用于治疗淋巴瘤的纳米药物传递系统中同源癌细胞膜伪装的构建gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin 's lymphoma, NHL)在细胞遗传学、免疫表型和临床特征上均存在很大的异质性，化疗是目前主要的治疗方式。虽然使用单克隆抗体靶向药物整体疗效显著提高，但仍有患者出现耐药或复发。中医长期以来一直被用于治疗恶性肿瘤。因此，我们构建了基于癌细胞膜修饰的中孔二氧化硅纳米颗粒负载中药的低pH值敏感性给药体系，可以降低全身毒性，提高肿瘤细胞靶向给药的治疗效果。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

据此，本研究提出了以介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)为载体，以中药异欧前胡素(ISOIM)为载体，通过癌细胞膜(CCM)伪装，构建了一种名为CCM@MSNs-ISOIM的纳米平台。该纳米平台具有免疫逃逸、抗吞噬、载药率高、pH敏感性低、生物相容性好等特点，并能积极靶向肿瘤部位，阻断淋巴瘤细胞周期，促进线粒体介导的凋亡。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

此外，本研究为寻找新的淋巴瘤临床治疗方法提供了理论依据。gydF4y2Ba

非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin 's lymphoma, NHL)是一种全球常见的恶性血液系统疾病。目前NHL的发病率在不同年龄阶段均有明显的上升趋势[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在R-CHOP方案下，某些NHL患者在短时间化疗后可实现完全缓解[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．不幸的是，约50%的此类患者会复发，复发后3年的总生存率约为30% [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．复发性癌症/NHL患者由于使用大剂量化疗药物，副作用严重，复发性淋巴瘤对初始化疗方案的后续治疗不敏感，对多种抗癌药物存在交叉耐药[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．因此，寻找治疗NHL高效低毒的新型抗癌药物是一个重要的研究课题。gydF4y2Ba

近年来，天然中草药已被证明是筛选抗癌药物的宝贵来源[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．异欧前胡素(ISOIM)属于呋喃香豆素类，主要分布在伞形科和芸香科，包括白芷、白芍、蛇床子、白芍[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．研究表明，ISOIM具有抗肿瘤的特性。在这方面，Kim YK等发现ISOIM对人肺癌细胞系A549和人卵巢癌细胞系SK-OV-3具有不同的抑制作用，并呈剂量依赖性[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．此外，有研究表明，ISOIM可抑制人胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．然而，大多数抗癌药物是低分子量化合物，很容易通过肾小球滤过或肝脏代谢排出体外[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

大量研究表明，载有中药活性成分的纳米载体可防止光、pH和酶对中药的损伤，从而保持中药的稳定性，提高药物的溶解度和生物利用度[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．Ivanisevic等人证明介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)因其良好的生物相容性、大的比表面积和可调节的孔径而受到越来越多的关注[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．Juère等[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]将白藜芦醇封装在二氧化硅纳米颗粒中，发现封装后的白藜芦醇大大改善了其物理化学性质和生物活性。在三阴性乳腺癌中，单质纳米颗粒可能通过装载化疗药物和siRNA传递到肿瘤细胞中杀死癌细胞。虽然使用未经修饰的二氧化硅纳米颗粒作为药物递送载体可以提高抗肿瘤药物的生物稳定性和恶性肿瘤细胞的通透性，但肿瘤靶向性仍然不足，限制了二氧化硅纳米颗粒在肿瘤中的应用[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

仿生技术受到自然界中生物近乎完美的结构和功能的启发，已被广泛研究[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．红细胞膜[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，白细胞膜[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]和血小板膜[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]都被用于构建纳米药物输送系统。同时，CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-依赖蛋白通常在癌细胞膜(CCM)上高度表达，它介导肿瘤细胞的粘附和靶向[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．具体而言，这些特性在体内刺激肿瘤细胞相互识别和粘附，抵抗呼吸暂停和凋亡[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．因此，CCM作为一种仿生纳米系统，具有很强的肿瘤靶向潜力。gydF4y2Ba

在本研究中，我们设计并构建了装载msns的ISOIM作为纳米颗粒的核心(MSNs-ISOIM)，将其包裹在淋巴瘤细胞的膜内，以构建一种新型的纳米靶向给药系统(CCM@MSNs-ISOIM)并分析其抗肿瘤效果(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们认为，CCM@MSNs-ISOIM为无机纳米材料的功能化引入了新的方向，将加速纳米药物的临床转化。gydF4y2Ba

材料gydF4y2Ba

介孔二氧化硅分散体购自nanocomplexx公司(美国)，异欧前胡素购自DESITE公司(中国)。胎牛血清和RPMI1640细胞培养基由美国Gibco公司提取。细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)购自日本Dojindo实验室，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂由美国BD公司生产。细胞周期检测试剂盒、活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒、DAPI均购自百时生物科技(中国)。罗丹明123 (Rh123)由Yeasen生物技术(中国)提供。Cy5和膜(2 kD)购自Solarbio(中国)。细胞裂解液、蛋白酶抑制剂和TUNEL反应液均来自Boster(中国)。Anti-Ki-67、anti-P53、anti-Caspase-9、anti-Caspase-3抗体均购自中国Servicebio公司，anti-Pan-Cadherin、anti-E-Cadherin抗体购自美国CST公司。H&E染色试剂盒购自keygen BioTECH(中国)，人淋巴瘤细胞株OCI-LY10购自中国科学院上海细胞研究所。gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

OCI-LY10细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI160培养基中，置于37℃、5% CO培养箱中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，每隔2-3天进行一次。选择对数生长期的细胞进行实验。gydF4y2Ba

MSNs@ISOIM的合成gydF4y2Ba

将MSNs (10 mg)和ISOIM (8.9 mg)加入5 mL无水酒精中，室温搅拌6 h，然后通过2 kD透析膜去除游离ISOIM。透析后的样品用于检测ISOIM的浓度[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．包封效率(EE%) =(总ISOIM-上清液中总ISOIM)/总ISOIM × 100%。加载效率(LE%) =(总ISOIM-上清液总ISOIM)/[(总ISOIM-上清液总ISOIM) +总二氧化氮]× 100%。gydF4y2Ba

癌细胞膜的提取gydF4y2Ba

将OCI-LY10肿瘤细胞分散于5 mL含蛋白酶抑制剂的10%蔗糖低渗溶液中，置于冰上1 h。然后用高速分散机(12000 rpm × 5 min)搅拌均匀。匀浆以3000 rpm × 5 min离心后，弃去上清液，重复5次，取剩余沉淀。收集所有细胞裂解物，用蔗糖溶液(50% wt, 40% wt和30% wt)离心，进行超离心(12000 rpm × 5 min)。收集30-40%的界面组分，12000 rpm离心10 min后收集沉淀物。然后用ddH洗涤沉淀物gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO 3次获得提取的癌细胞膜(CCM) [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

构建CCM@MSNs-ISOIMgydF4y2Ba

CCM与相同体积的MSNs@ISOIM混合，使用超声波(3 min 42 kHz, 100W)融合，使用孔径为200 nm的过滤器过滤30次。收集混合物后，以(2000 rpm × 5 min)离心，去除多余的CCM，得到最终的CCM@MSNs-ISOIM。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM的描述gydF4y2Ba

液体转移枪将10µL CCM@MSNs-ISOIM滴在覆盖有支撑膜的铜网上，吸收纸将多余的水吸收。自然干燥后，在透射电镜下观察纳米颗粒的形貌(Tecnai G2 Spirit TEM, FEI, USA)。纳米颗粒的粒径和表面电荷由Zetasizer Nano ZS (Malvern Nano系列，Malvern, UK)测定。实验在室温下以1.5 mL的1 mg/mL样品进行，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测CCM蛋白和CCM@MSNs蛋白，以确定msn是否成功包封在CCM中。紫外/可见光谱(ScanDrop, Analytik Jena, Germany)分别检测CCM, MSNs, ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM的吸光度。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM ISOIM的发布属性gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM在pH 7.4和pH 5.0下进行释药试验，根据低pH敏感性判断ISOIM是否能释放。采用透析法分析MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM的ISOIM释放情况。透析袋(分子量截断，MWCO 8000 - 14000 Da)分别装入2 mL MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM，浸泡在20 mL含有0.2% (w/v) Tween 80的PBS中，37℃以100 rpm的速度搅拌[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在固定的时间，提取释放介质样品(100 μ L)，并添加相同体积的新鲜介质，以保持最终体积不变。收集透析液，在230.5 nm波长处测定ISOIM的吸光度。建立了计算ISOIM累计释放量的标准曲线。gydF4y2Ba

CCM@ MSNs-ISOIM的生物相容性gydF4y2Ba

将5种不同浓度的二氧化硅二氧化硅与5种不同浓度的CCM@MSNs-ISOIM一起添加到悬浮红细胞中，所有这些都作为实验组。以超纯水为阳性对照，PBS为阴性对照。试验组、阳性对照组和阴性对照组在37℃下孵育2 h, 1000rpm离心5 min，收集上清液。然后将上清液加入96孔板。使用多功能酶标仪(PerkinElmer EnSpire, USA)测定上清液在540 nm处的吸光度(OD)。OCI-LY10细胞接种于24孔板(1 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba(10、20、40、80、100µg/mL，上述两组的msn浓度相同)。孵育24 h后，向每个孔中加入10µL Cell Counting Kit-8 (CCK-8)溶液，孵育4 h，测定溶液吸光度为450 nm。溶血率(%)= (ODs-ODn)/(ODp-ODn) × 100%， (ODs、ODn和ODp分别为实验组、阴性对照组和阳性对照组上清液的吸光度值)。实验重复了三次。为了检测CCM@MSNs的免疫逃逸能力，RAW264.7细胞接种于6孔板(2 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/well)， CCM@MSNs孵育6小时。RAW264.7巨噬细胞的细胞核用Hoechst 33,342染色。在激光共聚焦荧光显微镜(LCFM, TCS SP8 CARS, Leica Germany)下观察巨噬细胞CCM@MSNs的吞噬作用和荧光信号。gydF4y2Ba

体外评价CCM@MSNs靶向gydF4y2Ba

OCI-LY10细胞(1 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/孔)接种于培养皿中，dsp - fitc标记的CCM囊泡与OCI-LY10细胞共培养6 h, OCI-LY10核用OCI-LY10 Hoechst 33342染色。PBS冲洗三次后，在LCFM下观察图像。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM体外对OCI-LY10的细胞毒作用gydF4y2Ba

按照CCK-8的指示测定细胞活力。采用菌落形成试验(CCM@MSNs-ISOIM)测定OCI-LY10的抑制率。取对数期的OCI-LY10细胞接种于6孔板，调整细胞密度为1 × 10gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba细胞/。细胞在细胞培养箱中孵育24小时。孵育后，对细胞进行各种处理，并继续培养12天，每3天更换一次液体。单克隆菌落形成后，用甲醇固定细胞，0.2%结晶紫染色30 min, PBS冲洗5次，拍照。计数单克隆超过50个细胞。gydF4y2Ba

体外流式细胞仪检测细胞周期、ROS、MMP和凋亡gydF4y2Ba

OCI-LY10细胞(5 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/孔)接种到6孔板中，用不同的处理方法处理48 h。48 h后，收集细胞，洗涤后悬浮于PBS中。PI染色后，通过流式细胞仪(FACS CantoTM II, BD, USA)检测DNA含量，并分析细胞周期。采用荧光探针Rh123，流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP)水平变化。采用ROS检测试剂盒检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。为了进一步确定CCM@MSNs-ISOIM的体外抗肿瘤作用，采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒观察其凋亡情况。gydF4y2Ba

裸鼠皮下OCI-LY10细胞淋巴瘤模型的建立gydF4y2Ba

取对数生长期的OCI-LY10细胞，PBS救活。将细胞复苏至1 × 10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba/mL，装入EP管，放在碎冰上。用1 mL注射器吸收约0.2 mL细胞悬液，碘伏消毒后皮下接种。接种疫苗后，定期观察裸鼠的精神、饮食和排便习惯。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM靶向的体内评价gydF4y2Ba

为了评估CCM@MSNs-ISOIM在荷瘤小鼠中的靶向性，我们比较了cy5标记的CCM@MSNs和cy5标记的msn，并通过尾静脉注射到荷瘤小鼠中。使用Xenogen IVIS Lumina XR成像系统(Caliper Life Sciences, USA)检测给药后6、24和48 h的荧光信号。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM抗肿瘤疗效及毒性评价gydF4y2Ba

当肿瘤体积达到约100mm时gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba时，实验分为4组(PBS、ISOIM、MSNs@ISOIM、CCM@MSNs-ISOIM)，每组3只裸鼠。在OCI-LY10荷瘤小鼠模型中考虑了ISOIM的剂量因素，如用10mg /kg的ISOIM治疗荷瘤小鼠动物模型[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．同样，为了比较MSNs@ISOIM、CCM@MSNs-ISOIM和游离ISOIM的抗肿瘤效果，在上述研究中，我们将MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM纳米复合材料中ISOIM的浓度设置为与游离ISOIM相同。尾静脉注射给药，每2 d 1次，共4次。肿瘤长度(L, mm)，宽度(W, mm)和体积(V, mm)gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)用电子游标卡尺测量。用V=(LW)计算肿瘤体积gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba) / 2。每3天监测一次肿瘤体积，绘制肿瘤体积时间曲线。由于体重的变化是药物毒性和副作用的敏感指标，因此还使用电子秤监测裸鼠体重的变化。每3天称量一次裸鼠体重，绘制裸鼠体重变化的时间曲线。治疗结束后，麻醉对裸鼠实施安乐死，剥去肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏，用含4%聚甲醛的组织固定液固定24 h。收集裸鼠肿瘤和器官组织，用苏木精和伊红(H&E)染色观察组织病理学变化。采集裸鼠血液进行血液学和生化分析。采用谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)测定血清肝功能，肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)测定肾功能，肌酸激酶(CK)和肌红蛋白(Myo)测定心功能。同时分析白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)和血小板(PLT)水平，观察体内血液学毒性。gydF4y2Ba

TUNEL, Ki-67, MMP和ROS测定gydF4y2Ba

对石蜡包埋的组织样品进行脱蜡，回收抗原。采用TDT原位凋亡试剂盒检测凋亡细胞核。Ki-67测试套件是按照制造商的说明操作的。在光镜下观察细胞形态，并采集细胞图像。通过JC-1和DCFH-DA免疫荧光染色分别检测MMP和ROS。核用DAPI重新染色，LCFM取相应图像。gydF4y2Ba

Western Blot分析和免疫荧光染色gydF4y2Ba

OCILY10细胞分别用PBS、ISOIM、MSNs@ISOIM、CCM@MSNs-ISOIM处理48 h后，收集上述细胞并均质，4℃下加入裂解液30 min，离心提取上清液，BCA测定蛋白浓度。Western Blot检测细胞中Pan-Cadherin、E-Cadherin、p53、caspase-3、caspase-9、β-actin蛋白含量。OCI-LY10荷瘤小鼠分别经尾静脉注射PBS、ISOIM、MSNs@ISOIM、CCM@MSNs-ISOIM，每2 d 1次，共4次。21天后，收集肿瘤组织。将包埋的肿瘤组织脱蜡进行抗原修复，按照标准方案使用anti-p53、Caspase-3和caspase-9进行免疫荧光染色。在荧光显微镜下观察并成像肿瘤细胞。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)评估组间差异，随后采用Tukey事后检验(*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05， **gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01， ***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM的制备和表征gydF4y2Ba

首先将ISOIM加载到msn中形成MSNs@ISOIM，然后用超声波将MSNs@ISOIM包覆CCM囊泡，制备CCM@MSNs-ISOIM纳米复合材料(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．透射电子显微镜(TEM)图像显示，二氧化硅二氧化硅颗粒的粒径均匀性和颗粒分散性令人满意(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).此外，TEM还显示，膜包裹着纳米颗粒的外表面，形成“壳核”结构，这表明二氧化硅纳米颗粒成功被癌细胞膜包被(图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab, c). SDS-PAGE结果(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Bad)表明CCM@MSNss纳米复合物中几乎所有的CCM蛋白都被保留了下来，粒度分析仪(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae)表明，msn的粒径为57.6±0.35 nm，而CCM@MSNs的粒径为134.5±0.96 nm，与癌细胞膜的粒径(132.6±1.12 nm)相近。msn的电位为−31.4±0.61 mV, CCM@MSNs的电位为−26.2±0.73 mV，与癌细胞膜电位(-27.8±0.56 mV)相似(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf).紫外/可见光谱(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Bag)描述了CCM@MSNs-ISOIM的吸收峰分别为321 nm、202 nm和230.5 nm，与CCM囊泡、msn和ISOIM的吸收峰一致，进一步证实了CCM@MSNs-ISOIM的成功构建。gydF4y2Ba

药物装载和释放gydF4y2Ba

利用msn作为载药载体，验证了CCM@MSNs-ISOIM纳米配合物负载的ISOIM的包封效率(EE)和载药效率(LE)分别为93.8±4.7%和45.4±2.6%(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).基于介孔二氧化硅材料的ph响应系统通常涉及开/关封盖或门控(按官能团[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，聚电解质[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]和环状化合物[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba])或主客交互作用(静电[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，共价键[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]和协调键合[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba])。由于程序复杂，大规模制备pH响应系统通常成本高昂。为了改善分子的吸附和共轭性，通常需要通过引入额外的官能团对介孔二氧化硅材料的表面进行修饰，这可能会使制药工业的进一步应用面临风险[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．因此，开发一种利用非功能化介孔二氧化硅材料构建ph响应型给药体系的简便方法具有现实意义[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．因此，为了构建高效、经济的给药体系，介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)被认为更适合于通过MSNs与药物分子直接发生主客体相互作用来构建简单的给药体系[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．然后评估CCM@MSNs-ISOIM和MSNs-ISOIM的体外ISOIM释放特性(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab). pH 7.4时，CCM@MSNs-ISOIM和MSNs-ISOIM在60 h内的ISOIM释放率分别为24.1±3.1%和27.0±3.4%;pH 5.0时，CCM@MSNs-ISOIM和MSNs-ISOIM的ISOIM释放率分别为93.3±3.6%和95.2±2.9%。上述结果表明，在pH 5.0时，ISOIM的释放速率比pH 7.4时要快。体外载药和释药实验表明，二氧化硅纳米颗粒是有效的药物载体。肿瘤的酸性环境[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]有利于CCM@MSNs-ISOIM中ISOIM的释放，且msn具有一定的低pH敏感性特征。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM的体外生物相容性研究gydF4y2Ba

吞噬和溶血实验验证了CCM@MSNs-ISOIM纳米复合材料的体外生物相容性。分别用RhB(红色荧光)标记CCM@MSNs和msn，然后分别用CCM@MSNs-RhB和MSNs-RhB处理RAW264.7巨噬细胞6 h。当巨噬细胞被MSNs- rhb处理时，大多数巨噬细胞表现出弥漫性红色荧光，表明巨噬细胞强烈吞噬MSNs(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa, b).相反，CCM@MSNs-RhB观察到微弱的红色荧光，说明CCM囊泡有效抑制巨噬细胞的吞噬作用。因此，观察到CCM囊泡使纳米材料具有免疫逃逸能力，降低了清除率。通过检测细胞活力和红细胞溶血率，评价CCM@MSNs和msn的体外毒性。然后用CCK-8测定OCI-LY10细胞的细胞活力。数字gydF4y2Ba4gydF4y2Bac描述了OCI-LY10细胞在一系列浓度的msn或CCM@MSNs孵卵24 h后的细胞存活率，其中100µg/mL CCM@MSNs处理的OCI-LY10细胞存活率高达90%。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad, CCM@MSNs和msn处理的红细胞未见明显溶血。此外，CCM@MSNs引起的溶血率小于1%，低于msn引起的溶血率。因此，得到的结果进一步表明CCM@MSNs具有良好的生物相容性。gydF4y2Ba

癌细胞膜靶向和抗原功能化的体外验证gydF4y2Ba

为了确定CCM囊泡对淋巴瘤细胞的靶向性，采用DSPE-FITC(绿色荧光)标记CCM囊泡。用Hoechst 33,342染色OCI-LY10细胞核为蓝色。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA, DSPE-FITC-CCM囊泡聚集在OCI-LY10细胞核周围，表明CCM囊泡可能粘附在OCI-LY10细胞上，具有明显的主动靶向能力。为了验证CCM囊泡上存在特异性的膜抗原，采用Western Blot分析癌细胞膜蛋白标记物和细胞内标记物。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB，观察到特异性癌细胞膜标记物pan-cadherin和E-cadherin [gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．而细胞骨架蛋白β-actin作为细胞质蛋白的指标，主要存在于肿瘤细胞裂解液的条带中，其中癌细胞膜提取物含量较少。因此，经低渗裂解和梯度离心后，淋巴瘤细胞的细胞质成分基本被去除，而淋巴瘤细胞膜上的蛋白质仍保留在其表面。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM对OCI-LY10细胞体外存活率的影响gydF4y2Ba

根据图的结果。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC，不同浓度ISOIM处理24、48 h后，OCI-LY10细胞的增殖抑制率均高于未处理的细胞，且抑制率随药物剂量的增加而增加，说明ISOIM对OCI-LY10细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性。48 h以下，细胞增殖抑制率随时间推移逐渐升高，48 h抑制率高于24 h (P < 0.05)。OCI-LY10细胞在24 h和48 h的IC50评分分别为87µg/mL和33µg/mL。因此，后续实验研究选择游离ISOIM浓度为33µg/mL。目前，中药临床剂型主要停留在药膏、汤剂、丸剂、散剂等传统剂型，而部分中药所含抗肿瘤活性成分存在水溶性差、生物利用度低、特异性分布低等缺点。此外，它们大多是口服的，制剂中的活性成分、无效成分甚至有毒成分也被引入体内[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．将药物包裹在纳米给药系统中，中药有效成分可以穿透网状内皮系统，不仅提高了药物的溶解度，而且通过被动靶向和主动靶向增强了药物的肿瘤靶向性能。同时，可以利用肿瘤微环境调节药物释放性能。这样既可以同步释放药物，也可以依次释放药物，从而增强药物对肿瘤的疗效，减轻药物对正常组织的副作用，减少临床治疗引起的毒副作用[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．如前所述，为了解决ISOIM水溶性差、半期短、稳定性差、生物利用度低、毒性等问题，对纳米制剂(MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM)进行改性，与游离ISOIM进行比较，进一步展示纳米技术和仿生纳米改性技术的优势[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．为了验证ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM在同一实验中的效果，将MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM中ISOIM的浓度均设置为33µg/mL。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaD，与PBS组相比，ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM组的细胞存活率分别为68.83±4.72%、55.80±6.44%和35.85±5.36%。在同一实验中，比较了ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM的效果，发现MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM的ISOIM浓度为33µg/mL。MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM组细胞存活率明显低于ISOIM组。简而言之，CCM@MSNs-ISOIM被观察到具有最显著的抗淋巴瘤作用。同样，与PBS组相比，ISOIM组和CCM@MSNs-ISOIM组均抑制了OCI-LY10细胞的集落形成，其中CCM@MSNs-ISOIM组对OCI-LY10克隆形成的抑制作用最为显著(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaE)。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM对细胞周期、凋亡、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)和凋亡蛋白的影响gydF4y2Ba

PBS、ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM处理OCI-LY10细胞24 h后，以DCFH-DA作为荧光探针检测细胞内ROS水平。流式细胞术结果见图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaA显示，ISOIM组、MSNs@ISOIM组和CCM@MSNs-ISOIM组的ROS水平显著高于PBS组，其中CCM@MSNs-ISOIM组的ROS水平最为显著。因此，我们认为CCM@MSNs-ISOIM对OCI-LY10细胞中ROS产生的影响最强。Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术结果显示，与PBS相比，ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM干预48 h后，活细胞数量明显减少，凋亡细胞数量明显增加，分别从5.76±0.46%和10.70±0.48增加到21.48±1.27%(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB).此外，CCM@MSNs-ISOIM被证实可诱导OCI-LY10细胞凋亡。OCI-LY10细胞经ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM处理48 h后，G2/M期细胞比例分别为17.15±0.9%、22.50±1.02%和31.93±2.64%。与PBS组相比，上述结果在G2/M期呈逐渐增加的趋势，而G0/G1期细胞呈相对减少的趋势。因此，我们建议CCM@MSNs-ISOIM在G2/M期诱导OCI-LY10细胞的细胞周期阻滞(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaC).此外，通过JC-1染色流式细胞术评估ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM对OCI-LY10细胞MMP的影响。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD, CCM@MSNs-ISOIM纳米复合物处理后线粒体膜电位降低率为41.3±2.5%，高于ISOIM组(15.6±1.6%)。为此，CCM@MSNs-ISOIM被推断为破坏细胞的线粒体，导致MMP减少。随后，通过Western Blotting分析(WB)观察CCM@MSNs-ISOIM对凋亡相关蛋白水平的影响。与PBS、ISOIM和MSNs@ISOIM相比，CCM@MSNs-ISOIM显著上调了OCI-LY10细胞中p53、caspase-9和caspase-3的表达(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae).根据上述结果，CCM@MSNs-ISOIM在体外作用于OCI-LY10细胞后，认为诱导ROS阻断细胞周期，减少MMP，促进抑癌基因p53和caspase蛋白的释放，导致OCI-LY10细胞凋亡。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM靶向性及其体内抗肿瘤作用的验证gydF4y2Ba

体外实验证实CCM@MSNs能够靶向肿瘤细胞，具有免疫逃逸能力，因此可能在肿瘤部位积聚。为了在体内验证这一假设，我们分别用Cy5标记CCM@MSNs和MSNs，并以Cy5-MSNs作为对照组。然后利用近红外荧光成像评估它们在体内的生物分布。如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2BaA，与Cy5-MSNs相比，尾静脉注射CCM@MSNs-Cy5后肿瘤部位的荧光强度逐渐增强，说明CCM@MSNs在肿瘤内的累积量大于MSNs。此外，静脉注射给药48 h后，CCM@MSNs在肿瘤组织中的保留率明显高于MSNs。此外，CCM@MSNs-Cy5处理的肿瘤组织中观察到鲜红色荧光，比MSNs-Cy5更明显(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaB)，表明CCM@MSNs可以有效地输送药物。上述结果表明，CCM@MSNs纳米复合材料具有较强的肿瘤靶向能力，并具有较高的药物传递和释放效率。gydF4y2Ba

随后，使用CCM@MSNs-ISOIM纳米复合物在OCI-LY10荷瘤裸鼠上进行体内抗肿瘤试验。当分别用PBS、ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM处理肿瘤组织时，与游离ISOIM相比，MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM均能明显抑制肿瘤生长，其中CCM@MSNs-ISOIM的抑制作用最为显著(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2BaC)。同时H&E染色显示，CCM@MSNs-ISOIM组坏死细胞数量多于其他各组(图。gydF4y2Ba7gydF4y2BaD)，进一步说明CCM@MSNs-ISOIM抗淋巴瘤效果优于游离ISOIM。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM在体外可阻断OCI-LY10细胞周期，抑制细胞增殖，故采用Ki-67免疫组化染色检测体内细胞增殖[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2BaE，我们发现CCM@MSNs-ISOIM组Ki-67阳性细胞数量(棕色)明显少于其他组，说明CCM@MSNs-ISOIM对淋巴瘤细胞增殖的抑制作用最为显著。为了在体内验证CCM@MSNs-ISOIM的促凋亡作用，采用TUNEL染色检测细胞凋亡[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2BaF, CCM@MSNs-ISOIM组肿瘤细胞核染色呈阳性(棕色)，明显高于ISOIM组。TUNEL结果与CCM@MSNs-ISOIM诱导淋巴瘤细胞凋亡的体外实验结果一致。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM抗淋巴瘤机制gydF4y2Ba

细胞凋亡是抑制肿瘤细胞生长的主要途径之一，而线粒体是调控这一过程中最重要的细胞器[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．线粒体除了为细胞提供能量外，还产生ROS，一种诱导细胞凋亡的信号分子[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．ROS可直接触发线粒体通透性过渡孔的打开，降低线粒体膜电位，从而激活线粒体caspase依赖性凋亡通路[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．CCM@MSNs-ISOIM在体外具有特异性和强大的抗肿瘤结果，产生ROS阻断细胞周期，同时降低MMP激活凋亡相关蛋白，促进线粒体凋亡通路对抗淋巴瘤。为了验证CCM@MSNs-ISOIM在体内是否也通过线粒体凋亡途径抑制肿瘤，我们检测了ROS、MMP、Caspase-9和Caspase-3的表达水平。如图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa，在PBS、ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM治疗肿瘤21 d后，CCM@MSNs-ISOIM组肿瘤组织切片的红色荧光信号最为明显，说明CCM@MSNs-ISOIM比单独的ISOIM产生了更多的ROS。然后，在ISOIM组的肿瘤组织切片中观察到少量的绿色荧光，而在CCM@MSNs-ISOIM组的肿瘤组织切片中观察到弥漫的绿色荧光，这表明与其他组相比，CCM@MSNs-ISOIM组的MMP下降最为显著(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab).通过免疫荧光法检测凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3的表达，CCM@MSNs-ISOIM组肿瘤组织切片的红色(Caspase-9)和绿色(Caspase-3)荧光水平较强，而其他组Caspase-9和Caspase-3荧光水平明显较弱，说明CCM@MSNs-ISOIM处理的肿瘤组织中这两种基因高表达(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac). P53蛋白作为基因组的守护者，在调节细胞增殖中发挥重要作用[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．DNA损伤和致癌信号等细胞应激可以激活p53肿瘤抑制通路，并协调数百个基因的转录反应[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．该研究进一步发现，p53激活通过启动多种途径诱导DNA修复或凋亡[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．鉴于p53蛋白激活在细胞周期调控中的重要作用，我们讨论了CCM@MSNs-ISOIM对NHL中p53蛋白激活的影响。数字gydF4y2Ba8gydF4y2Bad显示，CCM@MSNs-ISOIM组p53的荧光强度(粉红色)比其他组更显著，说明CCM@MSNs-ISOIM增强了p53蛋白的表达。CCM@MSNs-ISOIM也可能通过诱导G2/M期阻滞诱导DNA损伤，促进p53蛋白活化，进而导致淋巴瘤细胞凋亡。结果提示CCM@MSNs-ISOIM通过G2/M/p53和线粒体凋亡途径诱导淋巴瘤细胞凋亡。gydF4y2Ba

CCM@MSNs-ISOIM的体内生物安全性研究gydF4y2Ba

为验证CCM@MSNs-ISOIM在体内是否具有潜在毒性，通过裸鼠尾静脉注射评价PBS、ISOIM、MSNs@ISOIM和CCM@MSNs-ISOIM的毒性。然后进行组织学分析，并与PBS组进行比较，结果显示CCM@MSNs-ISOIM处理3周后裸鼠的主要器官没有明显的病理损伤(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．此外，上述四组裸鼠体重在3周内均未出现明显异常变化(图。gydF4y2Ba10gydF4y2BaA)，各组WBC、HGB、PLT、ALT、AST、BUN、CRE、CK、Myo均未见异常变化(图。gydF4y2Ba10gydF4y2BaB, C)，表示CCM@MSNs-ISOIM无毒，具有良好的生物相容性。gydF4y2Ba

寻找有效的抗肿瘤药物仍然是抗肿瘤研究的重点。植物通常含有多种抗肿瘤化合物，许多植物提取物已被用于治疗癌症，如长春新碱、紫杉醇和拓扑替康[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．ISOIM是一种从中草药中提取的活性化合物，已被证明对胃癌、肺癌和卵巢癌细胞具有抗肿瘤作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．在其他恶性肿瘤中，NHL发病率高，异质性强。目前常用化疗治疗本病，但由于患者个体差异，临床结果不同，对患者的生活质量有一定影响[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．为了在淋巴瘤的治疗中发现新的疗法，补充和替代医学可能会将其重点转向中医。某些中药已被证明可诱导淋巴瘤细胞凋亡[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．然而，大多数中药有效成分存在水溶性低、稳定性差、体内消除快、药代动力学变异大等问题[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．因此，纳米技术的出现减少了这些问题[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．本文以装载msns的ISOIM为纳米核心(MSNs@ISOIM)，以CCM包裹MSNs@ISOIM，构建新型抗肿瘤纳米中药(CCM@MSNs-ISOIM)。gydF4y2Ba

在本研究中，CCK-8检测表明，ISOIM抑制OCI-LY10细胞的增殖具有剂量和时间依赖性。CCK-8实验中IC50值(33µg/mL)显示，与游离ISOIM相比，相同浓度的ISOIM, CCM@MSNs-ISOIM可显著抑制OCI-LY10的增殖(P < 0.05)。细胞克隆形成实验也证实CCM@MSNs-ISOIM抑制OCI-LY10细胞的增殖。AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术并进行相应的体内实验。TUNEL分析表明，CCM@MSNs-ISOIM处理的淋巴瘤细胞存在明显的凋亡。流式细胞术结果显示，48 h后细胞周期停滞在G2/M期，体内Ki-67分析表明CCM@MSNs-ISOIM可抑制肿瘤增殖。gydF4y2Ba

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，在维持哺乳动物正常发育和细胞稳态中起着重要作用。诱导肿瘤细胞凋亡是一种很有前途的肿瘤治疗方式[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．细胞周期的顺利进行是细胞增殖的重要条件;其干扰或破坏可阻止细胞增殖，促进细胞凋亡[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．大量研究证实，中药中的活性成分如生物碱、黄酮类化合物、皂苷等可阻断肿瘤细胞G2/M期[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．在此阶段，细胞外DNA损伤信号可通过调节p53通路的活性诱导G2/M期阻滞[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．p53蛋白调控p53依赖的凋亡通路，导致细胞色素c的线粒体释放，与Apaf-1、Pro-Caspase-9形成凋亡体，激活Pro-Caspase-9形成活性Caspase-9，并通过一系列级联反应激活效应子Caspase-3，导致肿瘤细胞凋亡[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．本研究采用WB和免疫荧光技术探讨CCM@MSNs-ISOIM诱导淋巴瘤细胞凋亡的机制。发现p53、Caspase-9和Caspase-3的表达明显增加，且比游离ISOIM的表达明显增加，说明CCM@MSNs-ISOIM诱导NHL凋亡的途径可能是通过p53途径诱导肿瘤细胞凋亡。因此，本实验表明CCM@MSNs-ISOIM诱导NHL产生高水平的ROS。类似的研究表明，高水平的ROS破坏细胞成分，如DNA、蛋白质和脂质，导致细胞凋亡[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．Wang等证实，Erianin可引起骨肉瘤细胞产生大量ROS，并诱导G2/M期阻滞[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．最近的研究也表明p53的功能与ROS密切相关[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．ROS不仅调控p53活性，还参与p53依赖性凋亡[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．因此，CCM@MSNs-ISOIM可能诱导NHL产生高水平的ROS，介导G2/M阻滞，从而导致凋亡。gydF4y2Ba

此外，经典凋亡主要包括线粒体和死亡受体通路，其中线粒体通路与细胞内线粒体跨膜电位的变化密切相关[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．CCM@MSNs-ISOIM可降低NHL细胞内线粒体跨膜电位，CCM@MSNs-ISOIM可显著提高NHL ROS水平，进一步提示CCM@MSNs-ISOIM可能通过细胞内线粒体凋亡途径诱导凋亡。ROS可作用于线粒体，导致线粒体膜通透性改变，线粒体膜电位降低，细胞色素C从膜内游离到膜间隙[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．线粒体膜电位下降是线粒体扩张导致外膜破裂的结果，向细胞质释放重要的凋亡因子[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．细胞色素C位于细胞质中，启动caspase的级联激活，而凋亡则由caspase -3启动，导致整个细胞结构的破坏、功能障碍和凋亡[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．同时，高水平的ROS参与破坏细胞成分，如DNA、蛋白质和脂质，导致细胞凋亡。gydF4y2Ba

在本研究中，新型CCM@MSNs-ISOIM将CCM囊泡包裹在MSNs@-ISOIM纳米复合物中，具有积极靶向肿瘤细胞、高载药率、高安全性、低pH值敏感性和免疫逃逸等优点，是一种高效无毒的治疗NHL的治疗方式。本研究表明，纳米复合物通过阻断G2/M激活p53，调节高水平ROS的产生，最终诱导线粒体凋亡中的抗肿瘤通路。简而言之，这项研究表明CCM@MSNs-ISOIM可能提供新的治疗方案，用于治疗NHL患者，这可能具有潜在的有益临床结果和社会效益。gydF4y2Ba

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

国家自然科学基金(No. 8157120841, 82001165)资助;中南大学中央高校基本科研业务费项目(No. 2019zzts366);青海省卫计委指导项目(2018-wjzdx- 17,2020 -wjzdx-38)。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 中南大学湘雅第三医院输血科，长沙，410013gydF4y2Ba

   赵强强，尚英辉，黄学元，董航，刘海廷，桂荣，李健gydF4y2Ba

2. 青海省人民医院血液科，西宁810007gydF4y2Ba

   强强赵gydF4y2Ba

3. 苏州大学医学院护理学院，苏州215006gydF4y2Ba

   肖颖太阳gydF4y2Ba

4. 青海省人民医院急诊科，西宁，810007gydF4y2Ba

   肖颖太阳gydF4y2Ba

5. 同济医学院，华中科技大学武汉中西医医院输血医学系，武汉430022gydF4y2Ba

   吴本gydF4y2Ba

6. 中南大学化学化工学院，长沙，410083gydF4y2Ba

   Wansong陈gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

构思并设计实验:RG和JL。QZ进行了实验。YS、BW、YS、XH、HD和HL对实验结果进行了分析。QZ撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba荣GuigydF4y2Ba或gydF4y2Ba剑李gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

作者获得了中南大学湘雅第三医院委员会的动物实验授权。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，允许以任何媒介或格式使用、分享、改编、分发和复制，只要您对原作者和来源给予适当的署名，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否有更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可协议中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料未包含在文章的创作共用许可协议中，并且您的预期使用不被法定法规所允许或超出了允许的使用范围，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查看本牌照的副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条所提供的资料，除非在资料的信用额度中另有说明。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba