过境时间对大鲵生殖能力的影响Euprymna scolopes作为实验动物

背景

夏威夷短尾乌贼Euprymna scolopes宿主是各种海洋细菌共生体，这些共生体已经成为动物-微生物关系的模型，这对宿主的健康很重要。在一个发光的器官中，大肠scolopes细菌的温床费氏弧菌它能产生低水平的生物发光，鱿鱼用它来伪装。这种共生关系最初是在幼乌贼从卵中孵化出来并从周围的海洋环境中获得细菌共生体后建立的。一群野生的捕鲸相对容易大肠scolopes可以维持在一个海水养殖设施已经促进了30多年的研究涉及幼鱿鱼。然而,由于大肠scolopes它们原产于夏威夷群岛，从夏威夷到研究机构的运输通常代表着一种压力，这种压力有可能影响它们的生理机能。

结果

在这里，我们描述了动物的生存和生殖能力与一群鱿鱼聚集在两个运输明显不同的运输时间。我们发现，运输时间较长的动物产生的幼乌贼数量较低，不是由于运输的差异，而是由于产卵率较高的雌性乌贼数量较少，我们称之为高繁殖率。我们发现，繁殖能力极强的雌性占产卵总量的58%。

结论

这些发现的意义在于大肠scolopes对其生物学和畜牧业进行了讨论，从而为今后的研究和进一步开发提供了一个平台，使其成为一种有价值的微生物学实验动物。

细菌在促进动物的正常发育和生理方面具有重要作用[1]。动物与细菌的共同进化导致了共生相互作用，即。这种相互作用是高度具体和持久的。事实上，人体与许多类型的细菌建立了共生关系，这些细菌有助于基本的过程，如免疫和消化，对这些共生关系的干扰经常导致疾病状态[2，3.]。加深对人类细菌共生体的组装、维持和传播机制的了解，具有对抗疾病和改善人类健康的潜力。然而，如此多的细菌共生体在复杂的微生物联合体中发挥作用，即。这使得阐明这些机制成为一项艰巨的挑战。几十年来，研究人员转向自然界寻找动物与微生物共生的其他例子，这些例子已经成为揭示共生关系基本原理的有力模型。4，5]。因此，记录和改进与这些动物宿主相关的饲养技术的努力将加速共生领域的发现，这反过来将有助于制定针对细菌共生体的策略，以改善动物和人类的健康。

动物与微生物共生关系的一个被充分研究的例子是鱿鱼(短尾)之间形成的Euprymna scolopes以及革兰氏阴性菌费氏弧菌。成人大肠scolopes(无花果。1A)是夏威夷群岛特有的，在那里，人们经常在夜间在近海水域观察到个体[6]。的数量诉fischeri被安置在位于地幔腔内的一个轻型器官内[7]。以换取宿主提供的营养和能量来源[8，9，10,诉fischeri细胞发出生物发光，夜间的寄主将其向下聚焦，作为一种伪装技术，以破坏它在水柱内投下的阴影[11]。因为这种交换被预测会促进双方的适合度，两个分类群之间的相互作用是一个经常被引用的互惠共生的例子。

30多年来对这种共生关系的研究得出了大肠scolopes成为研究细菌建立共生关系的分子机制的有力实验动物[12]。少年大肠scolopes乌贼在没有细菌共生体的情况下从卵中孵化出来。1B)，但是他们获得了环境诉fischeri几个小时内就能在发光器官上定居的细胞[13]。一旦发光共生关系建立，光器官就会发生形态变化，从而防止随后的定植事件[14]，由这些最初的殖民事件产生的共生体种群在动物的整个生活史中一直保持着。因此，对共生关系最初建立的机制的调查取决于对幼鱿鱼的接触。

对幼乌贼的需求通常是通过将在夏威夷收集的一群成年乌贼运送到实验室，并将它们保存在专门的海水养殖设施中来满足的。动物可以单独饲养在标准水族箱中。1C)，当雄性和雌性鱿鱼结合时，交配迅速发生，没有交配前的表现[15]。雌性产卵的卵窝含有12-300个卵，卵被一层果冻外衣保护着，上面点缀着一系列具有抗真菌特性的微生物共生体[15，16]。从第20天开始，成熟的胚胎开始孵化[17，18]。尽管越来越频繁地使用大肠scolopes在微生物学研究中[12]，关于畜牧业如何与大肠scolopes影响幼乌贼的产生。此外，报告描述的研究大肠scolopes畜牧业是罕见的，这阻碍了与在实验室环境中维持这种生物有关的工作知识在更广泛的科学界传播和讨论。

在海洋设施中建立一个野生捕获的鱿鱼群取决于将它们从夏威夷运送到实验室的关键步骤，这在距离上可能是重要的。在这篇文章中，我们报告了动物的生存和生殖能力相关的鱿鱼队列被引入一个海水养殖设施后，从瓦胡岛，HI在两个独立的货物运输。由于两次运输的运输时间明显不同，这组动物提供了评估与每组运输相关的雌性鱿鱼的产卵能力的机会。我们发现，与延迟组相关的雌性鱿鱼总体上产卵较少，这导致海水养殖设施产生较少的幼鱿鱼。然而，各组产蛋数量的差异不是由于运输时间，而是由于产蛋频率高的动物数量。总之，这些发现揭示了新的见解的生物学和畜牧业大肠scolopes这将提高这种生物作为微生物学研究的实验动物的使用。

的主要目的大肠scolopes作为实验动物，是代幼乌贼作为寄主进行细菌定植实验。因此，该设施产生的幼鱿鱼数量可以作为评估特定群体整体生产力的指标。本报告的重点是2021年8月收集的一群鱿鱼，其中有22只雌性和7只雄性鱿鱼。值得注意的是，这些动物被分两批运送到该设施:第一批包括11只雌性和3只雄性，它们按照计划的21小时运输时间到达(对照组)，第二批包括剩余的11只雌性和4只雄性，它们的运输时间是非典型的45小时(延迟)。因为货物是在同一天到达的，所以所有的动物都是在同一天进入海水养殖设施的。到达时，与鱿鱼相关的水质测量是氨为4-8 ppm，亚硝酸盐为0 ppm，硝酸盐为5 ppm, pH值为7.8，盐度为34-35 ppt，各组之间没有明显差异。在这群成年鱿鱼中，海水养殖设施在80天内共产生了8132只幼鱿鱼(图2)。2)。然而，与对照组(5445只幼乌贼)相比，延迟组(2687只幼乌贼)孵出的幼乌贼较少，这促使对该群体的动态进行进一步研究。

该队列在海水养殖设施中维持110天。雌性的中位生存期为70.5天(图2)。3.A)，延迟组和对照组之间的存活率没有差异(图2)。3.B).甲壳类动物是头足类动物的主要膳食成分[19),与大肠scolopes鱿鱼喜欢以活虾为食物来源。使用市售的淡水虾Palaemonetes paludosus，可以在海水中存活超过24小时，我们给这群人喂食p . paludosus并评估个体摄食行为(图2)。4)。平均而言，与这两艘船相关的鱿鱼每天消耗4只虾，雌性比雄性多吃大约一只虾。在延迟组和对照组(未配对)之间，虾的消耗量没有差异t以及,p= 0.9562)。综上所述，这些结果表明，在海水养殖设施内，不同的转运时间不会影响鱿鱼的摄食行为或存活。

接下来，我们试图确定过境时间是否影响每组幼鱿鱼的产生。在80天的时间里，共产下119窝卵(图2)。4箭头)。而每只雌性产卵的数量在延迟组和对照组之间没有统计学差异(图2)。5)，延迟组产蛋数(42窝)少于对照组(77窝)。我们假设各组产卵数量的差异可以解释相应的幼崽数量差异;然而，另一种可能性是运输时间影响了每一窝幼崽的数量。因为119个卵窝中有60个卵窝是成对的，只有69个卵窝是单独饲养的，可以用来解决另一种可能性。在至少产下一窝卵的21只雌性中，17只雌性(9只来自对照组，8只来自延迟组)在数据集中至少有一窝卵(图2)。4星号)。每窝卵的幼虫分布在各组之间没有差异(图2)。6)，这表明不同的过境时间不影响卵窝的幼代。综上所述，这些结果表明，延迟产卵的群体产卵数量较少是造成幼鱼数量减少的原因。

仔细观察每只动物产下的卵的数量(图2)。5)显示，有5只雌性产卵量超过中位数的两倍(4个卵窝)。事实上，整个群体中58%(70/119)的卵是由这五只动物单独产下的。因为这些动物(被称为高繁殖性鱿鱼)对卵的整体生产有很大的影响，我们更详细地研究了这一群体的特性。高繁殖力鱿鱼在海水养殖设施内平均存活74.4±4.5天(图2)。3.B)，每5.0±0.7天产一窝蛋(图2)。7)。非高繁殖力雌性鱿鱼在该设施内的存活时间为13至110天(中位数为68.50天)，每次产卵之间的平均存活时间超过11天(图2)。7)。值得注意的是，两只雌性鱿鱼最初的产卵率与繁殖能力极强的鱿鱼相当(图2)。4鱿鱼U-0C和U-0X)，但它们只存活了20天和33天，这使得它们分别只能产下2窝和4窝。六只雌性鱿鱼要么只产下一窝，要么没有产下一窝，这就妨碍了对这些雌性鱿鱼产卵率的计算。此外，高繁殖雌虾平均每天吃5.0±0.5只虾，高于非高繁殖雌虾(4.0±0.6只)(双尾、未配对)t以及,p= 0.0030)，这表明高摄取量与高繁殖率的雌性有关。综上所述，高繁殖率鱿鱼的特点是产卵速度快，虾的消耗率高。

建立一个富有成效的队列大肠scolopes在海水养殖设施内，通常包括维持几只雄性鱿鱼的繁殖目的。因此，我们考虑观察到的高繁殖率是否与特定的雄性有关。如方法所述，每只雌性每14天与一只雄性交配。雄虫平均与5.3±1.6雌虫交配(图2)。8)，有1.5±1.1对，其中一个来自对照组，另一个来自延迟组。在与高繁殖能力雌性交配的5只雄性(A、E、I、O和S)中，只有一只(I)与两个不同的高繁殖能力雌性(J和K)交配。对于每只雄性，大多数与它们交配的雌性都没有被评为高繁殖能力，这表明高繁殖能力与队列中的特定雄性无关。另外，4只高繁殖能力的雌性(G、J、K和T)只与一只雄性(分别为E、I、I和T)交配，这表明高繁殖能力不是由于雌性与不同的雄性交配所致。

最后，为了检验雌性高繁殖率的发生是否可重复，我们检查了以前有数据可用的队列。对于相隔至少18个月收集的队列，高繁殖雌性的频率及其对卵窝的贡献分别为23.1±0.6%和57.4±2.8%(表1)1)。综上所述，这些观察结果表明，雌性过度繁殖的发生与大肠scolopes随着时间的推移，队列是非常一致的。

本报告描述了与队列相关的动态大肠scolopes在海水养殖设施内饲养的实验动物，目的是繁殖用于微生物学研究的鱿鱼幼崽。据我们所知，在科学文献中还没有关于是否装运活的报道大肠scolopes实验室可能会影响它们在圈养环境下的繁殖成功率。与一次成年鱿鱼运输相关的运输时间延长提供了一个机会，可以测试聚集一个群体的运输阶段是否会影响海水养殖设施中鱿鱼幼崽的产生。在两组之间没有观察到存活率或产卵率的差异，这是下面进一步讨论的重要发现。此外，本研究表明，只有一小部分雌性负责该群体产下的大多数卵，并且更详细地考虑了与高繁殖能力鱿鱼发现相关的含义。

运输过程是在海水养殖设施内组装一群鱿鱼的主要关键，因为它固有地依赖于第三方承运人来促进运输。物流中断可能会延长特定货物的运输时间，从而危及队列组装。值得注意的是，本文报道的结果表明，在海水养殖设施中，长达45小时的转运时间不会影响鱿鱼的产卵能力。因此，研究人员可能会在计划需要21-45小时才能完成的发货时增加灵活性。

从我们对这一群体的分析中，一个意想不到的发现是，一小部分雌性产下了大部分的卵。由于多种原因，这一发现非常重要。首先，高繁殖雌性的产卵率增加是头足类动物生殖研究的一个新领域。与乌贼等其他seppiida目的成员相比[20.]，但影响鱿鱼繁殖成功的因素却很少被描述。的汇编和注释大肠scolopes在研究是否存在高繁殖能力的遗传基础时，基因组可能会成为一种宝贵的资源[21]。其次，高繁殖率有可能提高头足类动物在研究中的使用，通过降低在海水养殖设施中捕获和维持雌性鱿鱼的数量，以产生幼鱿鱼。因为关于生态的数据大肠scolopes自然种群的分布将如何应对气候变化的预测仍然很稀少。因此，增加对与高繁殖雌性相关的特征的了解，例如，高摄食率，可能会改善选择标准，从而在促进科学进步的同时增加对自然种群的管理。最后，观察到某些雌性在海水养殖设施中贡献了更多的卵，这对与共生关系的研究具有启示意义诉fischeri。了解了哪些动物具有高繁殖能力，就可以设计实验，包括对不同的卵群进行配对，以控制不同卵群的幼崽之间的遗传变异[22]。相反，通过确保实验试验涉及不同雌性产下的卵，从而提高实验的可重复性，这一知识可以应用于其他实验设计中。

先前的研究表明，幼年动物可以在实验室环境中饲养到成年[14，15，这就增加了建立……的可能性大肠scolopes农场用于研究。然而，这种方法需要大量的空间和努力，远远超出了本报告所述的海水养殖设施。因此，这一研究领域的进一步发展取决于对实验室海水养殖设施产生的鱿鱼幼鱼的持续获取。因此，这里报告的数据也为与其他动物队列的比较建立了基线，这不仅会改善大肠scolopes但也将更好地为机构动物护理和使用委员会评估的方案提供信息。未来的研究将继续研究与海水养殖设施相关的各种环境因素和与野生鱿鱼捕获的鱿鱼幼崽产生相关的生理参数，从而促进这种强大的实验动物的科学进步。

这篇报道描述了产蛋率大肠scolopes个人。延迟运送野生动物并不影响产蛋率。在一组动物中观察到较高的产卵率，这种观察到的高繁殖率大肠scolopes对改善畜牧业有重要意义，并为今后的研究开辟了新的领域。

动物集合

成人大肠scolopes于2021年8月12日至18日在夏威夷瓦胡岛的茂纳鲁阿湾用网收集。在装运之前，动物在Kewalo海洋实验室被饲养在含有天然沙子和从近海地点抽取的夏威夷循环海水的地下水位中(收集时没有已知的水质问题)。每个水层最多有6只按性别分开的鱿鱼。动物被喂食活虾(p . paludosus)，直至装运当日为止。

动物装运

动物装在双袋装10个″× 22″3-mm水缸装运袋中，装1.5 L海水，顶空换气两次。虽然大多数动物是单独装袋的，但在运输过程中，较小的雌性动物被组合在一起。动物被放在气候控制的货舱里，通过联合包裹服务公司(UPS)在不同的日子里使用次日空运选项，将它们装在两个安全的绝缘板条箱里，从夏威夷檀香山的丹尼尔·k·伊努伊国际机场(Daniel K. Inouye International Airport)运往宾夕法尼亚州立大学(University Park, PA)。1号箱(11只雌性和3只雄性)通过现场填写运输信息进行运输，导致总运输时间约为45小时(延迟组)。2号板条箱(11只雌性和3只雄性)使用预先打印的运输标签进行运输，没有延误，总运输时间约为21小时(对照组)。抵达后，对每批货物中与三种代表性动物有关的袋子的水化学进行评估。测量了氨、亚硝酸盐、硝酸盐、pH值和盐度。两批装运的所有鱿鱼都是活的，表现出健康的行为(吃、埋、着色)。

适应环境

在鱿鱼抵达之前，对海水养殖设施的水进行了温度、盐度、氨、亚硝酸盐、硝酸盐、pH值的评估，并根据需要进行了调整。抵达后，海水养殖设施室的灯光变暗。通过将密封袋漂浮在水族馆水中，使每个袋的温度与设施的温度相适应。15分钟后，一半的动物开始水适应，打开袋子，以33 mL/min的速度向每个袋子中滴入水缸水。45分钟后，大部分水从运输袋中除去，将鱿鱼留在~ 500毫升混合水中。这个过程再次完成，然后慢慢地把每个袋子翻转过来，让鱿鱼游到单独的水族箱里。在每次装运的一半动物成功驯化后，剩下的一半动物也完成了这一过程。

海水养殖系统

动物饲养在由Aquaneering公司设计和组装的4个独立水族箱系统组成的海水养殖设施中(2个成体系统，1个卵系统和1个虾系统)。每个系统都由模块化聚碳酸酯罐组成，由不锈钢机架支撑，下面有一个大型过滤池。两个成人系统的污水池相互连接，每个系统包含大约60加仑的混合即时海水，在模块化水箱、过滤污水池和每个系统之间循环。每个成年水箱中平均有一只成年鱿鱼(用胶带标记)，一层2厘米的夏威夷沙子，一个2″的PVC洞穴，约1.5加仑的循环海水。鸡蛋系统包含大约60加仑的速溶海水，在4个机架和48个水箱之间循环。每个水箱容纳约0.75加仑的海水，分成2个孵化室，每个孵化室容纳1-2个卵。当来自每个系统的水通过下面的水池循环时，它会通过一个3 GPM的独立过滤系统，该系统由以下组件组成:一个用于捕获大块碎片的精细水族馆过滤介质，一个用于去除有机废物的蛋白质撇清器，一个用于硝化的流化床生物过滤器，用于水净化的颗粒活性炭，以及一个用于降低微生物负荷的紫外线灭菌器。通过探头连续监测水温(22°C)、pH(8.0-8.2)、盐度(35 ppt)、溶解氧(8 ppm)、水位和漏水等水和设备参数。此外，每天使用氨、亚硝酸盐和硝酸盐比色检测试剂盒(API)人工监测水化学。成鱼和对虾系统每天更换一次水，鸡蛋系统每两周更换一次水。 Once per month, squid were housed outside of their tanks for approximately 1 h to allow for tank cleaning and the replacement of clean sand for each animal.

日光照周期

每天，在封闭的海水养殖设施内，灯光在午夜逐渐熄灭，中午熄灭，以模拟自然环境中太阳的自然升起和落下。一个额外的微弱的静态光被用来模拟月光。

喂养

根据每只成年鱿鱼近期的摄食行为，每天为其提供2 ~ 6只鬼虾。如果发现一只乌贼连续两晚吃光了他们提供的所有虾，那么第二天给的虾的数量将增加一只，最多可达六只。或者，如果发现前一天晚上没有吃的虾，那么第二天给的虾的数量将减少一只，至少减少两只。约18 h后，对未吃的虾进行鉴定，计算吃掉的虾数。

交配

每只成熟的雌性鱿鱼每14天与一只雄性个体交配一次。为了开始交配，在灯光变暗后不久，一只雄性被转移到一个装有雌性的水箱中。定期观察动物的交配情况，当交配发生时标记为“成功”，如果没有观察到交配，标记为“不成功”。约5小时后，将雄性转移回原来的水箱，将动物分开。在可能的情况下，雌性与来自同一批次的大小相似(或略小)的雄性交配。如果一次成功的交配事件没有产生蛋窝，雌性在下一次交配期间与另一个雄性交配。

蛋离合器/青少年

每天，研究人员都会检查成虫箱里的PVC洞里是否有新产下的卵。当发现卵卵时，它们被转移到一个单独的卵系统中，并从PVC洞穴中取出，在那里它们将在孵化室中不受干扰地孵化。孵育20天后，对刚孵出的雏鸟进行每天两次的卵卵监测。孵化后，幼仔动物被转移到过滤灭菌的即时海水(FSSW)中进行实验。

数据采集与分析

使用Excel对数据进行维护和分析。使用GraphPad Prism v. 9.3.1 (GraphPad Software, LLC)进行统计分析并生成图表。

动物研究规程

所有实验动物的收集、护理和研究都是在该计划的机构动物护理和使用委员会(IACUC)下完成的。IACUC协议# PROTO202101789。

与本研究相关的数据在补充数据集文件中提供。

FSSW:

过滤消毒的即时海水

IACUC:

机构动物护理和使用委员会

我们感谢Miyashiro实验室的成员对本文的建设性反馈。

这项工作得到了国家普通医学科学研究所R01 GM129133(给T.I.M.)的支持。

作者及单位

1. 美国宾夕法尼亚州立大学生物化学与分子生物学系，宾州大学帕克分校

   Andrew G. Cecere和Tim I. Miyashiro

贡献

AGC和TIM设计了研究，分析了数据，并撰写了手稿。AGC收集所有数据。两位作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Tim I. Miyashiro。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

出版商的注意

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