用于治疗疾病的治疗性抗体的发展

自1986年美国食品和药物管理局(US FDA)批准首个单克隆抗体以来，已有30多年的时间，在此期间，抗体工程发生了巨大的发展。目前的抗体药物由于其高特异性，不良反应越来越少。因此，治疗性抗体已成为近年来开发的主要一类新药。在过去的五年里，抗体已经成为医药市场上最畅销的药物，而在2018年，全球十大最畅销的药物中，有八种是生物制剂。2018年，全球治疗性单克隆抗体市场价值约为1152亿美元，预计到2019年底将产生1500亿美元的收入，到2025年将产生3000亿美元的收入。因此，随着新药被批准用于治疗各种人类疾病，包括许多癌症、自身免疫性疾病、代谢性疾病和感染性疾病，治疗性抗体药物的市场经历了爆炸性增长。截至2019年12月，美国FDA已批准79种治疗性单克隆抗体，但仍有显著的增长潜力。本文综述了最新的市场趋势，并概述了用于治疗性抗体药物开发的卓越抗体工程技术，如单克隆抗体的人源化、噬菌体展示、人抗体小鼠、单B细胞抗体技术和亲和成熟。最后，对其应用前景进行了展望。

单克隆抗体(mAbs)由B细胞产生，特异性靶向抗原。杂交瘤技术由Köhler和Milstein在1975年引入[1]使大量获得纯单克隆抗体成为可能，极大地加强了基础研究和临床应用潜力。其他科技进步也使单克隆抗体成功转化为临床。在全球范围内，商业公司已经在临床试验中研究了至少570种治疗性单克隆抗体[2]， 79种治疗性单克隆抗体已获美国食品和药物管理局(US FDA)批准，目前已上市[3.]，包括用于治疗癌症的30个单克隆抗体(表1)．

治疗性单克隆抗体的重要性日益增加是显而易见的(图。1)，因为在过去25年里，单克隆抗体已成为各种疾病的主要治疗方式。在此期间，重大技术进步使得单克隆抗体疗法的发现和开发更快、更有效。根据美国FDA的数据，自2008年以来，已有48种新的单克隆抗体获得批准，截至2017年底，全球临床使用的单克隆抗体总数为61种。引人注目的是，从2018年到2019年，美国FDA共批准了18种新抗体——这一数字是根据包括抗体协会在内的各种网站上的信息计算得出的。3.]，治疗性抗体数据库[4，以及公司渠道和新闻稿。美国FDA批准的基于抗体的药物清单见表1．

首个治疗性单抗muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3)于1986年获得美国FDA批准[5]，包括一种抗T细胞表达的CD3的小鼠单抗，作为一种治疗急性移植排斥反应的免疫抑制剂。muromonab-CD3的上市截止日期为2011年7月30日1)．为了克服免疫原性潜力和疗效下降的问题，同时使抗体的治疗用途能够延长，研究人员开发了将啮齿动物抗体转化为更类似于人类抗体的结构的技术，而不损失结合特性。第一个嵌合抗体，抗gpiib /IIIa抗原结合片段(Fab) (abciximab)，于1994年被美国FDA批准用于抑制心血管疾病的血小板聚集(图2)。1)．该药物是通过将小鼠可变区域序列与人类恒定区域序列相结合而开发的。2 b) [6，7］．然后是首个具有肿瘤适应症的单抗，美帝单抗，一种嵌合抗cd20 IgG1，于1997年被美国FDA批准用于非霍奇金淋巴瘤(图。1) [8，9］．

加速批准治疗性单克隆抗体的一个特殊进展是通过互补决定区(CDR)嫁接技术产生人源化抗体[10］．在CDR移植中，非人抗体CDR序列被移植到人框架序列中以保持目标特异性[10(图。2摄氏度)．1997年，美国FDA批准的首个人源单抗是抗il -2受体daclizumab，用于预防移植排斥反应。1) [11］．抗体的人源化使得临床应用一类新的生物制剂来治疗癌症和自身免疫疾病等需要长期治疗的疾病成为可能[12］．

基于人源化单克隆抗体在临床的成功，获得完全人源单克隆抗体的关键发现技术(图。二维)于1990年由温特爵士[10，13］．该技术基于噬菌体展示，将不同的外源基因整合到丝状噬菌体中组成一个文库。然后，文库蛋白作为与噬菌体外壳蛋白的融合物呈现在噬菌体表面，允许选择特定的结合剂和亲和特性。噬菌体展示技术最初是由George P. Smith [14]并包括一种强大的方法，用于快速识别结合多种目标分子(蛋白质、细胞表面聚糖和受体)的肽或抗体片段，如单链片段变量(scFv)或Fab [15(图。3 b)．2018年诺贝尔化学奖授予乔治·p·史密斯和格雷戈里·p·温特爵士。George Smith开发出噬菌体显示肽，可用于进化新的蛋白质[14］．Gregory P. Winter能够将噬菌体显示抗体库应用于发现和分离抗体[13］．噬菌体展示技术也已用于抗体成熟的定点诱变CDR和亲和选择。基于这些技术，第一个完全人类治疗抗体，抗肿瘤坏死因子α (TNFα)人抗体阿达木单抗(Humira) [16，于2002年被美国FDA批准用于类风湿性关节炎(图。1)．到目前为止，9种由噬菌体展示产生的人抗体药物已被美国FDA批准(表2)5)．

转基因动物代表了获得完全人类单克隆抗体的另一种技术(图。3 c)．这项技术于1994年由HuMabMouse两种转基因小鼠品系的发表而引入。[35]和XenoMouse [36］．这些系经过基因改造，将人类免疫球蛋白(Ig)基因插入基因组，取代内源性Ig基因，使这些动物能够在免疫后完全合成人类抗体[35，37］．首个抗表皮生长因子受体(EGFR)转基因小鼠抗体panitumumab于2006年获得美国FDA批准。1) [38，39］．由转基因小鼠制成的完全人类抗体的数量迅速增加，目前批准的药物数量为19种(表2)5)．根据免疫方案，通过进一步选择免疫转基因小鼠产生的杂交瘤克隆，可获得高亲和力的人抗体。使用理论上类似的方法，从人B细胞中产生中和人抗体也为传染病治疗带来了有希望的结果。

最近双特异性抗体的发展为设计新的蛋白质疗法提供了有吸引力的新机会。双特异性抗体可以通过利用蛋白质工程技术连接两个抗原结合域(如fab或scFvs)来产生，从而允许单个抗体同时结合不同的抗原。因此，双特异性抗体可以被设计成具有两种亲本抗体混合物所不存在的新功能。大多数双特异性抗体设计用于招募免疫系统的细胞毒性效应细胞，以靶向致病细胞[40］．2009年，欧洲首个获批的双特异性抗体是catumaxomab [41］．Catumaxomab靶向CD3和EpCAM治疗恶性腹水患者的实体瘤。然而，由于商业原因，该药物于2017年退出市场。目前，两种双特异性抗体已获得美国FDA批准并上市。首先，blinatumomab是一种双特异性t细胞接触剂(BiTE)，靶向CD3和CD19，用于治疗b细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL) [42］．其次，emicizumab是一种天然结构的全尺寸双特异性IgG，可与活化凝血因子IX和X结合，用于治疗血友病a [43］．迄今为止，有超过85种双特异性抗体在临床试验中，其中约86%正在作为癌症疗法进行评估[40］．推动双特异性抗体发展的概念和平台继续快速发展，为取得重大治疗突破创造了许多新的机会。

虽然单克隆抗体通常用于生物化学、分子和细胞生物学以及医学研究，但最有益的应用可能是它们作为治疗药物用于治疗人类疾病，如癌症、哮喘、关节炎、牛皮癣、克罗恩病、移植排斥反应、偏头痛和传染病(表2)1)．抗体工程在过去十年中取得的重要进展增强了治疗性抗体的安全性和有效性。这些进展，以及对抗体免疫调节特性的更深入了解，为下一代新的和改进的基于抗体的治疗人类疾病的药物铺平了道路。

治疗性抗体目前已被批准用于疾病治疗

单克隆抗体市场拥有一个健康的管道，预计将以越来越快的速度增长，目前2018年的估值为1152亿美元[44］．尽管有很高的增长潜力，但新公司不太可能占据很大的市场份额，目前该市场由七家公司主导:基因泰克(30.8%)、艾伯维(20.0%)、强生(13.6%)、百时美施贵宝(6.5%)、默克夏普和多梅(5.6%)、诺华(5.5%)、安进(4.9%)，其他公司占其余13% [44］．

2018年，许多单克隆抗体产品的年销售额超过30亿美元(图2)。1)，而6个(阿达木单抗、尼伏单抗、派姆单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗)的销售额超过60亿美元(表2)2)．阿达木单抗(Humira)是有史以来生物制药产品中销售额最高的，近199亿美元。2018年销量排名前十的单抗产品见表2．最畅销的单抗药物是根据生物或药理公司在2018年的新闻公告、电话会议、年度报告或投资者材料中报告的销售额或收入排名的。对于每种药物，都显示了名称、赞助商、疾病适应症和2018年的销售额。

单克隆抗体越来越多地用于广泛的靶标;肿瘤学、免疫学和血液学仍然是最普遍的医学应用[45］．大多数单克隆抗体具有多种疾病适应症，且至少有一种与癌症相关(淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、肉瘤、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌)。因此，肿瘤疾病是最容易获得单抗治疗的医学专业[45］．此外，已知作为免疫系统刺激或抑制检查点的目标蛋白的数量已显著增加，许多靶向程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1, cemiplimab, nivolumab, pembrolizumab)，其配体程序性死亡配体1 (PD-L1, durvalumab, avelumab, atezolizumab)或细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4 (CTLA-4, ipilimumab)的抗体疗法已获批上市[46］．

阿达木单抗(Humira)是2018年全球最畅销的药物。阿达木单抗是一种皮下给药的生物疾病调节剂，用于治疗类风湿性关节炎和其他tnf α介导的慢性衰弱性疾病。它最初是由艾伯维在2002年获得美国FDA批准后在美国推出的。有研究表明，阿达木单抗可降低成人中重度类风湿性关节炎的体征和症状，也可用于治疗银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎和青少年特发性关节炎[47，48］．可单独使用，也可与治疗疾病的抗风湿药物合用[49］．

免疫检查点对于维持自身耐受性和调节外周组织的生理免疫反应是重要的。因此，作为检查点的分子最近在癌症免疫治疗中引起了相当大的兴趣[50］．nivolumab (Opdivo)和pembrolizumab (Keytruda)都是抗pd -1单克隆抗体，是2018年第二和第三畅销的单克隆抗体药物2)．Nivolumab是一种人类抗体，它可以阻断一种信号，这种信号通常可以阻止激活的T细胞攻击癌细胞。nivolumab的靶点是PD-1受体，抗体阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的相互作用，释放PD-1途径介导的免疫抑制[51，52］．Pembrolizumab是一种人源化抗体，用于癌症免疫治疗，治疗黑色素瘤、肺癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤和胃癌[53，54，55］．如果癌细胞过表达PD-L1且EGFR或间变淋巴瘤激酶没有突变，则派姆单抗是NSCLC的一线治疗方法[56，57］．大型随机临床试验表明，接受nivolumab和pembrolizumab(均于2014年获得美国FDA批准)治疗的NSCLC患者与标准二线治疗多西他赛相比，总生存率提高[58］．

2018年，美国共批准了12种新的单克隆抗体。这些产品中的大多数被批准用于非癌症适应症，这可能反映了抗体作为其他疾病治疗的更高批准成功率。三种抗体(erenumab, galcanezumab和fremaezumab)被批准用于预防偏头痛，一种抗体(Ibalizumab)用于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。三种偏头痛预防药物，Erenumab (Aimovig)， galcanezumab (Emgality)和fremaezumab (Ajovy)，都是在偏头痛病因学中阻断降钙素基因相关肽(CGRP)受体活性的单克隆抗体[59］．CGRP通过异聚体受体起作用，该受体由G蛋白偶联受体(降钙素受体样受体:CALCRL)和受体活性修饰蛋白1 (RAMP1)组成[60，61］．galcanezumab和fremaezumab都与CGRP结合并阻断其与受体的结合。然而，erenumab是三种抗体中唯一一种靶向人类G蛋白偶联受体CALCRL和RAMP1的胞外结构域，干扰CGRP结合口袋[62］．

许多单克隆抗体正在开发中，用于治疗感染性疾病，目前只有四种单克隆抗体获得美国FDA批准:用于治疗吸入性炭疽的瑞希巴库和obiltoxaximab [63]，帕利珠单抗用于预防高危婴儿呼吸道合胞病毒[64]，以及ibalizumab治疗HIV感染患者[65］．Ibalizumab (Trogarzo)是一种人源IgG4单抗，被用作CD4结构域2定向的附着后HIV-1抑制剂。美国FDA批准ibalizumab用于先前接受过治疗且对现有治疗方法有耐药性的HIV感染成年患者。

治疗性抗体目前正在临床试验中

公司目前正在赞助570多种单克隆抗体的临床研究。其中约90%是早期研究，旨在评估患者人群的安全性(I期)或安全性和初步疗效(I/II期或II期)。大多数I期单克隆抗体(~ 70%)用于癌症治疗，用于治疗癌症的单克隆抗体的比例与目前处于II期和晚期临床研究(关键II期、II/III期或III期)的比例相似[2］．

2018年，29种新型抗体疗法在非癌症适应症的晚期临床研究中。在这些单克隆抗体的试验中，没有单一的治疗领域占主导地位，但40%用于免疫介导性疾病，这是最大的一组。在这组潜在的治疗药物中，leronliumab和brolucizumab将于2018年底进入监管审查，五种单克隆抗体(eptinezumab, teprotumumab, crizanlizumab, satralizumab和tanezumab)可能在2019年进入监管审查。相比之下，2018年有33种新型抗体疗法用于癌症适应症的晚期临床研究。实体瘤的抗体治疗明显占主导地位，只有不到20%的候选药物仅用于血液系统恶性肿瘤。2019年向美国FDA提交了五份单克隆抗体(isatuximab、spartalizumab、tafasitamab、dostarliumab和ublituximab)许可证申请[2］．

Isatuximab是一种抗cd38 IgG1嵌合单抗，正在评估用于多发性骨髓瘤(MM)患者的治疗。三项针对MM患者的III期研究(ICARIA, ikea和IMROZ)正在测试isatuximab和不同化疗的组合。ICARIA研究(NCT02990338)正在评估isatuximab联合pomalidomide和地塞米松在难治性或复发性MM患者中的疗效，与仅化疗相比。关键的III期ICARIA-MM试验结果表明，在2019年的复发性或难治性MM患者中，与pomalidomide和地塞米松单独治疗相比，isatuximab联合治疗在统计学上有显著改善。美国FDA已接受isatuximab的生物制剂许可申请，用于治疗复发或难治性MM患者。FDA决定的目标行动日期为2020年4月[66］．IKEMA (NCT03275285)和IMROZ (NCT03319667)的研究正在评估异妥昔单抗与其他化疗组合在MM患者中的疗效[67］．

Spartalizumab是一种人源化IgG4单抗，能以亚纳摩尔亲和力结合PD-1，并阻断其与PD-L1/PD-L2的相互作用，阻止PD-1介导的抑制信号传导并导致t细胞激活。一项随机、双盲、安慰剂对照的III期COMBI-i研究(NCT02967692)正在进行Spartalizumab的临床研究，该研究评估了dabrafenib和trametinib联合Spartalizumab在先前未经治疗的BRAF v600突变不可切除或转移性黑色素瘤患者中的安全性和有效性，与对照安慰剂相比。该研究的主要终点是评估剂量限制毒性、肿瘤微环境中PD-L1水平和CD8+细胞的变化以及无进展生存期。关键的次要终点是总生存期、总缓解率和缓解持续时间。研究预计初步完成日期为2019年9月[68］．

dostarlimmab是一种抗pd -1单抗，可能用于治疗几种类型的癌症。葛兰素史克宣布了一期剂量增加和队列扩展研究(GARNET;NCT02715284)，预计将支持2019年向美国FDA提交的生物制剂许可证申请。在GARNET研究中，dostarlimumab正在对治疗选择有限的晚期实体瘤患者进行评估。该药物在前4个周期中每3周给药500 mg，之后每6周给药1000 mg，用于4个患者队列:微卫星不稳定高(MSI-H)子宫内膜癌、MSI-H非子宫内膜癌、微卫星稳定子宫内膜癌和非小细胞肺癌。dostarlimumab也在另一项III期研究(NCT03602859)中进行评估，该研究比较了铂基治疗与dostarlimumab和niraparib作为III期或IV期非粘液性上皮卵巢癌的一线治疗与标准护理铂基治疗[69］．

Ublituximab是一种糖工程抗cd20抗体，目前正在5项针对不同癌症(慢性淋巴细胞白血病、CLL、非霍奇金淋巴瘤)和非癌症(多发性硬化症)适应症的晚期临床研究中进行临床研究。三项III期研究正在探索ublituximab联合其他抗癌药物的疗效。在这些研究中，unit -CLL III期研究(NCT02612311)正在评估ublituximab和TGR-1202(一种PI3K delta抑制剂)的联合，与抗cd20 obinutuzumab加氯霉素在未治疗和先前治疗的CLL患者中的疗效进行比较。另外两项III期研究(ULTIMATE 1, NCT03277261和ULTIMATE 2, NCT03277248)正在评估ublituximab与teriflunomide在440例复发性多发性硬化症患者中的疗效和安全性[70］．

人源抗体、人源抗体、嵌合抗体和鼠源抗体分别占临床使用的所有单克隆抗体的51%、34.7%、12.5和2.8%，使人源抗体和人源抗体成为治疗性抗体领域的主导形式。在下一节中，我们首先介绍抗体人格化技术。然后，我们描述了与生成完全人抗体相关的三个技术平台，包括噬菌体展示、转基因小鼠和单B细胞抗体分离(图2)。3.)．最后，我们描述了使用亲和成熟方法来优化抗体结合活性。

单克隆抗体的人性化

由于小鼠单克隆抗体的可用性、低成本和生产时间快，小鼠单克隆抗体的人源化已经大规模实施。非人源化小鼠单克隆抗体作为治疗药物有许多缺点。例如，用小鼠单克隆抗体治疗的患者将产生快速的人抗小鼠抗体(HAMA)反应。哈马斯不仅会加速小鼠单克隆抗体的清除，而且还可能产生不良的过敏反应和肿瘤渗透。此外，患者在小鼠片段可结晶区(Fc)反应中启动抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力有限。另一方面，人源化单克隆抗体能够有效发挥效应功能，同时降低小鼠抗体的免疫原性。

生成人源单克隆抗体

1988年，人源单克隆抗体首次进入临床开发，其中只有轻链和重链的cdr为小鼠[71，72］．CDR移植是生产人源化单克隆抗体最流行的技术之一，最初由Gregory P. Winter于1986年开发[9］．利用该技术，将非人CDR序列移植到人框架序列中，使抗体保持与靶抗原的结合活性[9］．美国FDA批准的首个cdr移植的人源单抗出现在1997年，用于daclizumab，它与IL-2受体结合，用于预防移植排斥[11］．女王和合作者[73]开发的daclizumab不仅使用CDR移植，而且还使用了与小鼠框架最大程度同源的人框架，以减少抗原识别的损失。在某些情况下，小鼠框架中的某些氨基酸对维持抗体结合活性至关重要。这些残基可以与cdr合作形成抗体对位，也可以直接与抗原相互作用。目前，这些关键的框架残基可以通过x射线晶体学、冷冻电子显微镜和计算机辅助蛋白质同源建模来观察抗体-抗原复合物的结构来识别[74］．然后，可以考虑通过cdr移植人源化抗体的“人返小鼠”突变来恢复框架中氨基酸的位置，从而提高最终产物的亲和力和稳定性。目前，综合生物信息学和抗体结构数据库正在开发用于渲染人性化实验的web服务器[75，76］．它们为人类模板选择、嫁接、反向突变评估和抗体建模提供了工具。但是，如果抗体的结合活性仍然降低，则应进一步进行亲和成熟以改善这种情况。

已经开发了多种方法来量化单克隆抗体可变区域的人性性。Abhinandan和Martin设计了一种名为“H-score”的工具来评估抗体序列的“人性化程度”，该工具与人类可变区域序列数据库的一个子集相比计算了平均序列身份[77］．随后定义了生发性指数，以协助猕猴抗体的种系人格化[78］．g评分来源于h评分，以提高种系框架序列的分类[79］．T20评分分析仪建立在约38,700个人抗体可变区序列的大型数据库下，以清楚地将人的序列与小鼠序列以及许多其他物种的序列分开[80］．它被用来揭示人源抗体和全人源抗体之间的相似性。这些人源性评分工具可在线获取，可协助人源化抗体的生成[80］．

人源化抗体的应用极大地提高了单抗治疗的临床耐受性。这种对抗体序列的复杂控制为工程单克隆抗体在医学上的广泛应用打开了大门。目前，用于治疗人类的所有单克隆抗体中有一半是嵌合或人性化的(图2)。2、表1)．最著名的人人化抗体之一是曲妥珠单抗(赫赛汀)，于1998年获得批准，2018年的年销售额超过70亿美元(表2)2)．曲妥珠单抗用于人表皮生长因子受体2 (HER2)阳性转移性乳腺癌和胃食管交界腺癌患者的治疗[57，58］．

抗体疗法的免疫原性

在临床环境中使用单克隆抗体应具有几个基本的生物物理特性，包括高抗原结合活性、高稳定性和低免疫原性[81］．抗体免疫原性是指宿主免疫系统对这些治疗药物的识别和反应程度。使用抗体药物的患者在免疫原性发生的同时，也可发现免疫系统诱导的抗药物抗体(ADA)。抗药物抗体具有中和治疗药物的潜力，从而降低药物的疗效[82］．重要的是，抗药物抗体可能会进一步引起患者从皮疹到全身炎症反应等不良反应，从而影响抗体药物在临床使用中的安全性和有效性[83］．免疫原性受多种因素影响，如药物剂量、给药策略(途径和组合)、杂质污染、Ab/Ag结合复合物产生的聚集物以及结构特征(序列变异和糖基化)[84］．

人源化抗体在恒定区域包含人类序列，在Fv中包含几乎所有人类序列，其中只有cdr是小鼠移植的。更像人的抗体通常允许它们在临床环境中具有更高的耐受性和较低的免疫原性。例如，Perpetua等人展示了一个支持这一概念的案例[85］．他们将人源化的抗cd52抗体与其亲本小鼠版本进行了比较，并证明人源化可显著降低免疫原性。但人源化抗体保留小鼠cdr，可被宿主免疫系统视为外来抗原，最终产生免疫原性。例如，在0.5%的转移性乳腺癌患者中检测到ADA，这些患者在治疗过程中接受了曲妥珠单抗治疗[86］．最近，临床资料的免疫原性分析结果显示，HER-2阳性乳腺癌患者在曲妥珠单抗治疗中ADA率为7.1% (21/296)[87］．同一种抗体药物的免疫原性变化可能由多种潜在因素引起:年龄、种族、遗传背景、其他相关疾病、给药方案等。

完全人抗体的cdr和框架是根据人免疫球蛋白基因库衍生的，因此理论上可以绕过免疫原性。然而，据报道，几种完全人抗体在给药患者时可诱导明显的免疫反应[88］．据报道，阿达木单抗(Humira)是一种人IgG1，通过在部分患者(5-89%)中诱导抗独特型抗体产生显著的免疫反应，这取决于疾病和治疗方法[89，90］．Golimumab (Simponi)是一种完全人抗tnf α抗体，与甲氨蝶呤联合治疗类风湿关节炎，导致16%的患者产生抗药物抗体[91］．出现这些情况的原因之一是人抗体的Fv序列与人种系不完全相同:抗体通过VJ和VDJ随机重组进化，以及通过体细胞超突变在体内自然发生的亲和成熟。到目前为止，还没有一种体外或硅内分析方法可以精确地分析抗体的免疫原性。体内评估通常用于评估免疫原性，其结果将改善抗体治疗的设计和工程，以减少诱导抗药物抗体的可能性。

通过噬菌体展示产生人抗体

抗体噬菌体文库概述

噬菌体展示是第一个，仍然是最广泛使用的体外抗体选择技术。该战略是基于乔治·p·史密斯1985年的出色工作[14]，他利用重组DNA技术将外来多肽与噬菌体M13的包膜蛋白(pIII)融合，以便在噬菌体表面显示多肽。然后，他创造了“抗体可选择噬菌体载体”，并描述了一种体外方法，能够从10种抗原特异性噬菌体显示抗体中亲和选择⁸-fold多余噬菌体池[92］．后来发现单链抗体(scFv)这种小型抗体形式可以在噬菌体丝上表达。当时，有三个不同的研究机构独立建立噬菌体显示单链抗体或Fab抗体文库:英国的MRC分子生物学实验室[13，93，94]、位于德国的德国癌症研究中心[95]，以及美国斯克里普斯研究所[96］．从那时起，这些噬菌体显示的抗体库已被证明是一个可靠的发现平台，用于鉴定有效的，完全人单抗[97］．

从噬菌体显示的文库中识别单克隆抗体的过程始于抗体文库的构建(图2)。4)．变量heavy (V_H)和可变光(V_l)聚合酶链反应(PCR)产物，代表Ig基因编码库，连接到噬菌体显示载体(噬菌体)。高质量的mRNA来自人外周血单个核细胞(pmcs)被反转录成cDNA。不同的V_H和V_l然后使用特定引物扩增链区基因家族，以扩增Ig库中所有转录的可变区域[98，99］．噬菌体显示文库中抗体的格式可以是单链抗体或Fab片段(图2)。4 b）;scFvs由V_H和V_l由短而灵活的连接器连接的域。噬菌体外壳蛋白上显示的抗体Fab片段具有相对较高的结构稳定性，并且可以很容易地转化为完整的IgG抗体，通常不会损害结合活性[One hundred.，101］．噬菌体展示文库的优雅在于抗体表型(特异性和敏感性)和基因型(遗传信息)通过噬菌体颗粒之间的联系。由于体积小，溶解度高(10¹³颗粒/ml)噬菌体颗粒，保留库大小可达10个¹¹独立的克隆可以有效地生产和显示在一个库中[102，103，104］．

噬菌体显示文库的基因库可以从naïve或免疫动物中获得，或者文库可以在固定框架内使用随机CDR序列合成。噬菌体显示naïve抗体文库由重组的IgM剧目V基因构建。由于基因序列来源于人类供体的B细胞，naïve文库相对接近人类抗体种系，具有较低的免疫原性风险。免疫文库相对于naïve文库的主要优势是免疫文库中的抗体基因在体内经历了自然的亲和成熟，允许针对目标的高亲和抗体的发展。然而，这种方法要求感兴趣的抗原能够成功地诱导免疫原性反应，并且必须为每个新靶标制备新的文库。单个大型naïve [94，104，105]和合成的[102，106，107]文库产生了针对广泛靶标的高亲和力抗体(亚纳摩尔范围)。因此，这种非免疫文库具有明显的优势，可以避免免疫小鼠的免疫耐受问题，并且不需要为每个新靶标添加新的免疫文库。

目前，几乎所有广泛使用的商业文库都是基于高度多样化的非免疫基因库，可以针对几乎无限数量的靶标选择抗体[108］．值得注意的是，大多数已经在临床试验中进行评估的抗体药物都来自于少数公司拥有的文库。这些库包括:Cambridge Antibody Technology(现为MedImmune，阿斯利康的子公司)的scFv片段库，Dyax Corp(现为Shire)的人类Fab-片段库，XOMA的scFv和Fab库，以及MorphoSys开发的完全合成的人类组合抗体scFv (HuCAL)和Fab (HuCALGold)库[97］．

人抗体的亲和选择

抗体文库通常通过迭代选择循环筛选，以丰富目标结合噬菌体，然后将结合噬菌体扩增大肠杆菌细胞。抗体文库的亲和筛选过程称为生物筛选(图2)。4摄氏度)．重复的选择回合允许非常罕见的抗原结合噬菌体克隆的富集，最终导致最高度特异性的结合物的选择。这个严格的过程是噬菌体展示的一个关键特征，它允许单克隆抗体在短短几周的时间内被分离出来，远远快于传统的杂交瘤方法[99，109］．对于体外选择，必须将目标抗原固定在固体表面上。聚苯乙烯表面具有较高的蛋白结合能力，如96孔免疫板和免疫管，被广泛用于抗原固定。此外，含有蛋白G/A、链霉亲和素、马来酰亚胺或n -羟基琥珀酰亚胺的磁珠可用于固定抗原并在溶液中进行生物筛选。

生物筛选方法不仅局限于已知的重组蛋白。事实上，噬菌体展示技术也可用于选择针对整个细胞的抗体，揭示肿瘤细胞表面先前未知的抗原[110］．癌症是一种极不均匀的疾病，只有少数具有茎样特性的肿瘤细胞能够启动和维持肿瘤的发展;这些细胞通常被称为肿瘤起始细胞或癌症干细胞[111］．噬菌体展示技术非常适合应用于CSC研究，并且已经从噬菌体展示库中鉴定出几种抗体，因为它们能够结合已知的CSC标记，如CD133和CD44 [112，113］．此外，新的CSC表面标记物可以通过选择噬菌体显示的与CSC样群体结合的抗体，然后识别相应的靶抗原来识别。114，115］．肿瘤活检组织作为生物材料的使用使研究人员能够探测肿瘤微环境，这可能与临床应用高度相关。噬菌体显示技术已用于探测癌症组织活检，以产生特异性识别肿瘤亚群的抗体片段，如CSCs和肿瘤相关内皮细胞[116，117，118]以及其他临床相关的肿瘤抗原[119］．

抗体或抗体片段被称为靶向药物输送“导弹”，因为它们能够将药物定向到肿瘤[120］．例如，免疫脂质体已被证明为传统脂质体药物提供了癌症靶向能力，可增加抗癌药物的治疗效果[121］．靶向配体的细胞内化是肿瘤靶向脂质体药物传递成功的重要结果[99，122］．为此，研究人员设计了一种基于噬菌体展示的高效选择方法来绘制肿瘤内化表位，其中噬菌体展示库与活癌细胞在37℃下孵育[123］．该方法成功地应用于几种肿瘤中快速识别具有高内化率的几种scFvs;目标抗原随后被确定，细胞内药物传递系统被进一步开发[99，124］．

利用噬菌体展示鉴定单克隆抗体完全是在体外进行的。因此，它不受免疫耐受性的限制，允许识别针对低免疫原性抗原或那些难以使用动物免疫方法获得的抗体(例如，聚糖或毒性试剂)。在突发性传染病爆发时，当识别针对新病原体或基因突变病原体的特异性抗体时，该试验的体外性质尤其有用[125，126，127］．病原体上的抗原通常会在患者体内引起强烈的免疫反应，使受感染的个体通常会自然产生高亲和力抗体[128］．为了获得这些抗体，可以从病原体感染者的pbmc中快速收集mRNA，并将其用作噬菌体显示文库的基因库[129］．这样一个文库可以快速识别高亲和力抗体，然后可作为疫苗设计的指南，或用于开发治疗药物和诊断试剂。

此外，对生物筛选方法进行了改进，以分离和鉴定一些对大流行性流感病毒具有广泛中和活性的抗体[130，131］．Chen等人报道了从2013年爆发的感染新型甲型H7N9流感病毒的恢复期患者的pbmc中提取的噬菌体展示Fab文库。利用该文库，分离出靶向纯化H7N9病毒的抗体[132］．发现两种人抗体与病毒血凝素抗原的受体结合位点相互作用，对H7N9活病毒表现出较高的中和活性[132，133］．

新出现的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)可诱发一种严重急性呼吸综合征样疾病，死亡率约为43% [134］．迄今为止，尚无预防或临床治疗中东呼吸综合征的疫苗或抗病毒药物。噬菌体显示的大型人类naive单链抗体文库(Mehta I/II)， 2.7 × 10¹⁰丹娜-法伯癌症研究所的克隆被用作分离人类MERS-CoV抗体的资源[135］．在另一个项目中，马来西亚的一个研究小组使用naïve人类scFv库改进了平移策略(库大小为10⁹)成功鉴定MERS-CoV核蛋白特异性单克隆抗体[136］．

上述研究为了解人抗体对病毒病原体感染的反应提供了见解，并提供了如何利用爆发现场开发基于人抗体的免疫疗法以预防和早期治疗病毒病原体的例子[137］．

从噬菌体展示成功研制抗体药物

目前临床使用的完全人类治疗性抗体是从噬菌体展示或转基因小鼠方法中发现的[138］．噬菌体展示的优势是允许研究人员定制成功抗体药物的关键特征(例如，亲和力、特异性、交叉反应性和稳定性)。目前有九种噬菌体显示衍生的人类抗体被美国FDA批准用于治疗人类疾病(表1)，证明了该技术作为抗体发现平台的可靠性。

Adalimumab (Humira)由BASF生物研究公司和Cambridge Antibody Technology联合开发。它不仅是第一个获得市场批准的噬菌体展示衍生抗体，而且阿达木巴布也是第一个获得批准的(2002年)完全人单抗药物[139］．阿达木单抗结合并抑制TNFα，被批准用于治疗炎症性疾病，如类风湿和银屑病关节炎、克罗恩病和牛皮癣。阿达木单抗是世界上最畅销的药物[140艾伯维(AbbVie)报告称，该公司2018年销售额为199亿美元2)．剑桥抗体技术公司还从噬菌体展示中鉴定出针对BLYS (B淋巴细胞刺激剂)的人类抗体[141］．BLYS是肿瘤坏死因子超家族细胞因子的一员，诱导B细胞增殖和分化，与系统性红斑狼疮(SLE)呈正相关。这种抗blys抗体被命名为belimumab, GlaxoSmithKline以Benlysta的名称上市，成为首个被批准用于治疗SLE的药物(2011年)[142］．剑桥抗体技术公司成立于1989年，于2006年被阿斯利康以13.2亿美元收购[143］．

酪氨酸激酶受体，包括EGFR和血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)，在肿瘤发生中起着至关重要的作用，在肿瘤中的表达和激活高于正常组织。这些特征使受体成为药物开发的潜在有价值的靶点。Necitumumab (Portrazza)是一种抗egfr人抗体，通过筛选具有3.7 × 10非免疫噬菌体Fab库的高egfr表达的表皮癌细胞(A431)来鉴定¹⁰克隆(105］．Necitumumab于2015年获批，目前是与吉西他滨和顺铂联合治疗鳞状NSCLC的一线治疗方法[144］．VEGFR2不仅在肿瘤内皮细胞中高表达，调控肿瘤血管生成，而且在癌细胞表面也有表达。抗vegfr2人类抗体ramucirumab (Cyramza)被批准用于治疗胃癌、转移性NSCLC和转移性结直肠癌[145，146］．ramucirumab的开发是通过使用噬菌体显示的人类naïve Fab文库(Dyax)启动的，该文库包含3.7 × 10¹⁰针对人VEGFR2蛋白胞外结构域进行生物筛选的独立克隆[105］．选择三个Fab克隆，D2C6, D2H2和D1H4，基于它们与VEGFR2具有纳摩尔亲和力的特异性结合以及中和vegf -a激活的VEGFR2信号的能力。有趣的是，这三个Fab克隆与小鼠VEGFR2没有交叉反应，并且共享相同的V_H序列(147］．经过严格的生物筛选轮亲和成熟后，选择了Fab克隆1121 (IMC-1121B)，其vegfr2结合活性提高了30倍以上。这个克隆体随后被改造成完整的人体IgG₁版本(ramucirumab)，其亲和力为50 pM [148］．

PD-L1是一种细胞表面蛋白，与免疫细胞上的PD-1受体结合，下调T细胞的炎症活性，促进免疫系统的自我耐受。许多类型的肿瘤被发现在癌细胞表面表达PD-L1，利用免疫抑制作用来逃避免疫攻击。Avelumab (Bavencio)是完全的人IgG₁lamda抗PD-L1抗体，来源于噬菌体展示的naïve Fab文库(Dyax) [149］．Avelumab不仅能阻断PD-L1与PD-1的结合，还能在癌症中诱导ADCC [150］．后者的功能不同于其他免疫检查点阻断抗体。2017年，美国FDA批准avelumab用于治疗尿路上皮癌和默克尔细胞癌(一种侵袭性皮肤癌)[151］．

牛皮癣是一种慢性自身免疫性炎症性疾病，导致皮肤细胞过度生产，其特征是隆起、炎症、红色病变和斑块，并伴有身体疼痛和瘙痒。Guselkumab (Tremfya)是由Janssen开发的一种完全人抗体，可中和anti-IL-23。在MorphoSys的许可下，HuCAL抗体库用于生成guselkumab [152，153］．2017年，guselkumab获美国FDA批准上市，用于斑块型银屑病的治疗[154］．

遗传性血管性水肿是一种罕见疾病，可导致身体各部位自发、反复发作并可能危及生命的肿胀发作[155］．该病通常与c1 -酯酶抑制剂缺乏或功能障碍有关，并与血浆激肽抑制素过度活跃引起的过度缓激肽产生有关[156］．Lanadelumab (Takhzyro)是一种源自Dyax噬菌体库的完全人单抗;它直接结合血浆激激素的活性位点，抑制缓激肽的产生。Lanadelumab于2018年在美国和加拿大获得批准，用于预防≥12岁患者的遗传性血管性水肿发作[157］．

药物开发工作的成功高度依赖于获得产品和技术的专利保护，同时避免侵犯他人的专利。因此，噬菌体显示抗体发现平台的知识产权构成了一个不断变化的格局，极大地影响了药物开发。目前(2019年)，几乎所有与噬菌体显示技术相关的关键专利均已到期，包括2011年在欧洲到期的Breitling/Dübel (EP0440147)和McCafferty/Winter (EP0774511, EP0589877)专利[149］．Dyax和Cambridge Antibody Technology噬菌体抗体库的美国专利也已达到20年的保护期(表2)3.)．这些专利的到期将允许更多的公司创建噬菌体显示人抗体库，推进治疗性抗体进入临床。知识产权限制的解除也将刺激学术机构将已开发的噬菌体抗体转化为临床。

许多研究人员已经开始利用这些免费技术。例如，哈佛大学Dana-Farber癌症研究所的Wayne Maraso及其同事构建了两个噬菌体显示库，包含120亿个(Mehta I)和150亿个(Mehta II)人类naïve scFv抗体噬菌体。这些文库已被用于识别针对各种靶标的大量人类单链抗体[158，159］．詹姆斯·马克斯的团队还在加州大学旧金山分校建立了一个噬菌体展示的人类单链抗体库，其中包含67亿成员[98］．该库已生成一组具有亚纳摩尔亲和力的膜蛋白和活组织特异性抗体[98，160，161］．我们还在台湾中央研究院细胞与有机生物学研究所(ICOB)建立了噬菌体展示的人类幼稚单链抗体文库。ICOB噬菌体抗体库的抗体基因库是从50个健康人类供体的外周血母细胞中分离出来的，产生了600亿个单链抗体克隆的文库。该集合已成功用于选择结合广泛范围的目标抗原的抗体，包括纯重组蛋白、聚糖、癌细胞和病毒颗粒[99，103，104］．

产生人类抗体的小鼠

转基因动物为抗体药物的开发提供了可靠的平台。与其他生产人源抗体的技术相比，转基因动物具有不需要人源化、多样性强、体内亲和成熟和克隆选择等优点。然而，人Ig基因座的大尺寸是转基因小鼠抗体技术发展过程中的一个挑战。此外，在转基因小鼠中产生与人类相似或相当的基因库需要不同的重排，并结合人类V、D和J片段的高表达[162］．为了克服这些主要挑战，不同的策略已经成功地用于产生动物表达人抗体库(表4) [35，36，165］．

完全人抗体小鼠

在转基因小鼠中产生人抗体的想法首次提出是在1985年，当时Alt等人。166他提出将人类抗体基因引入小鼠生殖系。这一想法是前所未有的，为人类抗体生产的发展提供了新的方向。1989年，Brüggemann等[167]克隆了第一个人类重链结构，包含两个人类V_H基因的多样性片段(D)与人类重链连接簇(J_H)和μ常数区域。这个25 kb的构建物作为一个千粒质粒被微注射到受精卵中，允许它随机插入到小鼠基因组中。在这些转基因小鼠中，约4%的B淋巴细胞表达人μ链。此外，利用该转基因株还可建立人IgM抗体杂交瘤。1992年，Taylor等人克隆了人类κ轻链[168]构建，包含1个人κ轻链变量(Vκ)基因、人κ轻链连接簇(Jκ)和κ常数区(Cκ)。而小鼠表达人类重链(V_H曹磊_H- cμ- cγ₁)和人源kappa轻链，人源抗体的数量不到总抗体的10%，因此人源抗体的表达与小鼠内源性Ig的表达不相容[168］．

在类似的时间，产生了各种小鼠Ig敲除小鼠品系。1993年，Chen等人敲除小鼠J_H和Jκ基因靶向缺失，灭活小鼠Ig [169，170］．然后将人类IgH和IgL转基因小鼠与小鼠IgH和IgL敲除小鼠杂交，试图创造出能够产生更多样化的人类抗体的品系。1994年，第一个转基因人类Ig小鼠品系HuMabMouse [35]，由Longberg等人生成。在这一行中，人类IgH和IgΚ在小鼠IgH和IgΚ缺陷小鼠中表达。整个人类IgH基因组约为1.29 Mb, IgΚ约为1.39 Mb，但引入小鼠的人类Ig基因组不到80 kb [35］．由于抗体的多样性来自于种系V(D) J基因，因此引入更多的人类可变基因将导致产生的抗体的多样性是合理的。

同样，戴维斯等人。171]和Choi等人。[172] 1993年利用酵母人工染色体(YAC)载体，通过酵母同源重组分别构建了人IgΚ (~ 300 kb)和IgH (~ 85 kb)基因。1994年，格林等人。[37]构建了人类IgΚ (~ 170 kb)和IgH (~ 220 kb)基因组YACs，并通过酵母球质体- es细胞融合成功导入小鼠胚胎干细胞。此外，在1997年，Mendez等人[36]将更大的人类IgΚ (~ 700 Kb)或IgH (~ 1 Mb) YAC导入小鼠ES细胞，将人类Ig小鼠与小鼠IgH和IgL敲除小鼠杂交，生成XenoMouse [131］．不出所料，XenoMouse只表达人类抗体，而不是小鼠抗体[173］．虽然该系的开发消除了小鼠内源性Ig的干扰，扩大了人Ig基因，但由于缺乏小鼠恒定区基因表达，人抗体产生、Ig类切换和体细胞高突变的效率仍然很低[158］．

嵌合人抗体小鼠

为了克服完全人重链抗体的缺点，有必要保留原有小鼠常数区。如果能在小鼠体内产生人Fab和小鼠Fc的嵌合抗体，则小鼠Fc将在抗体亲和成熟过程中调节体细胞高突变的信号[158，174，175]和抗体效应功能[174，176］．沿着这些路线，奥斯本等人。163连结的人_HD和J_H2013年大鼠常数区基因座。用细菌人工染色体(BAC)和YAC技术将人IgH和IgL的大片段亚克隆并连接，然后将小粒质粒微量注射到受精卵鼠卵母细胞中。同时，用锌指核酸酶沉默内源性大鼠Ig位点。由此产生的大鼠毒株(OmniRat)嵌合人表现出与野生型大鼠相似的抗体产生、抗原亲和力和体细胞突变。2014年，Lee等人。[164]利用BACs与Cre/loxP重组小鼠ES细胞，生成人V小鼠毒株_H曹磊_H和Vκ-Jκ直接插入小鼠Cμ和Cκ区上游(KyMouse)。抗原免疫后，KyMouse可以处理体细胞高突变，产生高亲和力嵌合人抗体。在另一项研究中，Murphy等人。165]使用BACs组装大的人类Ig基因，并连续微量注射到小鼠胚胎干细胞中。人类IgH和IgL基因靶向并取代了恒定区域上游的小鼠IgH和IgL (VelocImmune小鼠)。

成功开发人抗体小鼠抗体药物

通过转基因动物产生人类抗体已经由七家公司完成:Abgenix, XenoMouse(2005年被Amgen收购);Medarex, HuMAbMouse(2009年被Bristol Myers Squibb收购);配体,OmniRat;Kymab KyMouse;Regeneron VelocImmune小鼠;以及最近的Harbour Antibodies, H2L2 Mouse和Trianni Inc.， Trianni Mouse [162，165)(表4)．2006年，美国FDA批准了首个从转基因小鼠中提取的抗体药物[177]，截至2019年，19种转基因动物源性抗体药物[17，18，19，20.，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30.，31，32，33，34，177由Xenomouse, HuMabMouse和VelocImmune mouse生成的，已上市(表5)．其中8种药物用于癌症治疗，其他药物用于自身免疫或炎症性疾病。

目前已有7种由XenoMouse生成的美国fda批准的抗体药物(表2)5)．2006年，首个panitumumab (Vectibix, Amgen, human IgG2/kappa)被批准用于野生型KRAS治疗表达egfr的转移性结直肠癌[188］．该单抗阻断EGFR及其配体的相互作用，从而抑制EGFR信号通路，诱导癌细胞凋亡。来自XenoMouse的两种抗体药物用于自身免疫性皮肤病。一种是secukinumab (Cosentyx, Novartis，人IgG1)，与促炎细胞因子IL-17α结合以减轻银屑病炎症[189］．另一种是brodalumab (sililiq, Valeant Pharmaceuticals, human IgG2)，它与IL-17受体结合，抑制IL-17家族细胞因子的作用。这两种单克隆抗体药物分别于2015年和2017年被美国FDA批准用于治疗牛皮癣。

从HuMabMouse开始，美国FDA已经批准了8种抗体药物(表2)5)．两种药物，ipilimumab (Yervoy，百时美施贵宝，人类IgG1)和nivolumab (Opdivo，百时美施贵宝，人类IgG4/kappa)，用于黑色素瘤治疗;这两种药物分别于2011年和2014年获得批准。伊匹单抗与免疫检查点抑制剂CTLA-4结合，阻断其与APCs上B7的相互作用，并导致细胞毒性T淋巴细胞杀死癌细胞[190］．Nivolumab识别PD-1，降低抑制性信号，恢复患者肿瘤特异性T细胞的免疫反应[191］．值得注意的是，nivolumab也于2018年被批准用于非小细胞肺癌的治疗。HuMabMouse衍生的mAb药物中，部分用于自身免疫性疾病。例如，ustekinumab (Stelara, Johnson & Johnson, human IgG1/kappa)结合细胞因子，特别是IL-12和IL-23的p40亚单位，阻断促炎信号以缓解炎症。该药被批准用于治疗严重斑块型银屑病[17] 2009年和克罗恩病[192)。

VelocImmune小鼠是第二代转基因嵌合小鼠，已获得四种批准的药物(表2)5)．Dupilumab (Dupixent，赛诺菲和Regeneron，人IgG4)结合IL-4受体并抑制IL-4和IL-13通路，作为一种湿疹治疗方法。Sarilumab (Kevzara，赛诺菲和Regeneron，人IgG1)通过与IL-6受体(IL-6R)结合抑制IL-6信号通路，否则会上调肝细胞释放类风湿性关节炎相关因子。这两种药物都在2017年获得批准。值得注意的是，尽管阿斯利康拥有XenoMouse，并拥有剑桥抗体技术公司(Humira的噬菌体展示公司)，但它还是花了1.2亿美元购买了几对VelocImmune小鼠[193］．

为了提高产品的多样性和产生更好的抗体药物，自1989年第一只转基因小鼠产生以来的30多年里，主要的开发工作已经产生了模型，如完全人抗体小鼠和第二代嵌合人抗体小鼠[167］．转基因动物的不断改良和发展为全球药厂开发抗体药物提供了更多的可能性。

单B细胞抗体技术

在人类免疫系统中，抗体反应是强大的，高度特异性，中和和自我耐受。使用传统杂交瘤技术或转基因小鼠生产治疗性人抗体需要长期的免疫程序和筛选，而临床使用小鼠抗体可能引发严重的免疫原性反应(如HAMA) [194］．为了避免这些障碍，开发了一种用eb病毒使人B细胞永生的技术[195，196，197］．这种方法在某些情况下是有用的，但它有缺点，例如对一些患者效率低，难以维持一些转化克隆的稳定性。虽然携带人类Ig基因的小鼠已经被创造出来[35，36，163，164，165]，这些小鼠的免疫反应性往往不能像自然的人类抗体反应那样被强有力地触发。因此，在紧急情况下，如传染病，单B细胞抗体技术的主要优势是只需要几个细胞，允许高效和快速分离潜在的单克隆抗体。此外，单个B细胞克隆保留了生物介导的重链和轻链配对，而不是噬菌体显示抗体库中单克隆抗体的随机配对。当这些随机配对的单克隆抗体从单链抗体转移到完整的IgG格式时，偶尔会失去结合亲和力或产生自我反应。

单个B细胞的鉴定与分离

使用微操作可从pbmc或淋巴组织中分离出单个B细胞[198，199]，激光捕捉显微解剖[200]，以及荧光激活细胞分选[199，201，202］．通常，单个核细胞是通过Ficoll-Paque密度梯度离心从pbmc或骨髓中纯化出来的。基于B细胞在不同阶段特异性细胞表面标记物的表达，荧光激活细胞分选分离单个B细胞被广泛应用，特别是在鉴定罕见和离散的B细胞亚群方面。抗原包被磁珠[203]和荧光结合抗原[204，205，206]也经常用于选择抗原特异性B细胞，这一过程被称为抗原诱捕。使用抗原包被磁珠分离的B细胞产生对抗Puumala病毒的中和人单克隆抗体[207］．最近，抗原偶联荧光珠已被用于识别抗原特异性B细胞[208］．轮状病毒的荧光病毒样颗粒可作为单个rv特异性B细胞的抗原诱饵，这些细胞是从感染轮状病毒的健康婴儿或成年供体中提取的[209］．HIV包膜蛋白抗原也被用于分离广泛中和HIV-1的抗体[210，211］．此外，有报道分离出登革病毒特异性记忆B细胞[212，213］．因此，抗原诱捕可以作为一种初步选择工具应用于多克隆混合物。

单B细胞克隆及抗体筛选

在单个B细胞分选后，直接克隆各Ig重链和对应的轻链[201，202］．这一步包括使用嵌套或半嵌套逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来扩增每个鉴定的B细胞的可变重链和轻链。通常，正向引物指向IgH和IgL可变前导序列，反向引物补充Ig常数区域[201，214］．通过优化不同引物组合，提高了V_H和V_l可改进[201，215］．然后将这些基因克隆并在哺乳动物细胞系中表达，立即生成重组单克隆抗体。在检测单抗反应性后，确定每种生成的单抗的特性。此外，对于具有理想反应性的分泌单克隆抗体的高通量筛选和评估，基于细胞的微阵列芯片系统[216]和微刻技术[217，218，219，220已经被描述过了。基于细胞的微阵列芯片系统，即芯片上的免疫点阵列分析，能够通过涂有抗Ig抗体的芯片捕获分泌的抗体，因此，它被用于识别和恢复特定的抗体分泌细胞[216］．微雕刻方法依赖于使用软光刻技术来生成包含单细胞分泌抗体的微阵列[217］．这两种方法提供了早期和快速鉴定克隆与高亲和力和特异性的抗原感兴趣的优点。

单B细胞产生人抗体

面对来自新兴病原体的威胁，免疫疗法的快速发展或对抗体库多样性的深入了解是有益的，而单个B细胞分选提供了一种高效的技术来实现这些目标。过去，针对细菌、寄生虫、病毒感染或自身免疫性疾病，采用单B细胞方法制备人单克隆抗体。

在细菌,炭疽杆菌是最令人担忧的物种之一。炭疽杆菌是一种致命病原体，可引起人类严重的炭疽病，并已被用作生物武器。虽然抗生素可用于炭疽治疗和暴露后预防，但来自单个人类B细胞的抗炭疽保护性抗体仍将是治疗工具包的重要补充[221，222］．在一个针对酵母菌感染的例子中，抗假丝酵母单人B细胞法获得的单克隆抗体可增强吞噬作用，以预防播散性念珠菌病[223］．

单B细胞方法也成功地产生了抗病毒单克隆抗体。从人抗原特异性记忆b细胞培养物中快速分离出登革热中和抗体[224]和denv免疫个体外周血中抗原特异性B细胞的特征[213都有报道。在另一个例子中，Iizuka及其同事描述了利用单B细胞抗体基因克隆鉴定巨细胞病毒pp65抗原特异性人单抗[225］．对于轮状病毒，采用单B细胞法分析vp6特异性B细胞在原始B细胞亚群和记忆B细胞亚群中的轮状病毒抗体基因库[226]，并通过筛选小肠粘膜中的单个B细胞生成轮状病毒特异性人单抗[227］．针对寨卡病毒NS1的人单克隆抗体也已通过单B细胞方法产生[228］．除了用于细菌和病毒感染的单克隆抗体外，单人B细胞方法还产生了用于癌症的补体因子H (CFH)治疗性抗体。重组抗cfh抗体可通过补体激活和释放过敏性毒素诱导补体介导的细胞毒性(CDC) [229］．

临床试验中单个B细胞来源抗体的开发

许多针对病毒的单克隆抗体目前也在临床试验中。例如，埃博拉病毒是一种高度致命的病原体，可导致25-90%的人类死亡率。治疗埃博拉病毒感染的单克隆抗体来自接种疫苗的人类捐赠者或幸存者的B细胞[230，231，232］．令人印象深刻的是，人mAb114来自于针对扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白的分类记忆B细胞，在攻击后5天给药后可以保护猕猴[231］．该药物的临床试验处于I期(NCT03478891)、II期和III期(NCT03719586)。

获得性免疫缺陷综合症是由艾滋病毒引起的，全世界估计有3690万人感染。HIV-1包膜蛋白是抗体和疫苗设计的一个有吸引力的治疗靶点。通过单B细胞方法已经产生了五种抗hiv包膜蛋白的人单克隆抗体，并正在临床试验中进行评估(3BNC117, I/II期;10-1074，第一期;VRC01, I/II期;PGT121，第I/II期及N6，第I期)[233］．一项I期临床试验(NCT02579083)也正在进行中，研究MB 66联合抗单纯疱疹病毒抗体(AC8)和抗hiv抗体(VRC01)预防HIV-1和单纯疱疹病毒的性传播。

不同的流感病毒每年都会引起大流行，而流感疫苗是预防季节性流感的最有用的措施。分离单个B细胞以产生强效和广泛中和的抗流感抗体已成为一项流行的工作[234，235］．MHAA4549A是一种靶向甲型流感病毒血凝素柄的人单抗，从接种流感病毒的捐赠者的单个人浆母细胞中克隆而来[236］．一项MHAA4549A作为单一疗法治疗急性无并发症季节性甲型流感的二期临床试验最近在健康成人中完成(NCT02623322)。CT P27包含两种人单克隆抗体(CT P22和CT P23)，由Celltrion创建，目前处于二期(NCT03511066)。RG 6024，也称为MHAB5553A，由Genentech公司用改良版的单B细胞分离方法生成[237];目前正在进行一期试验(NCT02528903)。另一种抗体TCN 032的II期试验于2012年停止(NCT01719874)。

自然感染成人记忆B细胞中呼吸道合胞病毒(RSV)抗体谱分析[238]或从感染rsv的婴儿中产生中和抗体[239]也已进行。MEDI8897是MedImmune公司开发的一种抗rsv抗体，目前正在进行II期临床试验(NCT02878330)的安全性和有效性评估。

在过去的十年中，通过B细胞技术产生单克隆抗体变得越来越有吸引力。然而，目前还没有美国fda批准的通过该方法开发的治疗性单克隆抗体用于任何疾病的临床治疗。虽然单B细胞技术具有不可替代的优势，但仍有许多挑战需要克服。例如，抗原标记技术、分选抗原的结构(如单体或二聚体)和引物组的设计都是成功生成单克隆抗体的重要考虑因素。在未来，从单个B细胞平台中恢复单克隆抗体可能是与下一代测序相结合的强大工具，用于开发新型诊断、药代动力学应用和临床治疗。

抗体的亲和成熟

从人源化、噬菌体或转基因方法中鉴定出的抗体通常被进一步改造，包括在结合区域用结合责任取代残基。此外，抗体结构中的点突变有时会导致产物的抗原相互作用比原抗体弱(低亲和力)，但某些突变会导致更强的相互作用(高亲和力)。增强抗原亲和力的过程称为亲和成熟。V(D) J重组后，成熟B细胞在辅助性T细胞的帮助下发生亲和成熟。

亲和成熟是体液免疫反应的一个重要特征，可导致抗体具有低皮摩尔亲和[240，241］．高亲和力是抗体中和细胞因子或生长因子诱导信号的关键属性。一般来说，单抗要考虑用于治疗性药物开发，其对靶抗原的亲和力应小于或等于1nm [242］．此外，小鼠单抗的人源化往往会降低亲和力[243］．因此，使用亲和成熟往往是抗体药物开发的必要步骤[244］．

亲和成熟的途径

噬菌体展示和酵母展示已广泛用于抗体的亲和成熟，因为它们易于筛选高亲和变异和高通量应用[81］．提高抗体亲和力的方法大致可分为两大类。首先是生成一个大型随机突变CDR库或整个变量域序列，然后从大量突变体中选择更高亲和力的变体。另一种方法是通过模拟体内亲和成熟的聚焦诱变或热点诱变制备小型文库。在这种集中的方法中，在六个cdr中的每个单独位置或变量域中的一个离散点上选择一个高亲和力的变量进行随机化。通常的做法是结合不同的突变，导致亲和度的小幅增加。这些不同突变的组合可产生相加效应或协同效应，可导致抗体对抗原的亲和力大幅提高[245］．噬菌体展示技术可用于在严格的生物筛选条件下鉴定抗体基因突变文库中的高亲和力抗体，包括减少抗原量、延长孵育时间和强化洗涤步骤，或与可溶性抗原竞争[104，246］．利用噬菌体显示V_H和V_lCDR3突变库，抗her2抗体亲和力提高1200倍以上[97］．

抗体基因的多样化是体外亲和成熟的第一步，这一步可以通过随机突变、靶向突变或链洗牌等多种策略来实现[246］．通过突变体中易出错的PCR，可以将突变随机引入抗体基因的可变区域大肠杆菌压力(247，248］．链洗牌方法是指两个链中的一个V_H和V_l，与一系列合作伙伴链进行固定和重组，以产生下一代库[249］．此外，突变可以被引入抗体基因的特定区域。这种类型的靶向突变方法被用于使CDR残基多样化，并被证明可以有效地改善抗体的亲和力[250］．因此，该方法与B细胞进化过程中的体内体细胞突变更相关，因为突变在CDR中比框架残基更有效地积累。

近年来，治疗性抗体领域经历了快速增长，成为治疗市场的主导力量。然而，治疗性抗体领域仍有显著的增长潜力。传统上，抗体被用于治疗癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病。如果能够清楚地阐明特定疾病的分子机制，并且能够识别参与发病的特定蛋白质或分子，抗体可能提供一种有效的治疗选择。例如，抗cgrp受体抗体(erenumab, galcanezumab或fremanezumab)已被开发用于预防偏头痛。PCSK9抗体(evolocumab或alirocumab)用于治疗高胆固醇血症。抗成纤维细胞生长因子23 (FGF23)抗体(burosumab)用于治疗x -连锁低磷血症。抗il6r抗体(sarilumab和tocilizumab)可用于类风湿性关节炎的治疗。抗因子IXa/Xa抗体(emicizumab)是血友病a的一种有价值的治疗方法，抗von Willebrand因子抗体(caplacizumab)已被批准用于血栓性血小板减少性紫癜的治疗，其他抗体将在不久的将来被批准用于新的适应症。

治疗性抗体大致可分为两大类(图2)。5)．在第一类中，裸抗体直接用于疾病治疗。这类癌症治疗可能通过几种不同的机制起作用，包括介导途径(如ADCC/CDC)、直接靶向癌细胞诱导凋亡、靶向肿瘤微环境或靶向免疫检查点。在介导途径中，抗体通过招募自然杀伤细胞或其他免疫细胞杀死癌细胞。近年来，有新的技术发展增强ADCC或CDC的治疗效果，如抗体Fc点突变[251，252，253]或糖基化修饰[254，255，256，257，258来提高癌细胞的杀伤能力。肿瘤细胞的直接诱导凋亡一直是治疗性抗体的首选机制。在靶向肿瘤微环境方面，抗体可以通过靶向参与癌细胞生长的因子来抑制肿瘤的发生。例如，Avastin针对血管内皮生长因子(VEGF)抑制肿瘤周围的血管生长，关闭癌细胞生长所需营养物质的供应。免疫检查点已被证明是癌症治疗的有价值的靶点。在未来，评估抗体与化疗药物、放疗或其他生物制剂协同作用的研究将极大地有利于抗体治疗学的进一步发展。此外，新型生物标志物的鉴定可能会提高基于抗体的人类疾病治疗的有效性和特异性。

在第二类抗体药物中，对抗体进行额外的修饰以增强其治疗价值。一些常用的方法包括免疫细胞因子、抗体药物偶联、抗体-放射性核素偶联、双特异性抗体、免疫脂质体和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗。为了产生免疫细胞因子，将选定的细胞因子与抗体融合以增强传递特异性[259］．抗体药物偶联物包括靶向与小分子药物偶联的癌症特异性标记物的抗体;该抗体增强了对肿瘤部位的传递，增加了小分子的疗效，同时通过减少对非靶组织的非特异性毒性来减少副作用[260］．该抗体也可偶联到放射性核素上，以便更具体地将放射治疗导向肿瘤部位[261］．对于双特异性抗体，针对两种受体的抗体被改造以进一步增强治疗效果[262］．抗体参与效应细胞功能可能增强双特异性抗体的治疗效果。对于免疫脂质体，抗体的结合位点(scFv或Fab)从常数区裂解，随后偶联到不同的纳米药物递送系统，如脂质体药物，以提供更特异性的靶向[263，264］．最后，CAR-T包括将嵌合T细胞受体抗体的基因插入到T细胞中，靶向特定的癌症标记物，这样工程细胞靶向并杀死癌细胞[265，266］．近年来，由于这种方法对癌症患者具有显著的临床益处，引起了科学界和医学界的广泛关注。在许多情况下，患者的癌症已经完全缓解，甚至完全治愈[267，268，269，270，271］．

尽管已经建立了产生完全人抗体的新方法，如人抗体转基因小鼠和人单B细胞抗体技术，但噬菌体展示仍然具有作为抗体药物发现平台的优势，基于其高效和经济的体外选择方法。近年来，一些先进技术已应用于抗体发现，包括高通量机器人筛选[272]、下一代测序[273]和单细胞测序[274，275］．这些技术有望大大加快特异性噬菌体结合物的鉴定，促进单克隆抗体的开发，用于研究、临床诊断和治疗人类疾病的药物。

通过回顾目前批准的单克隆抗体，人们可以很容易地看到复杂的格式是如何开发来应对治疗适应症带来的挑战的。这些单抗工程解决方案的重点是抗体-药物偶联物，糖工程单抗，免疫调节剂，双特异性单抗和CAR-T细胞。

在这里，我们总结了与治疗性抗体生产相关的五个技术平台，包括嵌合抗体、人源化、噬菌体展示、转基因小鼠和单B细胞抗体技术(图2)。3 d)．噬菌体展示、转基因小鼠和单B细胞抗体技术已被证明是产生人类抗体的可靠方法。作为抗体编码基因的巨大仓库(> 10¹⁰)性质未知，高质量(抗体多样性)噬菌体抗体文库是成功鉴定治疗性单克隆抗体的关键。此外，从噬菌体展示文库中进行最佳选择取决于目标抗原质量、抗原固定化以及严格控制结合和洗涤条件。此外，仔细的预筛选条件设计可以定制从生物筛选中发现的抗体的特征，包括构象特异性、表位特异性、内化、中和和种间交叉反应。目前，从被批准用于治疗的噬菌体库中发现的9种完全人类抗体，还有数十种来自噬菌体的抗体疗法正在进行临床试验，等待进入市场[149)(表5)．

为了提高抗体药物的质量，研究人员开发了几种转基因动物，包括全人小鼠和第二代人嵌合小鼠。转基因动物的不断改良和进步，为全球药厂的抗体药物开发提供了更多的选择。所有获批用于治疗的转基因单克隆抗体均来自三家公司:Abgenix (XenoMouse) [36]， Medarex (HuMAbMouse) [35]，以及Regeneron (VelocImmune) [165］．根据免疫方案，可以通过选择在动物中产生的克隆来获得高亲和力的人抗体。这种选择主要是通过杂交瘤技术来完成的。目前，从这三种转基因动物中发现了19种被批准的人类单克隆抗体(表2)5)．

在过去的十年中，从分离的单个B细胞中产生单克隆抗体已成为一种越来越有吸引力的方法。迄今为止，还没有获得美国fda批准的治疗性单克隆抗体;然而，它有几个主要的优势，目前正在解决持续的挑战。该方法的成功在很大程度上依赖于抗原标记技术，分类抗原的结构(例如，单体或二聚体)和用于扩增的引物组。在未来，从单个B细胞中恢复单克隆抗体有望成为与下一代测序相结合的强大工具，用于诊断、药代动力学应用和临床治疗。

近几十年来，由于抗体药物的高度活跃发展，单克隆抗体已成为治疗许多人类疾病的主要治疗剂之一，特别是癌症、免疫、感染、神经和代谢疾病。直到20世纪90年代末，第一批嵌合单克隆抗体获得批准(1997年年销售额为3亿美元)，单克隆抗体产品的销售增长和监管部门的批准才缓慢。随着随后人源化和全人类单克隆抗体的批准，单克隆抗体产品的产品批准率和销售额迅速增长，2018年全球所有单克隆抗体产品的销售收入为1152亿美元(图2)。1) [276］．未来几年，单抗产品的持续增长预计将成为整体生物制药产品销售的主要驱动力。

不适用。

ADCC:

抗体依赖性细胞毒性

BAC:

细菌人工染色体

布莱:

B淋巴细胞刺激剂

CALCRL:

降钙素受体样受体

CAR-T:

嵌合抗原受体T细胞

疾病预防控制中心:

Complement-mediated细胞毒性

CDR:

Complementary-determining地区

CGRP怎样:

降钙素基因相关肽

慢性淋巴细胞白血病:

慢性淋巴细胞白血病

x:

冠状病毒

CSC:

癌症干细胞

CTLA-4:

细胞毒性t淋巴细胞相关抗原

Cκ:

Κappa常数区

D:

多样性的一部分

表皮生长因子受体:

表皮生长因子受体

ES细胞:

胚胎干细胞

工厂:

Antigen-binding片段

舰队指挥官:

碎片可结晶区

哈马:

人抗小鼠抗体

HER2:

人表皮生长激素受体2

艾滋病毒:

人类免疫缺陷病毒

ICOB:

细胞与有机生物学研究所“，

搞笑:

免疫球蛋白

J_H：

重链连接簇

Jκ:

卡帕连锁加盟集群

马伯:

单克隆抗体

即:

中东呼吸综合征

MM:

多发性骨髓瘤

MSI-H:

微卫星不稳定性高

非小细胞肺癌:

非小细胞肺癌

PBMC:

外周血单个核细胞

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

PD-1:

程序性细胞死亡蛋白1

PD-L:

编程death-ligand

RAMP1:

受体活性修饰蛋白1

RSV:

呼吸道合胞病毒

rt - pcr:

逆转录聚合酶链反应

scFv:

单链片段变量

系统性红斑狼疮:

系统性红斑狼疮

肿瘤坏死因子α:

肿瘤坏死因子α

美国食品药品监督管理局:

美国食品和药物管理局

VEGFR2:

血管内皮生长因子受体2

V_H：

可变重链

V_l：

可变轻链

Vκ:

卡帕可变轻链

YAC:

酵母人工染色体

不适用。

这项工作得到了中国科学院和科技部[106-0210-01-15-02]和[107-0210-01-19-01]，以及台湾生物制药发展转化创新计划-技术支撑平台轴和[107-0210-01-19-04]的支持。吴)。

作者指出

1. 刘益驹、李智秋和蔡汉禅对这项工作也有同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 中央研究院细胞与有机生物学研究所，台北，115，台湾

   吕瑞敏，黄玉芝，刘宜菊，李志秋，蔡汉禅，李信正，吴汉忠

2. 11529台北市南康区学术路二段128号

   Han-Chung吴

贡献

R-M L, Y-C H, I-J L, C-C L, H- z T, H- j L, H- c W撰写了手稿。R-M L, C-C L, H-Z T和H-C W设计并说明表。R-M L, Y-C H, I-J L, C-C L, H- z T, H- j L和H- c W设计和插图。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Han-Chung吴．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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