一种定量分析黄斑和乳头周围血管光学相干断层摄影图像的标准化方法

背景

光学相干断层血管成像(OCTA)是一种相对较新的评估视网膜血管复合体的无创成像技术。然而，其定量评价仍缺乏标准化和可重复性。此外，对大量OCTA图像进行人工分析使得这一过程非常费力，具有更大的数据可变性和偏差风险。因此，本研究的目的是描述OCTA图像中中央凹无血管区(FAZ)、黄斑浅层和深层血管复合体(mSVC和mDVC)和乳头周围浅层血管复合体(pSVC)的快速、可重复的定量分析。

方法

我们调查了用于研究视网膜微血管系统的模型和方法，以及用于量化微血管网络的软件包。这些程序为研究人员提供了宝贵的工具，但我们估计它们的采用率总体上很低，可能是由于不熟悉的研究人员的复杂性和非标准的量化度量集。为了解决这些现有的限制，我们讨论了通过开发一种自动化的血管分析方法来提高微血管网络定量的有效性、可负担性和可重复性的机会，以更好地服务于微血管研究的当前和未来需求。从设备导出黄斑(10°x10°、15°x15°或20°x20°以中央凹为中心)和乳头周围区域(15°x15º以视神经头为中心)的OCTA图像，并使用开源软件Fiji进行处理。自动分析mSVC、mDVC和pSVC在总面积和四个扇区(上、下、鼻和颞)的血管密度。我们还分析了FAZ在SVC和DVC图像中的面积、周长和圆度。

结果

我们建立了一个自动化模型，并讨论了一种逐级分析黄斑SVC和DVC血管密度和FAZ的方法，该方法是由OCTA在不同视场下获得的。我们还开发了一种自动分析乳头周围SVC的方法。

结论

我们开发的黄斑和乳头周围OCTA图像自动分析将允许快速、可重复、精确地定量SVC、DVC和FAZ。它还可以在不同的研究之间进行更准确的比较，并简化来自多个患者的图像处理，只需一个命令。

光学相干断层血管造影(OCTA)在过去的几年里出现了一种有用的无创成像方式来评估眼部血管。简而言之，OCTA包括对视网膜和脉络膜上的同一点进行光学相干断层扫描(OCT)的重复获取，以评估血管内移动的血液颗粒引起的后向散射信号的时间变化。使用图像处理算法，创建所分析区域的血管网络的正面图像，如果需要，将其分割为不同的血管复合体[1]。

自OCTA出现以来，通过使用眼动追踪系统、更快的采集软件和更高的分辨率，采集错误的风险已经降低。然而，重复扫描所需的时间长(特别是当分析更大的区域时)，无法检测血管渗漏或渗透性异常，软件之间的差异以及图像伪影的持续存在，仍然阻碍了该过程[1]。最初，OCTA图像的解释基本上是定性的，但引入新的定量血管网络参数有助于患者的诊断、预后和监测[2，3.]。

ImageJ(美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院)[4]是一款常用于手动或自动图像分析的开源软件，包括OCTA [5]。OCTA图像可以使用ImageJ以不同的方式进行处理，以获得定量数据，[6，7但由于目前缺乏详细的资料，很难建立一种重现黄斑和乳头周围病变的标准方法[6，7，8，9]。本文的目的是回顾定量OCTA分析的文献，提出一种对黄斑和乳头周围OCTA图像进行综合定量处理和分析的标准方法，增加使用兼容OCTA设备进行研究的可比性。

研究参与者

这项横断面、观察性和描述性研究符合《赫尔辛基宣言》(1996年)、《纽伦堡法典》(1947年)、国家卫生委员会关于涉及人类的研究的指导方针(第466/12号决议)和我们的机构审查委员会伦理委员会。所有受试者在参加研究前都给予了知情的书面同意。

纳入标准要求每位受试者为成年人(≥18岁)，且眼睛健康。排除标准为:糖尿病、严重慢性全身性疾病、既往脑外科手术、眼部手术、影响视网膜、脉络膜或视神经的眼部疾病(视网膜病变、葡萄膜炎、视神经病变或异常)、高度近视(眼轴长度> 26.5或球屈光<-6屈光)、高度远视(球屈光> + 6屈光)、柱体屈光>±3屈光)、眼压> 21 mmHg;中膜混浊影响OCT/OCTA扫描质量(角膜混浊，根据晶状体混浊分类系统III核混浊> 2，玻璃体混浊)，最佳矫正视力(VA)低于20/30。

眼科检查和OCTA图像采集

所有患者都接受了完整的眼科检查，包括VA评估、裂隙灯生物显微镜、Goldman眼压测量、眼底镜、OCT和OCTA，必要时进行眼轴长测量(IOL Master 500;卡尔蔡司Meditec，德国)。VA测量后，用1% tropicamide滴眼液扩大瞳孔，进行完整的眼底检查并获得高质量的OCT扫描。使用Spectralis®OCT模块(Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany)获得光谱域OCT扫描。黄斑和乳头周围扫描采用预先确定的自动实时跟踪(ART)对每种类型的采集进行采集，质量指数至少为25。由于移动、投影、重复血管或扭曲而产生许多伪影的图像被重复，所有扫描都被手动检查以确保足够的分割。

黄斑方案包括以中央凹为中心的10º× 10º、15º× 15º或20º× 20ºOCTA扫描(512张a片/ b片和512张b片/容积)。通过检查OCTA扫描协议获得的OCT b扫描，手动确定和确认中央凹中心。视神经头方案包括以视盘为中心的15ºx 15ºOCTA扫描(512个a扫描/ b扫描和512个b扫描/容积)。使用Spectralis®软件的自动视网膜层分割生成浅血管复合体(SVC)和深血管复合体(DVC)的正面OCTA图像。SVC的上限和下限分别为内限制膜和内丛状层下边缘以上17 μm处。同样，DVC的上限和下限分别在内网状层下边缘和外网状层末端上方17 μm处。

定性协议

两名蒙面审查员独立审查了所有图像。如果出现以下任何情况，则排除扫描:(i)分辨率不足，(ii)由视觉漂浮物等伪影引起的局部信号弱，(iii)在正面血管造影中可见的不规则血管图案或椎间盘边界残留运动伪影，以及(iv)中央凹偏离中心。两位审稿人之间的差异由经验丰富的第三审稿人通过协商一致或裁决来解决。

我们还回顾了有关OCTA成像过程的文献，包括Heidelberg OCTA的物理原理和算法。Pubmed和Google Scholar检索了定量微血管OCTA分析，黄斑和乳头周围OCTA的自动和手动阈值算法，正常受试者中基于OCTA的中央凹无血管区(FAZ)大小和形状的客观OCTA评估，以及使用“Level Sets”宏(用于逐步评估相邻像素之间差异的插件;可以在https://imagej.net/Level_Sets）.

大多数可用的软件将视网膜血管系统划分为“浅板”和“深板”。可以提供几个视场选项，但随着视场的增加，扫描的分辨率会降低，因为使用相同数量的a扫描来扫描更大的区域。输出图像中显示的预定义视网膜板可以用外部软件进行定量分析。不幸的是，测量和质量控制方法尚未标准化，这使得比较研究变得困难，并且度量计算因研究而异。最近的研究比较了评估毛细血管密度和形态的不同方法[6，7]。用于定量分析的OCTA扫描高度依赖于图像处理。开创性的研究提出了连续OCTA测量之间类内相关系数的最佳阈值。我们的团队提出了一种基于海德堡octa的自动量化方法，用于评估健康受试者的视网膜血管系统，通过使用单一命令处理来自多个患者的图像来标准化和简化分析。下面逐步介绍定量分析的方法，然后对以往研究中采用的方法进行讨论。

八坐标图象处理

使用ImageJ(美国国立卫生研究院，Bethesda, Maryland, USA;可以在https://imagej.nih.gov/ij/download.html）.黄斑SVC (mSVC)和黄斑DVC (mDVC)的OCTA报告以TIFF格式导出，以中央凹为中心，裁剪为962 × 962像素(图2)。1A, B)。随后，将图像二值化为黑白，并使用Otsu的阈值法10进行血管密度分析(图2)。1C)。白色像素被认为是血管，通过将血管面积除以感兴趣的总面积来计算总体密度，根据扇形(上、下、鼻和颞)表示。我们开发了一个宏(存储在文件模块中的命令和函数序列，作为快捷方式)，用于分析使用不同视场捕获的多个OCTA图像中的mSVC和mDVC(宏文件可在公共存储库中获得-请参阅数据可用性声明)。mSVC和mDVC的FAZ被自动划分(图2)。1D)和分段(图2)。1E)从裁剪后的黄斑OCTA图像(图。1B)使用Level Sets宏，它自动测量并输出FAZ指标(面积、周长和圆度)。

我们创建了另一个宏来分析不同视场中多个OCTA图像的SVC和DVC的FAZ(宏文件可在公共存储库中获得-请参阅数据可用性声明)。乳头周围SVC (pSVC)的OCTA报告以TIFF格式从OCT导出，以视神经头为中心，裁剪为938 × 938像素(图2)。2A, B)。与黄斑OCTA图像一样，使用Otsu的阈值算法对裁剪后的乳头周围OCTA图像进行二值化，用于血管密度分析(图2)。2C)。pSVC分析基于视神经头为中心的1.7 mm内径和3.4 mm外径的环形区域(图2)。2D).分析pSVC环的总平均值(360º)和扇区(下80°，上80°，鼻110°，颞90°)，对应于乳头周围视网膜神经纤维层的扇区。我们还创建了一个自动宏来分析15°x 15°pSVC。宏文件可下载(宏文件可在公共存储库中获得-请参阅数据可用性声明)。

数据分析与统计

描述性统计包括正态分布变量的均值±标准差(SD)。采用夏皮罗-威尔克检验评估正态性。

37名健康参与者参加了这项研究，平均年龄44岁。平均眼轴长23.19 mm(右眼)、23.05 mm(左眼)，平均眼压15 mmHg。平均信号质量(Q)在10º× 10º时为41，在20º× 20º时为39，在乳头周围15°× 15°时为35。用于分析多幅图像faz的程序包括以下步骤:

FAZ分步分析

第一步:将OCTA图像以tiff格式保存在计算机上，将OCTA分为深层FAZ和浅层FAZ，并为包含代码、眼睛(右眼/左眼od /OS)、FAZ和层(深层/浅层)的文件命名。例:“01 _od_faz_superficial”。

第二步:安装ImageJ，然后添加“读写Excel”插件到ImageJ(见https://imagej.net/Read_and_Write_Excel;所有插件文件也可以在公共存储库中获得(参见数据可用性声明)。这个插件允许将结果导出到Excel。

第三步:使用图像编辑器(ImageJ)，裁剪OCTA区域到“15 × 15_庄稼裁剪。tif”文件的大小(962 × 962像素)。

第四步:执行ImageJ命令:进程>批处理>宏>输入(包含待评估FAZ的octa的文件夹)/输出(将ImageJ生成的图像保存在与输入相同的文件夹中)/选择输出格式:tiff >单击“打开…”按钮，从SVC或DVC(例如，“FAZ_10 × 10_DVC”)中选择具有10 × 10或15 × 15或20 × 20特定FAZ宏代码的文件。ijm”或“FAZ_10 × 10_SVC.ijm”)>开始自动处理(点击“处理”按钮)>在桌面上的Excel电子表格上查看以面积(mm2)、周长(mm)和圆度表示的结果(图2)。3.）.

第五步:重命名excel文件并将其从桌面上删除。“面积”是分区FAZ的大小，而“周长”是FAZ轮廓的长度。圆度指数(相对于完美圆的偏差)的计算公式为:4π(面积/周长2)。越接近0，圆形越少，形状越不规则。后处理图像(边界和FAZ绘图)自动保存在与原始文件相同的文件夹中(见表)1）.

用于分析多幅图像中所有复合体血管密度的程序包括以下步骤:

逐步黄斑血管密度分析

第一步:按照上一节的描述保存图像后，根据每只眼睛(“Macula OD”或“Macula OS”)和复体(浅/深)分离octa，便于后续的数据处理(右/左扇区反转)。

第二步:为每个文件夹中的octa指定一个名称，指定患者代码、眼睛(OD/OS)、黄斑和复体(深部/浅层)(例如:“01_OD_Macula_DEEP”)。使用图像编辑器(ImageJ)，裁剪OCTA区域到“15 × 15_庄稼裁剪过的。tif”文件的大小(962 × 962像素)。

第三步:安装ImageJ插件“otsu_threshold .jar”和“读写Excel”，将各自的文件放在文件夹“…\ImageJ. jar”中。app\plugins”(插件文件在公共存储库中可用-参见数据可用性声明)。

第四步:去批流程> >宏>输入(把文件夹一起八面体图像评估)/输出(ImageJ生成的图片保存在同一个文件夹作为输入)>选择输出格式:tiff >点击“打开…”按钮并选择文件宏代码为一个特定的黄斑10×10或15×15或20×20(例:“Macula_15×15. ijm”)>点击“处理”按钮(点击“Ok”每次显示消息“发现阈值:……”)。查看结果表示为密度(%像素)在每个扇区(总，上，下，左，右)在桌面上的Excel电子表格。请注意，在OD中，“左”对应于“颞”，“右”对应于“鼻”，而OS则相反。重命名Excel文件并将其从桌面上删除。后处理的阈值图像保存在与原始文件相同的文件夹中(见表)2和3.）.

用于分析多幅图像的所有复合体的乳头周围血管密度的程序包括以下步骤:

逐步的乳头周围血管密度分析

第一步:按照上一节的描述保存图像后，根据眼睛(' Nerve OD '或' Nerve OS ')分离octa，便于后续的数据处理。为每个文件夹中的octa指定一个名称，指定患者代码、眼睛(OD/OS)和神经(例如:“01_OD_Nerve”)。

第二步:打开ImageJ，进入Process > Batch > Macro > Input(包含所有待评估的右眼神经octa的文件夹)/ Output(将ImageJ生成的图像保存在与Input相同的文件夹中)>选择输出格式:tiff >在“打开…”按钮中单击带有右眼神经宏代码的文件(例如:“ONH_15 × 15_OD.ijm”)。按Process(每次显示“Found threshold:…”提示时，点击“Ok”)。在桌面上使用Excel表格查看评估区域(total ring, superior_rim, inferor_rim, left_temporal_OD_rim, right_nasal_OS_rim)的密度(% pixels)。

第三步:重命名Excel文件并将其从桌面上删除。视神经划分采用Suzuki et al.8乳头周围环总面积密度(%像素)(360º)、上缘(80º)、下缘(80º)、左缘(颞缘OD)(90º)/(鼻缘OS)(110º)、右缘(鼻缘OD)(110º)/(颞缘OS)(90º)(表)4）.

据我们所知，这是第一个标准化黄斑和乳头周围血管Heidelberg OCTA图像定量分析方法的研究。自动算法产生更多可重复的结果，从而允许更准确地区分健康和病理结构。

黄斑和乳头周围OCTA图像的定量分析取决于图像质量。一些作者认为噪声和容器不连续性会影响定量参数[10]。确实，有很多图像失真的OCTA扫描应该排除在分析之外[11，12]。OCTA图像的选择没有最低质量标准，但应考虑对比度质量、血管连续性和非血管区域的背景噪声水平[13，14]。在本研究中，我们只选择高质量的图像进行分析:在选择质量参数满意的图像后，10ºx 10º的平均信号质量(Q)为41,20ºx 20º的平均信号质量(Q)为39，乳头周围15°x 15°的平均信号质量(Q)为35。因此，我们建议在海德堡OCTA中，Q超过这些参数的考试可以被认为是高质量的。此外，不同的OCTA模型得到的Q值可能不同，因此每个模型都应该理想地描述最小的图像质量指标，以获得最佳的分割效果。

定量OCTA测量高度依赖二值化，由于较高水平的背景噪声会影响二值化阈值，建议在二值化之前进行背景噪声和连续血管分割分析[13]。从OCTA图像中计算定量全局血管密度时，图像处理是一个重要步骤。选择阈值用于图像二值化是至关重要的。大多数研究人员推荐使用开源软件(如ImageJ)的手动和自动二值化方法。手工方法采用基于无血管FAZ内平均信号的二值化阈值。自动算法使用图像的直方图来获得阈值。Rabiolo等人发现人工和自动二值化方法在血管密度上存在显著差异，影响了连续检查的可靠性[15]。

二值化阈值方法的差异已被证明会影响健康眼睛octa的量化。自动化应该优先于手动二值化，但算法不可互换，结果可能会有很大差异。在一项研究中，当使用Otsu二值化方法时，两个连续OCTA测量值之间的类内相关系数显著较高。该方法最小化了图像直方图中前景和背景结构之间的方差[6]。在之前对糖尿病视网膜病变患者二值化阈值方法的定性分析中，总体Otsu阈值效果最好[16]。

用不同设置获得的数据不容易比较。研究间的可比性要求采用一套共同的方法和标准。本研究小组提出了一种使用海德堡oct对健康受试者视网膜血管系统进行定量评估的方法。循序渐进的算法被发现提供可靠的定量血管测量黄斑和乳头周围网络。此外，ImageJ宏脚本成本低、节省时间、易于访问且广泛可用。在定量OCTA结果中观察到的相当大的方法间变异性一般突出了比较研究的困难和本文中提出的宏观的潜力。然而，尽管涉及的步骤很多，我们相信这些程序很容易学习，并且该算法可以用于标准化定量OCTA测量，以获得更高的再现性和可比性。

FAZ对视网膜血管变化非常敏感。要充分了解正态性，就必须对面积和规律性进行准确的观测，但定量研究很少，测量方法也没有标准化。本文提出的方法允许客观和可重复的测量。手动建立FAZ的边界可能是费力和耗时的，并且人工分割往往比自动算法更接近圆形和更平滑，从而导致更短的周长和更大的圆度[17]。

在OCTA上FAZ的形状被认为是视网膜病理的一个很好的指标。因此，在最近的一些研究中，正常眼睛和患有糖尿病视网膜病变的眼睛在FAZ的圆度方面存在显著差异[18，19]。FAZ的圆度可以在数学上表示为与完美圆的偏差(1.0)，使用公式:圆度= 4π(面积/周长2)。值越低，偏差越大。由于形态学FAZ参数受个体差异的影响比正常眼睛FAZ大小的影响小，因此与FAZ形状相关的参数可能更好地用于疑似疾病患者的FAZ监测[20.]。由于FAZ区域取决于所使用的OCT设备，因此不应在临床试验中使用不同设备获得的测量结果[21，22]。在本研究中，我们使用Spectralis®OCTA获得了平均(±SD) FAZ面积测量值，如表所示1．

OCTA允许无创和定量评估视神经头部的血流量。最近的研究表明，即使是非血管性视神经疾病(如青光眼、炎症性或遗传性视神经病变)的患者，octa测量的视网膜乳头周围血管密度也可能受到影响[23]。OCTA扫描使得评估乳头周围血管网络相对容易。在大多数健康的视盘周围，可以观察到致密的微血管网络，没有局灶性毛细血管脱落(通常在视盘边缘附近更明显)，向周围的清晰度下降。OCTA通过分别分析视神经不同扇区和层的血管密度，有助于区分健康和受损的视神经，并有可能揭示视盘疾病的发病机制[17]。基于我们的研究结果，我们提出了一种实用且自动化的方法，使用海德堡OCTA获得定量的血管周围血管密度数据，并给出每个视盘扇区的正常范围。

我们的研究受到受试者数量相对较少和每只眼睛只使用一次测量的限制。血管复合体是本文的研究重点，如果我们能对每个神经丛进行分割和评估，在临床上将会更有趣。此外，我们没有评估不同OCTA设备的可比性和可重复性，并且只包括正常眼睛的样本。视网膜病变中视网膜层的变化可能是分割和算法性能的问题。虽然我们已经促成了图像的定量分析，但仍然需要从设备导出图像并使用第三方软件。理想情况下，自动分析策略应该作为设备本身的更新而合并。

综上所述，OCTA测量方法的标准化对于OCTA的科学和临床应用具有重要意义。所提出的基于octa的黄斑和乳头周围参数(SVC、DVC、FAZ)评估步骤可重复、准确且易于学习。采用我们的方法将有利于研究间的可比性，并有助于当前对一系列病理和治疗反应的理解。

不适用。

所有作者的财务披露(过去12个月)

Mello博士得到了CAPES -巴西Nível苏必利尔市协调中心(Brasília)的支持。Monteiro教授受CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (No . 307393/2014-3)， Brasília，巴西资助。其余作者没有实际或潜在的财务披露。

这项工作得到了CAPES - concerdenaaper o de aperfeiamento de Nível Superior, Brasília，巴西和CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (No . 307393/2014-3)， Brasília，巴西的资助。资助机构在这项研究的设计或实施中没有任何作用。

作者指出

1. Luiz Guilherme Marchesi Mello, Taurino dos Santos Rodrigues Neto和Epitácio Dias da Silva Neto对这项工作做出了同样的贡献

作者及单位

1. 巴西圣Espírito联邦大学Ciências da Saúde中心(CCS)专科医学部，Vitória

   路易斯·吉列尔梅·马奇西·梅洛

2. 巴西圣保罗大学医学院眼科学研究室及眼科学研究实验室(LIM-33)， ensamas de Carvalho Aguiar博士，255,Cerqueira csamar， 圣保罗，05403-001，巴西

   Taurino dos Santos Rodrigues Neto, Epitácio Dias da Silva Neto, Rony Carlos Preti, Mário Luiz Ribeiro Monteiro和Leandro Cabral Zacharias

贡献

研究的构想与设计:LGMM、TSRN、EDSN、LCZ。数据采集与分析:LGMM, TSRN, EDSN, LCZ。起草手稿的重要部分:LGMM, TSRN, EDSN, LCZ, MLRM。修改稿件:LGMM, TSRN, EDSN, LCZ, MLRM。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到陶里诺·桑托斯·罗德里格斯·内托．

相互竞争的利益

作者报告与本文所涉及的研究没有利益冲突。

出版商的注意

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