基因组不稳定性衍生的血浆细胞外囊泡microrna特征是乳腺癌风险和不良预后的微创预测因子gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

乳腺癌(BC)是最常诊断的癌症，也是女性癌症相关死亡的主要原因。最近的研究表明，microRNA (miRNA)在基因组不稳定性(GI)中的调控与疾病风险和临床结果相关。在本文中，我们旨在识别细胞外囊泡(ev)中gi衍生的miRNA标记，作为早期诊断和预后风险分层的微创生物标志物。gydF4y2Ba

实验设计gydF4y2Ba

通过整合分析miRNA表达和体细胞突变谱来鉴定gi相关miRNA。然后，我们构建了一个多中心前瞻性队列的发现和验证研究。gi衍生miRNA签名(miGISig)是在TCGA发现队列(n = 261)中开发的，随后在TCGA内部验证队列(n = 261)和GSE22220队列(n = 210)中独立验证，用于预后预测，并在GSE73002 (n = 3966)、GSE41922 (n = 54)和内部临床外泌体队列(n = 30)中进行诊断性能验证。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们鉴定出gi衍生的3个miRNA签名(gydF4y2BaMIR421gydF4y2Ba，gydF4y2BaMIR128-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMIR128-2gydF4y2Ba)在BC患者的血清细胞外囊泡中，这在所有测试的队列中都与不良预后显著相关，并且使用多变量分析仍然是一个独立的预后因素。当与临床特征结合时，复合mirna -临床预后指标显示出改善的预后性能。在GSE73002、GSE41922和TCGA队列中，miGISig在受试者工作特征曲线(ROC)下的面积分别为0.915、0.794和0.772，在区分BC与健康对照组方面也表现出较高的准确性。此外，在内部队列中，来自BC患者的循环ev的miGISig水平升高，具有有效的诊断准确性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们报道了ev中一个新的gi衍生的3个miRNA标记，作为BC早期诊断和不良预后的极好的微创生物标志物。gydF4y2Ba

乳腺癌(BC)是最常见的癌症类型之一，占女性所有新诊断癌症的30%。卑诗病的发病率在过去几十年大致保持稳定[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．尽管最近在检测方法和治疗选择方面有所改进，但BC仍然是一个重要的全球公共卫生问题，患者的临床结果因诊断阶段和分子亚型而显著不同[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．经典的临床病理特征，包括肿瘤大小、组织学亚型和分级、淋巴浸润、淋巴结转移、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2 (HER2)对指导临床决策有有效价值;血清肿瘤标志物，如癌胚抗原(CEA)、癌抗原19-9 (CA19-9)、癌抗原125 (CA125)、癌抗原15-3 (CA15-3)，已被典型用于随访监测[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．然而，BC患者仍然面临着不同的生物学和临床行为，由于高分子和细胞异质性[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．因此，迫切需要识别可靠、稳健的生物标志物，在微创的情况下加强BC患者的早期风险发现和预后预测，以提高临床管理和治疗决策。gydF4y2Ba

基因组不稳定性(GI)被定义为基因组变化倾向于增加并可影响表型的过程[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]，并已被认为是大多数类型癌症的一个不断发展的标志或特征[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．GI促进肿瘤间和肿瘤内的异质性，是癌细胞存活、增殖和扩散的主要驱动力[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．在BC细胞中常见到频繁的GI，包括数量和结构的基因组改变[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．BC中GI的分子基础尚未完全阐明，BC可能具有巨大的GI衍生异质性;因此，了解GI在BC中的分子基础，不仅可以确定BC的分子病因和病理，而且可以开发更好的癌症预防、诊断和预后方法[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

MicroRNA (miRNA)是一种进化上保守的单链非编码小RNA，通过完全或不完全结合靶mRNA诱导mRNA降解或翻译抑制[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．越来越多的证据强调了mirna的重要作用，作为各种生物过程的关键主调控因子，包括细胞分化、发育和稳态[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．miRNA功能失调在癌症发病机制中起重要作用[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．先前的研究揭示了几种miRNAs通过损害DNA修复来增强GI或通过增强对DNA损伤的反应来预防GI [gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．此外，GI可能由肿瘤来源的大分子(如mirna)通过ev的水平转移介导[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．然而，这些gi相关miRNAs的改变是否可以在ev中检测到，从而在BC中作为有希望的微创生物标志物具有临床应用价值，目前还没有研究。gydF4y2Ba

在本研究中，我们旨在基于突变假说，通过整合表达和体细胞突变谱，鉴定GI涉及的miRNA，并建立GI来源的miRNA签名(miGISig)，用于BC患者的早期诊断和预后预测。此外，我们还发现了新发现的三种miRNAs在GI调节中的功能作用，最后，我们评估了miGISig作为循环外泌体中的微创生物标志物的使用，以从无症状对照中识别BC患者。gydF4y2Ba

BC中gi相关miRNAs的鉴定gydF4y2Ba

使用TCGA-BC队列对gu样组和gs样组之间的miRNA表达进行了差异分析，其中鉴定出18个差异表达的miRNA (DEmiRNAs)(补充文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。其中，与gu样肿瘤相比，gs样肿瘤中分别有14个和4个miRNAs表达上调和下调。基于18种DEmiRNAs表达水平的无监督分层聚类分析产生了两个患者聚类:gs样聚类(n = 318)和gu样聚类(n = 204)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).与gs样组相比，gu样组的体细胞突变频率明显较高(中位数为57.5 vs. 29;P < 0.001, Mann-Whitney U检验;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).同时，的表达水平gydF4y2BaUBQLN4gydF4y2Bagus样组基因和非整倍体评分显著高于gs样组(P < 0.001, Mann-Whitney U检验;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac和gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).对18个demirnas特异性mRNA靶点的功能富集分析确定了几个富集的生物学过程和途径(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae和gydF4y2Ba1gydF4y2Baf)，包括转化生长因子(TGF)-β，转录调控，负调控GgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba有丝分裂细胞周期的/S转变和细胞对DNA损伤刺激的反应，以及Notch信号通路，这些都是已知的gi相关的生物学通路。此外，gu样组和gs样组之间的OS时间有显著差异(中位OS, 11.7 vs. > 16年;P = 0.027, log-rank检验;无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Bag).这些结果表明，18种DEmiRNAs参与了GI，并与BC患者的预后相关。gydF4y2Ba

用于预后风险分层的gi衍生miRNA签名的开发和验证gydF4y2Ba

我们首先在TCGA发现队列中使用单因素和多因素Cox比例风险回归分析了18个gi相关mirna，并确定了三mirna签名(以下简称miGISig)如下:miGISig评分= (0.501 ×表达水平gydF4y2BaMIR421gydF4y2Ba) + (0.6808 ×表达水平gydF4y2BaMIR128-1gydF4y2Ba) +(−0.3617 ×表达水平gydF4y2BaMIR128-2gydF4y2Ba)(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S5)。当按最佳临界值(临界值，0.516)分层时，miGISig显示出显著的预后价值，危险组的Kaplan-Meier曲线显示，miGISig越高，预后越差(HR = 5.350, 95% CI 1.616-17.710;P = 0.002, log-rank检验;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa). migisig驱动的低风险组和高风险组的5年OS率分别为94.8和63.5%。miGISig的预后价值随后在多个独立数据集中得到验证，这与最初TCGA发现队列的结果一致。miGISig对生存时间具有显著或边缘显著的鉴别性(内部试验队列，P = 0.048, GSE22220队列，P = 0.075, log-rank检验;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab, c).这些结果表明miGISig在预测BC患者不良预后方面具有稳健的性能。gydF4y2Ba

接下来，我们进一步研究了miGISig与CSPM负担以及非整倍体评分之间的关系。在TCGA-BC队列中，高危组患者的CSPM负担和非整倍体评分明显高于低危组患者(中位体细胞突变56 vs. 34, P < 0.001;中位非整倍性评分14比9,P = 0.002;Mann-Whitney U检验;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad). GI是OV的核心特征之一。计算TCGA-OV患者的miGISig评分，与TCGA-BC队列相同。然后根据miGISig的中位数评分将这些患者分为gu样组和gs样组。与BC相似，gu样组CSPM负担和非整倍体评分明显高于gs样组(中位体细胞突变77 vs. 59.5, P < 0.001;中位非整倍性评分14.5 vs. 13, P = 0.033;Mann-Whitney U检验;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae).这些结果强调了miGISig与GI的相关性。gydF4y2Ba

miGISig与临床特征的关系gydF4y2Ba

我们首先比较了migisig衍生的高危组和低危组的临床特征，发现ER、PR和TP53突变存在显著差异(Additional filegydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S6)。高miGISig的患者更有可能表现为ER-/ pr阴性和高TP53突变率，而ER-/ pr阳性和低TP53突变率的患者在miGISig衍生的低风险组中富集，这表明miGISig与已知的预后因素额外相关。因此，为了进一步检验miGISig的预后价值是否独立于这些常见的临床病理因素，我们将miGISig的表现与常见的临床变量进行了比较，采用多因素分析。结果显示，在所有BC队列中，当对各种临床因素进行调整时，miGISig与不良预后之间存在显著相关性，表明miGISig是不良预后的独立预测因子(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2Ba

复合mirna -临床预后指标的建立gydF4y2Ba

为了进一步提高预后性能，我们将miGISig与分期、年龄相结合，在TCGA发现队列中拟合多变量cox回归模型，并建立了计算为(0.069 ×年龄)+ (0.527 ×分期)+ (1.363 × miGISig评分)的复合mirna -临床预后指标(CMCPI)。将发现队列的CMCPI评分中位数作为患者分层的临界值。值得注意的是，在所有BC队列中，CMCPI与预后显著相关，与CMCPI来源的低风险组患者相比，CMCPI来源的高危组患者的生存时间显著缩短(HR = 13.107, 95% CI 1.657-103.700，对于TCGA发现队列，P = 0.002;内部检测队列HR = 4.906, 95% CI 1.099 ~ 21.900, P = 0.022; GSE22220队列HR = 3.136, 95% CI 1.833 ~ 5.367, P < 0.001;无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa - c)。gydF4y2Ba

我们进一步比较了所有BC队列的CMCPI与miGISig、年龄和分期。在所有BC队列中，与年龄、分期和miGISig单独相比，CMCPI的5年ROC AUC分别为0.88、0.73和0.70，显著改善了生存估计。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad-f)。这些结果进一步加强了miGISig结合其他重要临床特征的临床意义，在预测BC患者不良预后方面具有有效的预测能力。gydF4y2Ba

miGISig对BC的微创诊断价值gydF4y2Ba

此外，我们接下来检查了miGISig用于BC风险评估的性能。我们首先进行比较表达分析gydF4y2BaMIR421gydF4y2Ba，gydF4y2BaMIR128-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMIR128-2gydF4y2Ba肿瘤和健康对照组之间的差异在TCGA、GSE73002和GSE41922队列中，这三种miRNAs在乳腺肿瘤中的表达明显高于健康对照组(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa-c)，这表明了它们在BC发展中的致癌作用，并强调了miGISig在BC风险评估中的潜力。因此，我们评估了miGISig检测BC患者的诊断准确性。在TCGA组(AUC = 0.772)、GSE73002组(AUC = 0.915)和GSE41922组(AUC = 0.794)中，miGISig可有效区分BC与健康对照组gydF4y2Bamir - 128 - 2gydF4y2Ba在GSE41922队列中(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Bad-f)，证明miGISig在BC风险预测中的可靠性和鲁棒性。gydF4y2Ba

为了进一步研究miGISig作为潜在微创诊断生物标志物的临床适应性，我们接下来使用小RNA-seq分析了来自我们内部临床队列的30个样本的循环外泌体中这些mirna的表达水平。与健康个体相比，外泌体的表达水平gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba而且gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba在BC患者血清中显著升高(P = 0.003gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba， P = 0.002gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba， Mann-Whitney U检验;无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag).此外，我们还评估了外泌体的诊断价值gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba而且gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba采用ROC分析，结果显示外泌体gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba(AUC = 0.825)和gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba(AUC = 0.835)是BC风险的显著预测因子。gydF4y2Ba4gydF4y2Bah)。此外，所有检测的mirna在BC I期患者中表达水平也显著升高(图S2A)。I期BC患者与健康个体的AUC分别为0.809和0.773gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba而且gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba，分别(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S2B)。综上所述，我们的结果验证并证实了来自公共BC数据集的硅内发现，并强调miGISig可以作为临床BC早期风险评估的微创诊断生物标志物。gydF4y2Ba

miGISig的过表达通过诱导s期阻滞增加基因组的不稳定性，并促进乳腺癌细胞的生长。gydF4y2Ba

由于多核和微核是基因毒性和染色体不稳定性的生物标志物[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]，我们检测了三种miRNAs过表达后多核和微核的频率。我们首先检测的表达水平gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba在BC细胞和健康的人类乳腺上皮细胞中，184A1和MCF-10A，然后选择基因组不稳定的非整倍体，MDA-MB-231细胞系，低水平表达这三种mirna进行以下实验(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa). miRNAs模拟物转染MDA-MB-231细胞，培养48 hgydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba显著增加(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).使用高含量系统，我们显示过表达的gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Bamir - 421gydF4y2BaMDA-MB-231细胞系中多核和微核的比例(分别为25、31和22%)gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba，组，对照组为18%)(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac).由于GI可由细胞周期调控缺陷引起[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]，我们检查了是否过度表达gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba导致细胞周期进程异常。FACS分析显示，S期细胞比例增加，G期细胞数量增加gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在MDA-MB-231和MCF-7细胞系中使用模拟物过表达三种miRNAs后，/M期减少(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3A及S3B)。与这些结果一致，CCK-8实验表明，MDA-MB-231和MCF-7细胞系的增殖能力在过表达后显著增强gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而且gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S3C)。这些结果表明miGISig与GI相关，可能作为癌基因促进乳腺癌细胞的生长。gydF4y2Ba

BC是最常诊断的癌症，也是女性癌症相关死亡的主要原因。在BC精准医疗的发展方面做出了相当大的努力;但其早期诊断和预后风险分层，采用微创方法仍是临床的一大挑战。在本研究中，我们重点研究了涉及GI的mirna，通过表达改变和肿瘤突变体表型进行评估，并确定了18个候选GI相关mirna。18个候选GI相关miRNAs的靶基因在已知GI通路中富集。例如，TGF-β通过增强DNA损伤反应来维持基因组的稳定性[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．PI3K/Akt通路的激活可以支持肿瘤的生长和进展，并可能导致DNA修复的抑制，这可能有助于GI。最近的研究表明，持续的丝裂原活化蛋白激酶信号通路放松了细胞周期检查点，并允许细胞逃脱延长的GgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过诱导促有丝分裂激酶的积累而抑制，从而增强GI [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．DNA损伤反应(DDR)保证GI的维持，而最近的一份报告表明Notch是DDR的直接负调控因子。gydF4y2Ba

此外，18个候选gi相关miRNAs可以将BC患者分为预后显著不同的两类，gydF4y2BaUBQLN4gydF4y2Ba表达和非整倍体评分。最近的一项研究表明gydF4y2BaUBQLN4gydF4y2Ba是GI的基本驱动因子，其过表达抑制侵袭性肿瘤中同源重组介导的双链断裂修复[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．非整倍性评分反映臂级拷贝数改变的总负担，是染色体不稳定性的一个指标[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．这些结果为18个miRNAs在GI中的相关性提供了证据。这些参与GI的miRNAs的鉴定不仅将加深我们对GI生物学的认识，而且将为BC的早期诊断和预后提供新的候选。gydF4y2Ba

通过关注这些参与GI的miRNAs，我们确定了三种致癌miRNAs (gydF4y2BaMIR421gydF4y2Ba，gydF4y2BaMIR128-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMIR128-2gydF4y2Ba)，从18个GI相关候选mirna列表中获得了独立的预后价值，并产生了3个mirna签名，称为miGISig，可预测GI和临床结果。miGISig的预测价值通过其与TCGA和其他不同平台的公共BC数据集的临床结果和GI的相关性得到验证。此外，miGISig不仅是一个独立的预测因子，而且比其他临床因素具有更好或相当的性能。我们进一步利用分子和临床特征的互补价值，表明将miGISig与几个互补的临床因素结合起来，可以更准确地估计BC的预后。对于这里的miGISig，gydF4y2BaMIR421gydF4y2Ba有报道通过抑制DNA修复系统的核心成分共济失调-毛细血管扩张突变的表达，从而导致DNA修复失败，从而增强GI [gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．的过度表达gydF4y2BaMIR421gydF4y2Ba已被证明在BC和非小细胞肺癌中促进癌细胞增殖[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．gydF4y2BaMIR128-1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaMIR128-2gydF4y2Ba， miRNA的成员gydF4y2BaMIR128gydF4y2Ba亲情，编码着同样的成熟gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba其表达模式及在肿瘤发生发展中的作用在不同类型的癌症中存在差异。然而，在不列颠哥伦比亚省，人们对其与GI的关系知之甚少。我们在gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba功能分析表明，过表达miGISig可增加GI，诱导s期阻滞并促进乳腺癌细胞的生长。许多研究表明，miRNA表达异常不仅与癌症预后有关，而且是肿瘤发生的早期事件[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．此外，miRNA水平具有较高的稳定性和活性，这使得它们能够在血清、血浆和其他体液中检测，使用RT-qPCR、miRNA微阵列和深度测序技术[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，强调了循环miRNAs作为癌症微创生物标志物的优势。然而，循环mirna的机制和生物学影响仍然未知。外泌体是细胞驱动的囊泡，携带来自宿主细胞的核酸、蛋白质、脂质和代谢物[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．外泌体可以从血液和尿液等现成的生物液体中分离出来，这种微创优势为诊断应用提供了一种有吸引力的新型生物标志物[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．对于本文鉴定的miRNA标记物，其在BC微创诊断中的潜力尚不清楚。因此，我们整合了TCGA和GEO组织数据集的循环外泌体miRNA配置文件，发现与正常乳腺组织或健康受试者的循环外泌体相比，miGISig中的miRNA在BC组织和循环外泌体中均上调。此外，miGISig在区分BC与健康受试者方面显示出更高的有效性和稳定性。总的来说，这些结果表明miGISig是一种gi衍生的致癌因子，代表了一种有前途的用于BC检测和预后的微创临床基因组工具;然而，需要更多的队列来验证这些发现。此外，EVs中鉴定的miGISig提供了进一步的证据，支持外泌体介导的致癌miRNAs的传递与BC癌的发生和预后相关。从治疗的角度来看，EVs中致癌gi相关mirna的鉴定也暗示了潜在的治疗策略，即通过将抗mirna化合物或基于mirna的药物转染到外泌体中，干扰这些致癌外源性mirna的负载或传递，以靶向基因组不稳定性，作为BC的多模式治疗策略。gydF4y2Ba

总之，利用来自肿瘤、健康组织和循环外泌体的全基因组miRNA表达谱，我们的研究表明了gi相关miRNA的临床价值，并建立了gi衍生的三miRNA签名，允许早期发现和预后风险分层，对BC的侵袭最小。经过前瞻性队列研究的进一步调查，我们的研究强调了ev衍生的gi相关miRNAs作为一种微创基因组工具来改善BC精准医疗的潜在临床价值。gydF4y2Ba

研究设计gydF4y2Ba

总体研究设计如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．该研究采用多中心前瞻性队列，包括癌症基因组图谱(TCGA)-BC、GSE22220、GSE73002、GSE41922和内部临床外泌体队列。miGISig是在发现队列中发现的。然后将miGISig应用于一个内部验证队列和多个外部验证队列，以验证其在BC预后和诊断中的价值。通过体外功能实验研究了miGISig对BC生长的影响。gydF4y2Ba

公共rna测序(Seq)、微阵列和临床数据收集gydF4y2Ba

临床特征、miRNA-seq [Illumina HiSeq reads per million (RPM) type]表达数据、RNA-seq (Illumina HiSeq fragments per kbasase of transcript per million type)表达数据和乳腺癌和卵巢癌(OV)患者的体突变信息来自TCGA基因组数据共享数据入口(gydF4y2Bahttps://portal.gdc.cancer.gov/gydF4y2Ba)．仅保留女性患者的配对miRNA、mRNA表达谱、生存信息和体细胞突变信息等数据。使用上述信息的522个BC样本和355个OV样本被保留用于进一步调查。验证阶段使用的非tcga BC miRNAs微阵列数据集从基因表达综合(GEO)数据库(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)，包括GSE22220 (n = 210) [gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]， GSE73002 (n = 3966) [gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]和GSE41922 (n = 54) [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．本研究中使用的公共BC miRNA数据集在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1和表S2。gydF4y2Ba

等离子体外泌体数据集gydF4y2Ba

本研究从中国医学科学院肿瘤医院(CHCAMS)招募了30名受试者，包括20名BC患者和10名年龄匹配的健康女性。收集这30名受试者的外周血样本(10毫升)用于外泌体分离，根据先前报道的方案，通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)、透射电镜(TEM)和western blot分析确认了这一点[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．根据制造商的协议，使用Illumina HiSeq 2000平台进行小RNA-seq，并使用每百万读数(RPM)值计算miRNA表达水平。这项研究得到了CHCAMS伦理委员会的批准，所有参与者都提供了书面知情同意。gydF4y2Ba

建立miGISiggydF4y2Ba

每个TCGA样本的GI是使用癌症基因组内的累积体细胞点突变(CSPM)负担来测量的。CSPM负荷高(排在前25%)的肿瘤被定义为基因组不稳定(GU)样组，CSPM负荷低(排在后25%)的肿瘤被定义为基因组稳定(GS)样组。在gu样和gs样组之间差异表达的miRNAs被定义为候选gi相关miRNAs (GImiRs)。使用总生存时间的单变量Cox回归分析来确定GImiRs的预后。最后，构建miGISig如下:gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba\ (N \)gydF4y2Ba预后GImiRs的数量，miRNA的表达gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba预后GImiR的表达值是多少gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba，和系数gydF4y2Ba_我gydF4y2BaGImiR的估计回归系数是多少gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba在多变量Cox回归分析中。gydF4y2Ba

在发现队列中，使用代表受试者工作特征(ROC)曲线中100%真阳性率和0%假阳性率的点来确定风险分层的最佳截止值。gydF4y2Ba

细胞培养和转染gydF4y2Ba

MCF-7、BT549、SKBR-3、BT474、T47D、SW527和MDA-MB-231乳腺癌细胞系，以及184A1和MCF-10A正常人乳腺上皮细胞系购自美国类型培养收藏(ATCC;罗克维尔，MD，美国)。184A1和MCF-10A细胞株在含2 mM的DMEM-F12中保存gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺、20 ng/ml EGF、100 ng/ml霍乱毒素、0.01 mg/ml胰岛素、500 ng/ml氢化可的松和5%马血清(HyClone, USA)。MCF-7 细胞保存在含2 mM的DMEM中gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺，1mm丙酮酸钠，10mm HEPES和10% FBS (Gibco, USA)。BT549和SKBR-3细胞在添加10% FBS的RPMI-1640中培养，BT474和T47D细胞在含有2 mM的RPMI-1640中培养gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺、4.5 g/l葡萄糖、1.5 g/l碳酸氢钠、1 mM丙酮酸钠、0.01 mg/ml胰岛素、10 mM HEPES和5%胎牛血清。SW527细胞在含2 mM的DMEM中保存gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺，4.5 g/l葡萄糖，1.5 g/l碳酸氢钠，10%胎牛血清。所有细胞系在37°C的潮湿气氛中保持5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2BaMDA-MB-231 细胞在37°C的Leibovitz的L-15培养基中添加10% FBS。gydF4y2Ba

miRNA模拟转染gydF4y2Ba

序列gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba1-5pgydF4y2Ba，gydF4y2Bamir - 128gydF4y2Ba-gydF4y2Ba2-5pgydF4y2Ba而且gydF4y2Bamir - 421gydF4y2Ba均从miRBase数据库中获取。miRNAs模拟物和阴性对照由RiboBio(中国广州)设计和合成。miRNAs和对照的引物序列在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3。根据制造商的说明，使用HiperFect (Qiagen, Valencia, CA, USA)对miRNAs模拟物进行转染。gydF4y2Ba

逆转录-定量PCR (RT-qPCR)gydF4y2Ba

使用TRIzol®试剂(Thermo Scientific, Grand Island, NY, USA)分离总RNA，然后使用Quantscript RT试剂盒(Tiangen, Beijing, China)逆转录成cDNA。RT-qPCR分析使用StepOnePlus Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)按照标准程序进行。miRNA的相对表达水平归一化至U6，作为内源性对照。gydF4y2Ba

细胞增殖试验gydF4y2Ba

将MCF-7和MDA-MB-231细胞株以1 × 10的比例镀于96孔微板中gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba每孔细胞。在指定的时间点，使用Cell Counting Kit-8 (CCK8, Dojindo)测定细胞的活力，并使用BioTek Gen5系统(BioTeck, USA)在450nm处进行测量。实验重复三次，代表性实验如图所示。gydF4y2Ba

流式细胞仪(FACS)分析gydF4y2Ba

将MCF-7和MDA-MB-231细胞系转染到6孔微孔板中，以40-50%的融合度转染miRNAs模拟物并培养48小时(h)。收集的细胞按照制造商说明书使用细胞周期试剂盒(Beckman Coulter, Pasadena, CA, USA)孵育，并使用流式细胞仪(Beckman Coulter, Pasadena, CA, USA)分析结果。gydF4y2Ba

免疫荧光染色gydF4y2Ba

将细胞接种到6孔微孔板中，以40-50%合流度转染miRNAs模拟物，培养24小时。然后，将细胞重新接种到培养板中，培养24小时。细胞用4%多聚甲醛固定，用Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)渗透，DAPI(上海亿森生物技术有限公司)染色。5分钟后，用高含量分析(HCA, Thermo Scientific, USA)对细胞进行成像。gydF4y2Ba

综合预后指标的构建gydF4y2Ba

应用多因素cox回归分析，结合年龄、分期和miGISig构建综合预后指标。中位数评分用于综合预后指数的分界值。采用时间依赖性ROC曲线比较年龄、分期、miGISig和综合预后指数对预后的影响。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有统计分析均使用R软件(V.3.4.4)进行，软件包包括:' samr '、' ggpubr '、' survival '、' survminer '、' timeROC '和' ROCit '。Mann-Whitney U检验用于比较连续变量。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验进行生存分析。通过计算风险比(HR)和95%可信区间(CI)，对单个变量进行单变量和多变量Cox比例风险回归分析。采用显著性微阵列法进行差异表达分析，折变> 1.5或< 0.67，假发现率调整P < 0.05被认为是显著的。采用最近邻估计法计算随时间变化的ROC曲线。采用欧氏距离进行无监督层次聚类分析，确定患者之间的相似性，采用病房的联动方法合并相似对象。gydF4y2Ba

靶基因及miRNAs功能富集分析gydF4y2Ba

实验验证的mirna -靶标关系从The Encyclopedia of RNA Interactomes (ENCORI)获得，gydF4y2Bahttp://starbase.sysu.edu.cn/gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．计算Pearson相关系数来衡量mirna和mrna之间的相关性。选择实验验证的相关系数< - 0.3且p值< 0.05的miRNA靶标作为bc特异性miRNA靶标。使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8 (version 6.8;gydF4y2Bahttps://david.ncifcrf.gov/gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在当前研究中分析的数据集可在TCGA (gydF4y2Bahttps://portal.gdc.cancer.gov/gydF4y2Ba)和GEO数据库(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE22220gydF4y2Ba，gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE73002gydF4y2Ba，gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE41922gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

公元前:gydF4y2Ba

乳腺癌gydF4y2Ba

置信区间:gydF4y2Ba

置信区间gydF4y2Ba

CSPM:gydF4y2Ba

累积体细胞点突变gydF4y2Ba

ENCORI:gydF4y2Ba

RNA相互作用体百科全书gydF4y2Ba

呃:gydF4y2Ba

雌激素受体gydF4y2Ba

电动汽车:gydF4y2Ba

细胞外囊泡gydF4y2Ba

地理:gydF4y2Ba

基因表达综合gydF4y2Ba

GI:gydF4y2Ba

基因组不稳定性gydF4y2Ba

走:gydF4y2Ba

基因本体论gydF4y2Ba

顾:gydF4y2Ba

基因不稳定gydF4y2Ba

g:gydF4y2Ba

基因稳定gydF4y2Ba

microrna的:gydF4y2Ba

微gydF4y2Ba

HER2:gydF4y2Ba

人表皮生长因子受体2gydF4y2Ba

公关:gydF4y2Ba

孕激素受体gydF4y2Ba

TCGA:gydF4y2Ba

癌症基因组图谱gydF4y2Ba

KEGG:gydF4y2Ba

京都基因与基因组百科全书gydF4y2Ba

操作系统:gydF4y2Ba

总生存期gydF4y2Ba

机汇:gydF4y2Ba

卵巢癌gydF4y2Ba

转:gydF4y2Ba

每百万阅读数gydF4y2Ba

中华民国:gydF4y2Ba

接收机工作特性gydF4y2Ba

本研究由浙江省自然科学基金资助，资助项目No.;LY21C060004到M.Z.;国家自然科学基金(81822030和82072391)资助西北;国家自然科学基金(81802669)资助J.L，中国科学院医学科学创新基金(2020-I2M-C&T-B-068)资助J.L，中国科学院医学科学创新基金(2016-I2M-1-001);中国科学院医学科学创新基金(CIFMS 2020-I2M-C&T-A-015)资助Y.M.，中国人民大学青年基金和中央高校基本科研业务费基金(No.3332019052)资助Y.M.。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何角色。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 鲍思琪，胡婷和刘佳琪作为第一作者对这项工作做出了同样的贡献gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 温州医科大学生物医学工程学院、眼视光学院、眼科医院，温州，325027gydF4y2Ba

   鲍思奇，苏建中，孙洁，周孟gydF4y2Ba

2. 分子肿瘤学国家重点实验室，国家癌症临床研究中心，中国医学科学院肿瘤医院，北京协和医学院，北京100021gydF4y2Ba

   胡婷，陈红艳gydF4y2Ba

3. 国家癌症中心/国家癌症临床研究中心/中国医学科学院、北京协和医学院肿瘤医院乳腺外科肿瘤科，北京，100021gydF4y2Ba

   刘佳琪，李佳欣gydF4y2Ba

4. 中国医学科学院、北京协和医学院国家肿瘤中心/肿瘤医院PET-CT中心，北京，100021，中华人民共和国gydF4y2Ba

   越明gydF4y2Ba

5. 北京协和医院，北京协和医学院，中国医学科学院骨科，北京市骨骼畸形遗传研究重点实验室，脊柱畸形大数据重点实验室，复杂重症罕见病国家重点实验室，北京，100730gydF4y2Ba

   南吴gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

MZ, HYC和NW构思并设计了该研究。SQB、MZ、JZS、JS和YM参与了数据收集、统计分析和数据解释。JQL, SQB和JXL有助于外泌体的收集和解释。TH和HYC对生物实验和解释有贡献。MZ, SQB, HYC和JQL共同撰写了这份手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba南吴gydF4y2Ba，gydF4y2Ba支陈gydF4y2Ba或gydF4y2Ba孟周gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

这项研究得到了CHCAMS伦理委员会的批准，所有参与者都提供了书面知情同意。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba