用于增强三阴性乳腺癌光动力治疗的仿生氧递送纳米颗粒gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer, TNBC)是一种转移率高、总生存时间差、对靶向治疗反应低的侵袭性乳腺癌。为了提高TNBC治疗的疗效，克服TNBC治疗的耐药性，我们研制了癌细胞膜包被氧传递纳米探针CCm-HSA-ICG-PFTBA，它可以改善肿瘤部位的缺氧，增强光动力治疗(PDT)的治疗效果，从而缓解TNBC异种移植瘤的生长。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

CCm-HSA-ICG-PFTBA的尺寸为131.3±1.08 nm。体外实验gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2BaCCm-HSA-ICG-PFTBA组和ROS浓度均显著高于其他各组(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)。体内荧光成像显示最佳时间窗为注射CCm-HSA-ICG-PFTBA后24 h。都在体内gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO PET成像和体外免疫荧光染色结果显示，注射CCm-HSA-ICG-PFTBA后24 h，肿瘤缺氧情况明显改善。在体内PDT治疗中，CCm-HSA-ICG-PFTBA联合NIR组肿瘤体积和重量均为各组中最小，且较未治疗组显著降低(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。注射CCm-HSA-ICG-PFTBA至14 d未观察到明显的生物毒性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

CCm-HSA-ICG-PFTBA利用全氟碳(PFC)的高氧溶解度和癌细胞膜的同源靶向能力，可以靶向肿瘤组织，缓解肿瘤微环境的缺氧，增强TNBC异种移植的PDT疗效。此外，HSA、ICG和PFC都是fda批准的材料，这使得纳米颗粒具有高度的生物相容性，并增强了临床转化治疗TNBC患者的潜力。gydF4y2Ba

乳腺癌是女性最常见的恶性疾病，是2020年全球女性第二大肿瘤死亡病例[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一种亚型，占所有乳腺癌患者的15% [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．由于雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2 (HER2)的表达缺失，TNBC患者的转移率和复发率较高，总生存时间较差，缺乏靶向治疗机会[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．尽管乳腺癌患者的常规治疗包括化疗、内分泌治疗、靶向治疗，但光动力治疗(PDT)是提高治疗效果、克服对TNBC治疗耐药的新选择[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

PDT是一种迅速发展并经临床批准的癌症治疗方法[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，其中PDT的抗肿瘤作用取决于活性氧(ROS)和单线态氧(gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)由光动力反应中的氧气产生，以增强PDT过程中的细胞杀伤[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．然而，PDT确实消耗氧气并引发血管关闭，这转化为更少的氧气和更严重的缺氧[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．因此，开发克服低氧肿瘤微环境的有效策略，以达到良好的抗肿瘤治疗效果备受关注。gydF4y2Ba

全氟碳化合物(PFC)，具有延长半衰期的能力gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba到大约10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba-折叠到其他溶剂[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，是输送氧气的理想载体[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．此外，PFC是一种高度生物相容性的惰性化合物，已广泛应用于临床超声造影增强成像和预防组织器官损伤的缺血/再灌注[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．推测PFC通过输氧有助于提高PDT的疗效。gydF4y2Ba

进行PDT需要适当的光敏剂。对于深层组织穿透和低自身荧光，近红外(NIR)光(700-900 nm)通常是首选的激发波长范围[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．吲哚氰绿(ICG)是一种近红外光敏剂，是美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于测量血容量的染料[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．但由于ICG聚集和血液循环时间短，经常发生荧光猝灭[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．为了缓解这一障碍，人血清白蛋白(HSA)已被用于增加ICG的稳定性和延长循环时间[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．除了PFC, ICG和HSA都是fda批准的人类使用，从而促进了这些材料的临床使用。gydF4y2Ba

免疫逃避和特定的肿瘤靶向特性仍然是最大限度地提高PDT疗效的挑战。我们之前的工作揭示了癌细胞膜(CCm)可能具有期望的免疫逃避和同源靶向特性[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．在此，我们设计了仿生氧传递纳米探针，即癌细胞膜包覆的hsa - icg掺杂全氟三丁胺(CCm-HSA-ICG-PFTBA)，用于肿瘤部位的同源靶向和缺氧缓解。无创、动态gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-fluoromisonidazole (gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba进行F-FMISO)正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(PET/CT)成像以测量体内肿瘤部位的缺氧水平[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．我们同时使用CCm-HSA-ICG-PFTBA对4T1小鼠异种移植瘤进行PDT治疗，观察肿瘤部位氧合缓解对治疗效果的增强(SchemegydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

CCm-HSA-ICG-PFTBA的制备及表征gydF4y2Ba

以HSA为载体稳定ICG和PFTBA。采用搅拌和超声法制备了HSA-ICG-PFTBA。使用我们之前研究中描述的程序从4T1细胞加工CCm [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．采用物理挤压法制备CCm-HSA-ICG-PFTBA [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．动态光散射(DLS)显示，HSA-ICG-PFTBA的水动力尺寸为98.11±6.99 nm, CCm-HSA-ICG-PFTBA的水动力尺寸为131.3±1.08 nm(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa, b). zeta电位结果显示，CCm - hsa - icg - pftba的表面电位与CCm的表面电位相似(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac)，表明CCm已成功涂覆在HSA-ICG-PFTBA表面。CCm-HSA-ICG-PFTBA和HSA-ICG-PFTBA在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中保存5天，均表现出良好的水动力尺寸稳定性(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).通过透射电镜(TEM)验证了CCm-HSA-ICG-PFTBA和HSA-ICG-PFTBA的结构(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba练习)。gydF4y2Ba

通过紫外-可见光谱和荧光光谱观察到CCm-HSA-ICG-PFTBA中ICG的特征峰。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa)，表明CCm涂层对ICG的光学性能没有影响。在黑暗条件下，CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba和HSA-ICG的ICG峰几乎没有退化，而在ICG水溶液中观察到63%的退化(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1a-e)，表明ICG降解在HSA的帮助下得以克服。在37℃的血清中进行释放研究，HSA-ICG-PFTBA在孵育12 h后释放了约70%的ICG，显著高于CCm-HSA-ICG-PFTBA(约20%，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001，图;gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)，说明癌细胞膜涂层使该纳米探针具有稳定性，降低了ICG泄漏。为了验证氧增强能力，测量了不同溶液中的氧浓度。预加氧CCm-HSA-ICG-PFTBA组(100 s内9 ~ 22.23 mg/L)比同量预加氧水组(150 s内9 ~ 17.23 mg/L)氧浓度更高，增氧速度更快(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac).这些结果表明CCm-HSA-ICG-PFTBA具有提高氧浓度的能力。gydF4y2Ba

在体外gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和ROS评价gydF4y2Ba

来测量gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2BaCCm-HSA-ICG-PFTBA的生成能力gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba指示灯为单线态氧传感器绿(SOSG)。近红外激光照射下，CCm-HSA-ICG-PFTBA和HSA-ICG - pftba的荧光明显高于HSA-ICG (gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001，图;gydF4y2Ba2gydF4y2BaD)，说明越高gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba发电能力产生于PFTBA。为了测量ROS浓度，我们使用二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为指示剂。4T1细胞与DCFH-DA孵育，DCFH-DA易于被细胞内酯酶裂解成2,7-二氯荧光素(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaDCF) [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．近红外激光照射后，生成的ROS氧化HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaDCF到DCF，产生绿色荧光，其强度与ROS浓度成正比[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa，近红外激光照射下，CCm-HSA-ICG-PFTBA组和HSA-ICG - pftba组可见较强的绿色荧光，而HSA-ICG组和盐水组的绿色荧光可以忽略。这些结果与流式细胞术的结果一致，CCm-HSA-ICG-PFTBA组(94.5%)和HSA-ICG - pftba组(89.0%)的荧光强度明显高于HSA-ICG组(28.3%)和生理盐水对照组(20%)，图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).高的结果gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2BaROS浓度表明CCm-HSA-ICG-PFTBA可通过PFTBA的高氧容量增强体外PDT疗效。gydF4y2Ba

体外细胞毒性gydF4y2Ba

为了评估PDT增强的细胞毒性，4T1细胞与不同浓度的样品孵育，有或没有近红外照射，细胞存活率通过细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)测量。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac，没有近红外照射的所有浓度对细胞的毒性可以忽略不计。对于近红外照射组，当ICG浓度高于7.5 μg/mL时，CCm-HSA-ICG-PFTBA的毒性显著高于HSA-ICG - pftba和HSA-ICG。浓度越高，毒性越明显。gydF4y2Ba

活体荧光成像gydF4y2Ba

为了确定PDT的最佳时间窗口，我们在4T1小鼠异种移植中检测了CCm-HSA-ICG-PFTBA的体内肿瘤分布。分别于注射CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba、HSA-ICG和生理盐水后0、3、6、9、12、24、36、48 h获得ICG荧光信号，均经尾静脉注射。我们发现CCm-HSA-ICG-PFTBA组的肿瘤荧光比其他组更强，并持续到注射后48 h(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa). HSA-ICG组肿瘤荧光迅速消退，肿瘤部位残留信号归因于血池放射。肝脏是众所周知的吞噬细胞富集网状内皮系统(RES)的主要部位之一[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]从而积累大部分外源物质[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．CCm-HSA-ICG-PFTBA的肝脏蓄积量明显低于HSA-ICG-PFTBA，说明癌细胞膜覆盖降低了RES的摄取。注射后48 h，采集主要器官和肿瘤进行离体荧光成像。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab，与其他各组相比，CCm-HSA-ICG-PFTBA组肿瘤荧光增高，肝脏和脾脏荧光降低。荧光成像结果表明，CCm-HSA-ICG-PFTBA可同源靶向肿瘤，增强免疫逃逸。gydF4y2Ba

体内和体外肿瘤氧化增强gydF4y2Ba

在验证这些纳米探针在体内的分布后，我们的目的是确认肿瘤微环境的缺氧是否得到缓解。gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO PET成像广泛用于测量体内肿瘤缺氧[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．肿瘤缺氧是异质性的，在肿瘤生长过程中呈现复杂的动态变化[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．为gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO PET/CT成像，摄取越多，缺氧水平越高。的gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba注射纳米探针前的F-FMISO PET/CT成像显示各组肿瘤放射性摄取均较高(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).然后通过尾静脉给药CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba、HSA-ICG和生理盐水。注射后24小时，gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba第二次进行F-FMISO PET/CT成像(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).注射CCm-HSA-ICG-PFTBA后，包括肿瘤部位在内的全身放射性全局性降低。注射HSA-ICG - pftba后肿瘤摄取无明显变化，而注射HSA-ICG和生理盐水后肿瘤摄取略有增加，这是由于4T1异种移植瘤生长较快(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).考虑到HSA-ICG组和生理盐水组肿瘤生长较快，以及成像结果，注射HSA-ICG - pftba后肿瘤缺氧情况略有缓解。绘制roi，定量分析肿瘤部位SUVmax后，CCm-HSA-ICG-PFTBA组肿瘤后SUVmax(0.33±0.09)明显低于肿瘤前SUVmax(1.25±0.11)(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001，图;gydF4y2Ba5gydF4y2Bad).注射后24 h注射CCm-HSA-ICG-PFTBA后肝脏放射性摄取也显著降低(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2a, b)。其他各组肿瘤及肝脏SUVmax前后差异均无统计学意义(图S2a, b)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2b)。gydF4y2Ba

取各组离体肿瘤切片，用缺氧探针(盐酸哌硝唑)进行免疫荧光染色，进一步确认氧浓度。注射CCm-HSA-ICG-PFTBA后缺氧面积明显减少，由注射前的87.4%降至注射24 h后的8.3%(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC, e)，下降了十倍。HSA-ICG - pftba组和HSA-ICG组缺氧改善较少(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3)。注意到缺氧区域(绿色)和血管(红色)的荧光都下降了，这是由于PDT过程中血管的关闭作用[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．上述结果表明，CCm-HSA-ICG-PFTBA可缓解肿瘤缺氧，是提高PDT疗效的理想策略。gydF4y2Ba

体内PDT疗效评价gydF4y2Ba

对4T1异种移植进行体内PDT疗效评价。将小鼠随机分为8组，分别注射CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba、HSA-ICG和生理盐水(第0天)，在注射后24 h(第1天)有或没有近红外激光照射。gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba在第2天、第7天和第14天进行F-FDG PET成像以监测肿瘤负荷(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S4)。第7、14天，CCm-HSA-ICG-PFTBA联合NIR组肿瘤与肌肉放射性(T/M)比明显低于生理盐水组(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.03和gydF4y2BaPgydF4y2Ba分别在第7天和第14天= 0.04，图;gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)，并逐渐降低，其他各组均升高(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).肿瘤体积归一化至初始大小。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac, CCm-HSA-ICG-PFTBA加NIR组归一化肿瘤体积增长明显减缓(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.01)高于HSA-ICG + NIR组和生理盐水对照组(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)，第14天(图;gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).无NIR组的CCm-HSA-ICG-PFTBA和HSA-ICG - pftba，以及有无NIR组的HSA-ICG和盐水之间无显著差异。第14天，处死所有小鼠，称肿瘤重量。CCm-HSA-ICG-PFTBA联合NIR组肿瘤平均重量显著低于HSA-ICG联合NIR组和盐水对照组(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.038和gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.002，分别;无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).其他组间无显著差异。肿瘤照片如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae.上述结果提示CCm-HSA-ICG-PFTBA可增强PDT疗效，缓解肿瘤生长。gydF4y2Ba

在14天的实验期间，所有组都没有观察到死亡或体重显著下降(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa).第14天，对所有小鼠实施安乐死，采集血液和主要器官进行血液化验和苏木精-伊红(H&E)染色。治疗组与生理盐水对照组的血液参数和血液化学指标无显著差异(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba抵扣)。此外，在h&e染色切片上未观察到明显的器官损伤(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Baf).因此，这些结果表明CCm-HSA-ICG-PFTBA在体内没有明显的毒性。gydF4y2Ba

在本研究中，我们设计了一种癌细胞膜包覆氧传递纳米探针CCm-HSA-ICG-PFTBA，该探针具有合适的结构特征、稳定的光学性质、高生物相容性，且无明显的生物毒性，是一种理想的生物医学应用。CCm-HSA-ICG-PFTBA利用癌细胞膜涂层的同源靶向和免疫逃避能力，以及PFTBA的氧传递功能，改善了肿瘤环境的缺氧，增强了PDT在TNBC异种移植中的治疗效果，表明CCm-HSA-ICG-PFTBA能够促进TNBC治疗的发展。gydF4y2Ba

此外，涂覆细胞膜也能稳定纳米探针。本研究中，裸HSA-ICG-PFTBA透析后12 h, ICG在血清中的释放量为70%，是CCm-HSA-ICG-PFTBA的3.5倍(释放量为20%)。吴等人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba另据报道，癌细胞膜涂层可抑制阿霉素和伊克替尼的释放装入纳米颗粒[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．纳米颗粒包裹的药物释放缓慢，可以保证在血液中的长循环，降低全身毒性，使仿生纳米颗粒成为癌症治疗中药物传递的强大载体。gydF4y2Ba

^18gydF4y2Ba采用F-FMISO PET/CT成像检测体内肿瘤部位的缺氧情况。注射CCm-HSA-ICG-PFTBA后，包括肿瘤和肝脏在内的全身放射性均降低。这可以解释为，癌细胞膜包衣后，CCm-HSA-ICG-PFTBA更稳定，血液循环时间延长，其中一些还可以被RES捕获，在全身血流中循环，从而导致整体氧合水平提高。虽然癌细胞膜包衣在一定程度上可以降低RES的摄取，但CCm-HSA-ICG-PFTBA的排泄途径多以肝脏为基础。由于PFTBA的供氧能力，肝脏氧合水平升高，导致肝脏对放射性的摄取大大降低gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO。gydF4y2Ba

注射HSA-ICG-PFTBA后肿瘤放射性摄取无明显变化。根据HSA-ICG组和生理盐水组肿瘤生长较快的影像学结果，可以认为注射HSA-ICG - pftba后肿瘤缺氧情况略有缓解。可以解释为HSA-ICG-PFTBA由于缺乏癌细胞膜涂层，纳米探针的不稳定性和免疫系统的清除使其不能均匀分布于全身，这与ICG释放研究的结果一致(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab).注射HSA-ICG-PFTBA后肿瘤缺氧情况略有改善，可归因于实体肿瘤的通透性和潴留(EPR)效应增强，但无论如何仍不如CCm-HSA-ICG-PFTBA的同源靶向作用有效。我们注意到，在免疫荧光染色中，缺氧区(绿色)和血管(红色)的荧光都下降了，这是由于PDT过程中血管的关闭作用。PDT过程中产生的ROS可损伤血管内皮细胞，引起血管关闭，这是PDT治疗肿瘤的重要机制[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

这项研究仍有一些局限性。虽然我们在TNBC治疗中达到了部分缓解肿瘤生长和轻微增强疗效的目的，但肿瘤生长并没有完全被抑制或消退。在这里，我们只进行了单药PDT治疗。据报道，联合治疗的疗效优于单一治疗[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．因此，将仿生送氧PDT策略与化疗、基因治疗、免疫治疗等其他治疗方法相结合将会更加有效。这些联合疗法的疗效仍需进一步验证。gydF4y2Ba

综上所述，我们成功设计了一种仿生氧传递纳米探针CCm-HSA-ICG-PFTBA，其中PFTBA核心可以溶解大量氧气，癌细胞膜涂层具有同源靶向和免疫逃避能力。我们使用的是非侵入性和动态的gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO PET/CT成像测量体内缺氧水平gydF4y2Ba，gydF4y2Ba并证明肿瘤部位有明显的缺氧作用。在给药CCm-HSA-ICG-PFTBA后，由于氧的输送，PDT的治疗效果进一步增强，并且没有对治疗动物造成明显的额外副作用。由于纳米探针中使用的HSA、ICG和PFTBA都是fda批准的，并且具有高度的生物相容性，因此纳米探针可能具有临床转化为缓解肿瘤缺氧的有效氧气输送剂的潜力。此外，还有许多其他受氧含量影响的疗法，如放射治疗[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]、免疫疗法[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]、化疗[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，以及声动力疗法[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．这种仿生氧传递纳米探针的策略可能是提高低氧限制治疗效果的一种有前景的方法。gydF4y2Ba

材料gydF4y2Ba

HSA、ICG和全氟三丁胺(PFTBA, 98%)购自Sigma-Aldrich(圣路易斯密苏里州，美国)。rmi -1640培养基、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)、青霉素-链霉素和胎牛血清(FBS)购自Gibco Life Technologies (Gaithersburg MD, USA)。4 '，6-二胺基-2-苯吲哚(DAPI)、多聚甲醛和细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)购自Boster生物技术(中国武汉)。低氧探针和套件从北太平洋国际公司购买。单线态氧传感器绿色(SOSG)购自赛默飞世尔科技有限公司(中国上海)。活性氧含量测定试剂盒(DCFH-DA)购自北京太阳神科技有限公司。gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO NITTP购自华谊同位素有限公司(中国江苏)。所有的水溶液都是用去离子水(DI水)经净化系统净化制备的。本工作中使用的其他试剂购自阿拉丁试剂(中国上海)。gydF4y2Ba

CCm-HSA-ICG-PFTBA的制备gydF4y2Ba

将HSA (20 mg)加入去离子水(1 mL)中搅拌10 min, ICG溶于去离子水(1 mg/mL)中，分散于HSA溶液中，37℃摇30 min，得到HSA - ICG。PFC 0.1 mL, 300 W超声冰浴8 min(超声7 s，每10 s静置3 s)，逐渐加入，制得HSA-ICG-PFTBA。用超滤离心管(Millipore分子量截断值= 30 kDa)去除游离ICG。gydF4y2Ba

根据先前的报道，可以通过使用低渗裂解、机械膜破坏和差速离心相结合的方法排空收获的4T1细胞的细胞内内容物来实现癌细胞膜的衍生[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在HSA-ICG-PFC表面涂层的CCm是用我们之前研究中使用的方法制备的，如报道[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．将HSA-ICG-PFC溶液(1ml)按不同比例与制备的ccm -囊泡混合。随后将混合物通过400 nm多孔聚碳酸酯膜挤压11次。得到的CCm-HSA-ICG-PFC保存在PBS中4℃备用。gydF4y2Ba

CCm-HSA-ICG-PFC的表征gydF4y2Ba

采用动态光散射法(DLS;Man 0486，马尔文，英国)。通过透射电子显微镜(TEM;Talos F200X, FEI，荷兰)。将含有HSA-ICG-PFC、CCm-HSA-ICG-PFC或ccm -囊泡的液滴与铜网接触60 s，用1%磷钨酸负染30 s，用吸水纸干燥后表征。采用DLS监测动态直径，在1× PBS中测定HSA-ICG-PFC和CCm-HSA-ICG-PFC 5 d，进行稳定性实验。gydF4y2Ba

用多功能酶标仪测定ICG的荧光。光激发波长为710 nm，发射波长为740 ~ 850 nm。采用808 nm激光照射(1 W/cm)测定ICG的光稳定性gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba用紫外-可见光谱法测定不同样品ICG在黑暗条件下的存储稳定性，直至60 h。将两种样品分别放入透析袋(MWCO10k)，并将透析袋放入15 mL血浆中作为释放介质，测定ICG在CCm-HSA-ICG-PFTBA和HSA-ICG-PFTBA (80 μg/mL)中的释放量。分别于2、4、8、12 h通过紫外-可见光谱检测ICG在血浆中的释放量，并根据标准曲线计算。gydF4y2Ba

采用溶解氧仪进行氧释放实验，测定不同溶液中的氧浓度。样品溶液(10 mL)预充氧，并加入50 mL脱氧水中。用溶解氧计监测水中氧浓度，每5秒记录一次，持续800秒。gydF4y2Ba

在体外gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和ROS评价gydF4y2Ba

应用SOSG检测gydF4y2Ba^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生成这些样本。在黑色96孔板中加入100 μL不同的样品，ICG (50 μg/mL)浓度相同，SOSG (50 μL)浓度相同。在808 nm激光照射下，用多功能酶标仪每10 s记录氧化SOSG (Ex/Em = 504/525 nm)的荧光。gydF4y2Ba

采用DCFH-DA (Ex/Em = 495/529 nm)共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)显示ROS。4T1细胞接种于密度为1 × 10的共聚焦玻璃底皿中gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞。孵育24 h后，加入含有CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba、HSA-ICG和PBS的培养液，ICG浓度为10 μg/mL，孵育3 h。PBS洗涤3次后，加入含有DCFH-DA (25 μM)的培养基与细胞孵育30 min。PBS洗涤3次后，将细胞分为两组，分别用808 nm激光照射(2 W/cm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)持续20秒(每照射10秒后暂停30秒)。然后用4%的聚合物甲醛固定细胞，用4 '，6-二氨基苯基吲哚(DAPI)标记细胞核。采用CLSM法检测DCF的绿色荧光。gydF4y2Ba

流式细胞术定量反映ROS的生成。该过程与荧光成像相似。4T1细胞以1 × 10的密度接种于6孔板中gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba用DCFH-DA (25 μM)染色30 mingydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)持续20 s(每照射10 s后暂停30 s)，将细胞离心，重新悬浮于300 mL PBS中，流式细胞仪分析。在FL1通道上检测到绿色荧光(Ex/Em = 488/525 nm)。gydF4y2Ba

体外细胞毒性gydF4y2Ba

采用CCK-8法评价CCm-HSA-ICG-PFTBA增强PDT疗效。4T1细胞以5 × 10的密度接种于96孔板中gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba分别加入CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba和HSA-ICG，在不同浓度的ICG(1.25、2.5、5、7.5、10、20和40 μg/mL)下与细胞孵育3 h。生理盐水组为对照组。用808 nm激光(2 W/cm)照射细胞gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)持续20秒(每照射10秒后暂停30秒)。共孵育2 h后，PBS清洗细胞，加入新鲜培养基。再孵育24 h后，将不含血清(90 μL)的新鲜培养基与CCK-8 (10 μL)混合加入孔中，再孵育2 h。最后，用酶标仪(Bio-rad, Hercules CA, USA)在450 nm处测定细胞每孔的吸光度值，分析细胞活力。测量并减去孔板的背景吸光度。gydF4y2Ba

动物和肿瘤模型gydF4y2Ba

动物按照《实验动物护理和使用指导建议》的指导进行护理。Balb/c雌性小鼠(6周)购自北京华福康生物科技有限公司。为了获得荷瘤小鼠，切除上肢毛发。然后是1 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba每只小鼠右上肢皮下注射4T1细胞。当肿瘤体积达到60 ~ 250 mm时，取荷瘤小鼠进行进一步实验gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

活体荧光成像gydF4y2Ba

当肿瘤体积达到100-150 mm时gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba时，BALB/c小鼠随机分为4组。荷瘤小鼠经尾静脉注射CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba、HSA-ICG (200 μL, ICG 0.8 mg/kg)和生理盐水。所有小鼠均用异氟醚麻醉。利用成像系统(Ex/Em = 710/790 nm)获得小鼠在不同时间点(0、3、6、12、24、36、48 h)的荧光图像。然后处死所有小鼠，取主要器官(心、肺、肝、脾、肾)及肿瘤进行离体荧光成像。gydF4y2Ba

活体微PET/CT成像gydF4y2Ba

PET/CT成像在微型PET/CT上进行(Trans-PET Discoverist 180, Raycan科技有限公司，苏州，中国)。gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO和gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG由中国武汉协和医院PET中心生产。为gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO PET/CT成像，第1天，每只小鼠注射5.55 MBq (150 μCi)gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO通过尾静脉。第2天，将小鼠分为4组，分别注射CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba、HSA-ICG (200 μL, ICG 0.8 mg/kg)和生理盐水。24 h后，第3天，小鼠再次注射5.55 MBq (150 μCi)gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO通过尾静脉。从注射后1小时开始进行10分钟的静态扫描gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FMISO，扫描期间小鼠保持异氟醚麻醉。gydF4y2Ba

为gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET成像，每组小鼠随机注射5.55 MBq (150 μCi)gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG经尾静脉。注射后1 h进行10 min静态扫描。所有的老鼠gydF4y2Ba^18gydF4y2BaF-FDG PET成像在探针注射前禁食一晚，在异氟醚麻醉下维持，并在注射、等待期和扫描期间保持温暖。gydF4y2Ba

利用有序子集期望最大化(OSEM)算法对图像进行重构。对于每张微PET图像，使用Amide在衰减校正图像上的肝脏、肿瘤和对侧肌肉上绘制3.0 mm直径的球形感兴趣区域(ROIs)，以获得每克组织注射剂量的百分比(%ID/g)，并测量肿瘤、肝脏的SUVmax，并计算肿瘤与对侧肌肉(T/M)比。ROI包括整个肿瘤和肝脏的最高摄取点，不包括坏死区域。gydF4y2Ba

体外免疫荧光染色gydF4y2Ba

缺氧探针+试剂盒用于组织染色和检测缺氧。将荷瘤小鼠经尾静脉注射CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba、HSA-ICG (200 μL, ICG 0.8 mg/kg)，分为6组(0、6、12、24、36、48 h)，然后经尾静脉注射盐酸吡莫硝唑(60 mg/kg, Hypoxyprobe plus kit)。90 min后，处死所有小鼠，取肿瘤进行免疫荧光染色[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．缺氧时荧光为绿色，细胞核用DAPI荧光为蓝色，血管用anti-CD31荧光为红色。所有切片均采用CLSM检测。gydF4y2Ba

体内光动力疗法和系统毒性gydF4y2Ba

当肿瘤大小达到60毫米左右时gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba，将小鼠随机分为8组(n = 6)。治疗组分别为:CCm-HSA-ICG-PFTBA (NIR)、CCm-HSA-ICG-PFTBA、HSA-ICG - pftba (NIR)、HSA-ICG - pftba、HSA-ICG (NIR)、HSA-ICG、生理盐水(NIR)、生理盐水。试验第0天，各组分别尾静脉注射不同样品(200 μL, ICG为0.8 mg/kg)。24 h后，即第1天，所有NIR组均采用808 nm激光照射(2 W/cm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)照射2分钟(每照射30秒后暂停1分钟)。gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba分别于第2、7、14天进行F-FDG PET成像和拍照，以评估肿瘤负荷。在14天内，每2天记录一次肿瘤的长度、宽度和小鼠体重。肿瘤体积按公式V = D × D计算gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/2 (D为肿瘤最长直径，D为肿瘤最短直径)肿瘤相对体积以V/V计算gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba(VgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba为第0天的肿瘤原体积)。第14天处死小鼠，对肿瘤称重并拍照。gydF4y2Ba

为了评估全身毒性，在第14天对所有小鼠实施安乐死，采集其血液和主要器官(心、肺、肝、脾、肾)进行血液生化测试(红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、白细胞(WBC)、淋巴细胞百分比(淋巴%)、单核细胞百分比(Mon%)、中性粒细胞百分比(Neu%)、血液学检查[碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)]，组织学分析(苏木精和伊红(H&E)染色切片)。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

结果以均数±均数的标准误差表示。使用GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad software, San Diego CA, USA)进行数据分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析各组间差异，然后进行Tukey后验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05为有统计学意义。gydF4y2Ba

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本手稿中。gydF4y2Ba

TNBC:gydF4y2Ba

三阴性乳腺癌gydF4y2Ba

呃:gydF4y2Ba

雌激素受体gydF4y2Ba

公关:gydF4y2Ba

孕激素受体gydF4y2Ba

HER2:gydF4y2Ba

人表皮生长因子受体2gydF4y2Ba

PDT:gydF4y2Ba

光动力治疗gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

^1gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

单线态氧gydF4y2Ba

PFC:gydF4y2Ba

全氟化碳gydF4y2Ba

PFTBA:gydF4y2Ba

PerfluorotributylaminegydF4y2Ba

近红外光谱:gydF4y2Ba

近红外gydF4y2Ba

协调小组:gydF4y2Ba

吲哚菁绿gydF4y2Ba

食品药品监督管理局:gydF4y2Ba

美国食品和药物管理局gydF4y2Ba

保险公司:gydF4y2Ba

人血清白蛋白gydF4y2Ba

CCm:gydF4y2Ba

癌细胞膜gydF4y2Ba

CCm-HSA-ICG-PFTBA:gydF4y2Ba

癌细胞膜包被人血清白蛋白-吲哚青绿掺杂全氟三丁胺gydF4y2Ba

^18gydF4y2BaF-FMISO:gydF4y2Ba

^18gydF4y2BaF-FluoromisonidazolegydF4y2Ba

PET / CT:gydF4y2Ba

正电子发射断层扫描/计算机断层扫描gydF4y2Ba

DLS:gydF4y2Ba

动态光散射gydF4y2Ba

PBS:gydF4y2Ba

磷酸盐gydF4y2Ba

透射电镜:gydF4y2Ba

透射电子显微镜gydF4y2Ba

SOSG:gydF4y2Ba

单线态氧传感器绿色gydF4y2Ba

DCFH-DA:gydF4y2Ba

Dichloro-dihydro-fluorescein二乙酸gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba贴现:gydF4y2Ba

2, 7-DichlorofluorescingydF4y2Ba

CCK-8:gydF4y2Ba

细胞计数套件-8gydF4y2Ba

RES:gydF4y2Ba

网状内皮系统gydF4y2Ba

T / M比率:gydF4y2Ba

Tumor-to-muscle比率gydF4y2Ba

):gydF4y2Ba

苏木精和伊红gydF4y2Ba

EPR效应:gydF4y2Ba

增强渗透性和保留率gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

国家自然科学基金(No. 81630049、81771863)资助。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 华中科技大学同济医学院协和医院核医学科，湖北武汉430022gydF4y2Ba

   方汉义，盖永康，刘庆尧，张晓，叶敏，谭建玲，龙宇，王观银，张永学，兰晓莉gydF4y2Ba

2. 湖北省分子成像重点实验室，武汉430022gydF4y2Ba

   方汉义，盖永康，刘庆尧，张晓，叶敏，谭建玲，龙宇，王观银，张永学，兰晓莉gydF4y2Ba

3. 华中科技大学同济医学院药学院，湖北武汉430030gydF4y2Ba

   盛王gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

XL, YZ和HF设计了这项研究。HF、SW、MY、JT、YL、KW进行了实验室相关实验。YG, QL和XZ分析数据。H.F.写了手稿。XL和YG编辑了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba小李局域网gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

所有动物实验均符合华中科技大学同济医学院实验动物中心的指导方针和标准。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

所有作者均同意发表。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有利益竞争。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba