24较低的itn，在测试设施之间观察到更多的结果差异。这是一个众所周知的现象，因此，建议大样本量(30-50个蚊帐)用于现场使用的itn的生物效果监测的锥试验，这些itn通常减少了M24 [8］．

在本研究中，20个未使用的itn中有5个在IHI有效杀死蚊子(≥80% M24)。锥形生物测定法测定的最佳和最差未使用itn的平均M24分别为99%和24%(附加文件)2),分别。这些结果与其他研究和世卫组织规范报告非常一致[16，35，43，44，45，46］．尽管如此，在IHI测试的大多数itn的KD60高于M24。有人观察到一个。冈比亚按蚊要达到80%的M24，拟除虫菊酯的净表面浓度至少要比达到95%的KD60高5% [13］．在一份WHOPES报告(2008)中发现一个。冈比亚按蚊当剂量低于M24准则时，满足KD60准则，因此95% KD60对应20-30% M24 [31］．一份专家综述报告称，新的未使用的溴氰菊酯涂层蚊帐的KD60含量为100%，M24含量为55% [16］．因此，可以推断，在锥形生物测定中，M24是拟除虫菊酯性能的较为保守的终点。事实上，WHOPES此前规定:“由于锥体试验生物效应的两个现有世卫组织标准对应不同的活性成分表面浓度，它们是不相等的，应指定其中一个作为世卫组织规范的基础。”可能可以在个案的基础上选择标准，但死亡率显然比KD更严格，因此似乎是选择的标准" [31］．本研究的数据证实了这一点，在这项工作中死亡率是更严格的标准。本研究中进行的所有分析显示，当M24作为终点时，两个位点之间有更大的一致性。Spearman相关显示两种检测方法对M24的疗效结果具有很强的相关性(r = 0.9)， Bland Altman在这一端点上表现出更一致的一致性。这些结果进一步证实了在利物浦热带医学院(LSTM)进行的PNGIMR生物有效性试验的其他验证性分析一个。冈比亚按蚊的轮上。死亡率估计与PNGIMR结果密切相关(决定系数等于0.80)[46］．20个蚊帐中有5个(25%)的检测结果在IHI和PNGIMR检测设施之间存在差异。如果考虑到试验固有的随机变异性，则进一步减少了差异结果的数量。值得注意的是，在本研究的分析中，当考虑单个蚊帐片时，观察到ITN生物功效的差异。由于每个网块只有4个锥，因此网块之间的比较具有更大的异质性。由于重复次数较少，80% M24比例的95% CI为58%-93%，KD60为75%-100%。因此，有必要考虑每个ITN的组合片段的比较，每个ITN有20个重复，以给出更精确的生物疗效估计。在网状或表面处理中，有效成分的空间呈现和/或分布存在差异。这一点得到了充分承认，世界卫生组织的报告指出，“生物反应急剧变化的狭窄剂量范围的一个后果是，用于决策的反应截止值不可避免地设定在一个区域内，在该区域内，测量的小误差可能产生不相称的大影响。这一问题由于与许多种类的杀虫蚊帐中活性成分分布变化非常相关的高抽样误差而更加复杂”[31］．目前的工作证实了这一说法，因此，使用基于用于评价的重复数量的生物测定中反映自然可变性的置信区间是生物疗效标准阈值的一个有用的补充。此外，测定的固有不确定度应该更好地解释。在本研究中，我们使用了一种简单的方法，该方法基于当使用20个锥，即n = 100只蚊子时，在世界卫生组织M24和KD60阈值附近估计的95% ci。WHO锥生物测定结果在这一测定固有误差范围内的网仍被认为通过。然而，通过/不通过的精度也可以通过增加样本量来提高，本研究表明，更大的样本量用于QA测试是合适的。

然而，在本研究中，所有的蚊帐都通过了隧道试验，可能是因为蚊子暴露时间(12小时)比锥体试验(3分钟)更长，以及隧道试验中的糖饥饿[8]，即使在较低的拟除虫菊酯浓度下也能产生较高的疗效[21，77］．鉴于拟除虫菊酯的评价最不严格，需要最复杂的设置，是否需要进行隧道试验来测试拟除虫菊酯ITN的生物功效值得怀疑，这可能是杀虫剂表面浓度较低的ITN通过世卫组织生物功效标准的一种手段。

在本研究中，包括四个拟除虫菊酯ITN品牌(附加文件3.)．所有这些品牌都通过了世卫组织生物检测系统(WHOPES)测试，并根据世卫组织锥体生物测定数据被推荐(现在是预审合格)。为了增加研究结果的普遍性，我们选择了几个品牌。我们的文献综述强调，在多项研究中，所有这些品牌都通过了世界卫生组织锥体生物测定的生物疗效标准(表4)．本研究结果与PermaNet的几项研究结果一致^®2012年(18，19，48，78，79),申请人^®2019网(44，46］．的Yorkool^®净结果与世卫组织资格预审报告相似[16，35]和贝宁耐久性研究的最新结果[43]和马达加斯加[45］．对拦截器^®和SafeNet^®本研究中的网、锥生物测定结果低于其他研究[15，20.，23，35，80］．拟除虫菊酯在ITN样品上表面生物利用度的某些可变性可能是由制造过程引起的[18，47，48]，有效成分在网状内的空间呈现和/或分布的变化。拟除虫菊酯的净表面生物利用度也会受到杀虫剂迁移速度的影响[31]，储存或运输条件欠佳[12和使用的粘合剂[46］．然而，我们认为itn的最低标准是有足够的表面浓度来杀死对拟除虫菊酯敏感的新蚊子。

在本研究中，文献综述显示，在一些疟疾负担高的国家，例如尼日利亚，在长期进口生物效率低的蚊帐之后，才引入了使用世卫组织锥状生物测定法的ITN质量保证[81］．重要的是，应在装运后评估ITN的生物功效，以确保所采购的蚊帐能按要求发挥作用。世界卫生组织将itn的可接受性能定义为通过20次标准洗涤(或使用3年)保持生物活性(例如M24≥80%)，但没有与此定义相对应的简单物理化学测量方法[31］．普遍认为，迫切需要一种经过验证、低成本、易于实现的实验室方法来评估地面人工智能内容[30.]但目前的方法还没有被发现与生物疗效结果很好地对应[34］．WHO锥生物测定法已被证明对网表面活性成分浓度的变化高度敏感，因此可在ITN质量保证(QA)中发挥关键作用[35］．然而，许多地方病流行的国家没有完善的ITN质量保证锥体生物测定法(即交付后或分发前质量保证)。建议WHO锥生物测定法用于常规处理蚊帐的质量保证[36，37］．世界卫生组织第十次会议建议世卫组织标准生物测定法用于ITN质量保证目的，直到开发出替代方法[35］．然而，世卫组织第11次生物测定大会的结论是，"世卫组织标准生物测定法不能在全世界范围内用于驱虫蚊帐质量保证目的，因此必须采用理化试验"，其原因是世卫组织锥体生物测定结果有差异，而且取决于蚊子品系[31］．目前的工作增加了一种论点的分量，即蚊子品系的选择或实验室之间的差异系统地影响了世卫组织锥生物测定结果。我们表明，如果考虑到系统偏差，WHO锥生物测定法是可重复的。通过开展这样的研究可以很容易地实现这一目标，但需要检测机构之间的伙伴关系和政策制定者的灵活性。实验室方法的进一步协调也可能有助于最大限度地减少设施之间的结果差异。需要更多的证据来测试M24标准是否应该是蚊子种类特有的(尽管应该注意的是，一些蚊帐对两种毒株都达到了80%的死亡率)。这可与已存在的关于世卫组织试管生物测定中使用的歧视性杀虫剂浓度的特定物种指南相比较[76］．因此，如果有解决复杂现实的意愿，控制良好的生物测定法可以用于QA目的。

最近的景观生物功效报告[30.和其他几项研究[7，33，82，83都强调了更好的QA的必要性。文献综述中发现的几乎所有研究都显示未使用的拟除虫菊酯itn与拟除虫菊酯敏感株的KD60和M24较高。虽然这可能是对阳性试验的发表存在偏见(表4)、列入世界卫生组织的报告以及若干独立的业务监测研究表明情况并非如此。一些独立的运行监测报告显示，未通过生物功效阈值的驱虫蚊帐被分发给流行人群，但这些蚊帐通过了资格预审程序，显示出较高的生物功效。这组作者认为，世卫组织必须恢复在资格预审报告中报告ITN性能数据，以便采购机构、国家疟疾控制规划(NMCP)或其他在国家一级监测产品性能的机构将其作为产品性能参考。

测试的网的数量可能不足以概括研究结果。因此，还对锥形生物测定法在未使用拟除虫菊酯ITNs检测中的应用进行了文献综述，结果与本文报道的结果基本一致。文献综述中包含的许多出版物和报告没有标明生产国家、ITN的年龄、被测蚊帐的批号或批号或数据收集周期。因此，只能显示进行研究的日期/年份和/或发表日期。由于两个实验室都位于疟疾流行区，出于生物安全考虑，本研究没有使用理想的全析因设计对每个实验室的相同菌株进行研究(这将梳理出物种与实验室的差异)。在另一个实验室建立任何一个疟疾病媒都是不安全的。

基于这些研究结果，WHO锥生物测定法是一种可重复的生物测定法，前提是考虑了固有的随机变异和系统偏差，并在蚊帐超过WHO M24阈值的地方很好地达成一致。本研究纳入的文献综述证实，世卫组织锥生物测定生物有效性标准已通过所有拟除虫菊酯itn(未洗涤)达到，无需进行额外的隧道试验。80% M24阈值仍然是拟除虫菊酯敏感蚊中拟除虫菊酯ITN质量最可靠的指标。

本研究的数据集可向VCPTU索取。

人工智能:

活性成分

BFI:

血喂养抑制

置信区间:

置信区间

IHI:

Ifakara卫生研究所

IMR:

医学研究所

itn:

经杀虫剂处理过的蚊帐

KD60:

击倒后点

M24:

死亡率在24小时

PNG:

巴布新几内亚

质量保证:

质量保证

VCPTU:

病媒控制产品测试小组

人:

世界卫生组织

卫组织杀虫剂评价方案:

世界卫生组织农药评价计划

该报告的作者感谢所有直接或间接支持这项研究的人，包括在IHI、坦桑尼亚和巴布亚新几内亚国家疟疾控制计划的整个VCPTU团队，特别是Leo Makita先生和巴布亚新几内亚防治疟疾扶轮社员的支持。我们感谢塞斯爱尔兰非常有益的意见，改进了手稿。

该研究在坦桑尼亚得到了病媒控制产品检测股(VCPTU)和Ifakara卫生研究所培训和能力建设股的资助。巴布亚新几内亚医学研究所的工作得到了国家卫生和医学研究理事会(NHMRC)思想赠款(GNT2004390)的支持。SK获得了NHMRC职业发展奖学金(GNT1141441)的支持。

作者和联系

1. 坦桑尼亚Bagamoyo伊法卡拉卫生研究所环境卫生和生态科学部病媒控制产品检测单元

   Stephen G. Mbwambo, Emmanuel Mbuba, Jason Moore, Kasiani Mbina, Dismas Kamande, Olukayode G. Odufuwa & Sarah J. Moore

2. 纳尔逊·曼德拉非洲科学技术研究所，阿鲁沙，坦桑尼亚

   Stephen G. Mbwambo, Dismas Kamande, Emmanuel Mpolya & Sarah J. Moore

3. Sokoine RRH，卫生部，坦桑尼亚林迪

   斯蒂芬·Mbwambo

4. 区域卫生管理小组，邮箱1011，坦桑尼亚林迪

   斯蒂芬·Mbwambo

5. 巴布亚新几内亚医学研究所媒介传播疾病股，马当省511号，巴布亚新几内亚马当378号信箱

   Nakei Bubun, Moses Laman & Stephan Karl

6. 巴塞尔大学，瑞士巴塞尔

   Emmanuel Mbuba, Olukayode G. Odufuwa & Sarah J. Moore

7. 瑞士热带和公共卫生研究所流行病学和公共卫生部媒介生物学股(瑞士热带和公共卫生研究所，奥尔施威尔，克罗伊兹大街2,4123，瑞士巴塞尔)

   Emmanuel Mbuba, Jason Moore, Olukayode G. Odufuwa & Sarah J. Moore

8. MRC国际统计和流行病学小组，伦敦卫生和热带医学学院，伦敦吉宝街，WC1E 7HT，英国

   Olukayode g . Odufuwa

9. 扶轮社员防治疟疾，巴布亚新几内亚博罗科，非传染病111，邮政信箱3686号

   蒂姆•弗里曼

10. 詹姆斯·库克大学澳大利亚热带卫生和医学研究所，地址:澳大利亚QLD史密斯菲尔德麦格雷戈路1/14-88号，邮编:4870

    斯蒂芬卡尔

贡献

澳博、TF和SK构思了这项研究。SGM在坦桑尼亚IHI进行了这项研究;NB和SK对PNGIMR进行了研究;EKM、JM、KM辅助实验设置和数据采集;SGM进行数据分析;SJM和SK引导的数据分析方案;SGM撰写了手稿;DK、ML、EKM、OGO、TF审稿;SJM、EM和SK对最终稿进行了批判性修改;澳博和EM监督了这项研究。 All authors read and approved the final manuscript.

相应的作者

对应到斯蒂芬·Mbwambo．

伦理批准和同意参与

坦桑尼亚Ifakara卫生研究所机构审查委员会(IHI/IRB/No: 23-202)、PNGIMR内部审查委员会和巴布亚新几内亚医学研究咨询委员会(MRAC 21.02)批准了这项研究。这项研究没有将人类作为研究参与者。世卫组织隧道试验中使用的兔子在兽医监督下得到照顾，并按照SANAS认可的标准做法给予适当照顾。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。SJM, EM, JM, KM, OGO为一些制造商评估包括itn在内的病媒控制产品，包括本文报道的几种itn的制造商。没有驱虫蚊帐制造商对这篇文章发表意见。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

开放获取本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．创作共用公共领域奉献放弃书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

再版和权限