外周抗体浓度与人骨髓中高度分化的T细胞和炎症过程相关

背景

抗原经历的免疫细胞迁移回骨髓(BM)，在那里它们被维持在骨髓生存壁龛很长一段时间。骨髓中T细胞亚群的组成随着年龄的变化而变化，导致高度分化T细胞的积累和naïve T细胞的损失。虽然先天免疫细胞也受年龄的影响，但很少了解骨髓中维持的不同适应性免疫细胞群之间的相互作用。在这项研究中，我们使用流式细胞术详细分析了从人类骨髓和外周血(PB)中分离出的先天和适应性免疫细胞的表型和功能，以确定在骨髓壁龛支持下，高分化T和B细胞的积累是否限制了其他免疫细胞的维持，或影响其提供保护性抗体浓度等功能。

结果

骨髓中的总T细胞随着年龄的增长而增加，高分化的CD8也是如此⁺不再表达共刺激分子CD28的T细胞，以及自然杀伤T (NKT)细胞、单核细胞、B细胞和naïve CD8⁺骨髓中的T细胞都随着年龄的增长而减少。在骨髓中观察到总T细胞与B细胞呈负相关。骨髓中B细胞百分比与CD8高分化呈负相关⁺CD28⁻T细胞，复制衰老CD8⁺CD57⁺T细胞，还有CD8⁺CD28⁻CD57⁺人口。B细胞与骨髓中产生促炎分子的高分化T细胞的频率之间也有类似的相关性。有趣的是，白喉特异性抗体的血浆浓度与高分化CD8呈负相关⁺CD57⁺T细胞以及耗尽的中央存储器CD8⁺和CD4⁺骨髓中的T细胞。CD8对白喉特异性抗体也有负面影响⁺表达衰老相关基因的T细胞，如细胞周期调节因子p21 (CDKN1A)， KLRG-1和活性氧(ROS)水平升高。

结论

我们的数据表明，骨髓中高度分化、衰老和耗尽的T细胞的积累和维持，特别是在老年时，可能会干扰骨髓中其他细胞群的生存，如单核细胞和B细胞，从而导致外周血白喉抗体浓度降低。这些发现进一步强调了脑基质在免疫记忆长期维持中的重要性。

活化的B细胞和T细胞分化为记忆细胞和效应细胞，并可前往感染区域，通过血液和淋巴循环，或返回周围淋巴器官[1］．此外，许多免疫细胞迁移回骨髓(BM)，在那里它们可以长时间保持不同的激活状态[2］．不同的分化和激活状态可由这些免疫细胞分泌或在其表面表达的标记蛋白来表征[3.］．骨髓以造血及其作为初级淋巴器官的功能而闻名，但其在抗原免疫细胞长期维持中的作用尚不为人所知。BM参与浆细胞、记忆B细胞和T细胞的调节、功能和存活[4］．而CD4的数量⁺和CD8⁺骨髓中的T细胞在衰老过程中保持不变，亚群的组成发生变化，表现为高分化效应记忆细胞增加，naïve细胞减少[5］．CD28是一种存在于T细胞表面的共刺激分子，在T细胞活化时提供次级信号[6］．失去CD28的细胞通常是抗原经历的、高度分化的、促炎的，并优先由IL-15维持在BM中[7，8，9］．CD8⁺CD28⁻已知T细胞在骨髓中随着衰老而增加，在某些条件下它们获得CD57的表达，CD57是复制性衰老和终末分化的标志[10］．

由于BM内的空间是有限的，并且不同的种群具有相同的生存因子，因此有兴趣的问题是一些免疫细胞的积累是否会干扰其他亚群的维持。特别是，骨髓中高度分化的T细胞可能会干扰其他群体的维持，如单核细胞和B细胞，并通过产生促炎分子改变骨髓环境。随着年龄增长，IL-15表达增加[7，11]，并且已知它对CD8的生存很重要⁺CD28⁻T细胞，我们假设，在老年时，BM壁龛可能会招募高分化CD8的高频⁺T细胞，限制了其他细胞类型的空间[7］．骨髓中的B细胞室也受年龄和浆细胞数量减少的影响[12］．由产生细胞因子的基质细胞提供的独特壁龛也被描述为小鼠记忆CD4⁺T细胞[13］．

细胞衰老和衰竭是衰老的典型特征[14］．衰老细胞分泌可溶性和不可溶性因子，如白介素、趋化因子、纤维连接蛋白和胶原蛋白[15]，除了直接分泌诱导低级别慢性炎症的促炎细胞因子外，还可调节与炎症和恶性肿瘤相关的信号通路，当这种促炎细胞因子存在于骨髓中时，可能会影响其孕育长寿免疫细胞的能力[7，16］．细胞衰老是一种通过永久细胞周期阻滞来阻止转化细胞出现的过程，在此过程中细胞保持代谢活性[17］．p21是细胞周期进程的中心调节因子，它是p53途径的主要靶点，p53途径被DNA损伤或其他应激激活[18］．P21促进细胞周期抑制，保护细胞免于凋亡，因此可作为可靠的衰老标记物[19］．除了p21，杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1 (KLRG-1)是T细胞衰老的标志。KLRG-1在CD8的表达⁺T细胞表示一个亚群，它不能进行进一步的细胞分裂，因此终末分化或复制性衰老[20.］．KLRG-1受程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)负调控[21］．PD-1是衰竭的特征标志[22]，最初被认为具有诱导细胞凋亡的能力[23]，但一般而言，它不应被视为衰竭细胞的明确标记[24］．PD-1是一种抑制性受体，在活化的T细胞表面表达，并在慢性感染期间维持[25］．PD-1有两个配体，PDL-1和PDL-2，它们结合后激活细胞周期进程的抑制信号[21]并损害T细胞受体(TCR)的信号传导[23］．PD-1与记忆CD8的增殖标记物Ki67呈正相关⁺和CD4⁺中央记忆(CM) CD8中PD-1密度与Ki67表达呈负相关⁺T细胞[24]，因此，PD-1在非增殖细胞(如CM细胞)上的存在，表明它们已耗尽[23］．p21、KLRG-1和PD-1的表达均随年龄增长而增加[16］．

这些因素导致了一种假设，即效应细胞、衰老T细胞和/或衰竭T细胞在老年骨髓中的积累和维持可能破坏或改变骨髓的免疫功能。我们考虑其他类型细胞如CD4细胞的相应移位⁺T细胞，B细胞和浆细胞，因为争夺基质壁龛。骨髓中的基质细胞介导了浆细胞的长寿命存活[26］．因此，我们假设BM环境的改变可能导致抗体产生受损。为此，在PB中测定白喉特异性抗体的浓度。由于白喉特异性抗体随着年龄的增长而不能很好地维持[27]，我们假设空间竞争，以及老年时BM环境中发生的与年龄相关的变化，可能直接导致老年人对白喉的免疫反应下降。

在目前的研究中，我们调查了B细胞和T细胞亚群之间的空间竞争是否发生在骨髓中。此外，我们还评估了高分化CD8的积累⁺T细胞，已被描述为支持BM中的炎症和氧化应激[11]，可能与维持长寿命浆细胞呈负相关，从而影响外周白喉特异性抗体的产生。

样品制备

样本是从系统健康的个体中获得的，他们没有患有已知的影响免疫系统的疾病。所有样本均来自因骨关节病而接受择期手术的患者。供体95人，年龄39 ~ 87岁(平均年龄67.45±10.95，平均BMI 27.9±5.03，性别50 F, 46 M)。在各个实验中使用的样本数量在图和图例中给出。

为分离骨髓单个核细胞(BMMCs)，一个片段骨海绵质在常规髋关节置换手术中收集到的，否则会被丢弃。骨进一步碎裂，用纯化的胶原酶(CLSPA, Worthington Biochemical;20u /ml)完全RPMI介质(RPMI 1640;康宁添加10% FCS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素;Sigma)在37°C下1小时。使用过滤管离心步骤提取BMMCs，然后使用密度梯度离心(淋巴oprep®;干细胞技术)。收集来自同一供者的肝素化血液，并通过密度梯度离心纯化外周血单个核细胞(pbmc)。

流式细胞术

采用偶联表面抗体进行免疫荧光染色。将BMMCs和pbmc与氟铬标记抗体在4°C下孵育20分钟。细胞用PBS清洗，并使用FACSCanto II (BD Biosciences)进行测量。通过细胞内染色和流式细胞仪检测IFNγ和p21的产生。用30 ng/ml PMA和500 ng/ml ionomycin在10 mg/ml BFA的存在下刺激BMMCs和pbmc 4 h。表面染色后，使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Pharmingen)固定和渗透细胞，并与细胞内抗体孵育。使用FACSCanto II (BD Biosciences)对细胞进行清洗和测量。关于使用的抗体的详细信息可以在附加文件中找到1:表S1。使用固定活力染料(Zombie Violet™fixable活力试剂盒，Biolegend)排除死亡细胞。流式细胞术数据采用FlowJo v10软件进行分析。

抗体浓度测定

检测外周血血浆中白喉特异性抗体。用1 μg/ml白喉类毒素(Statens Serum Institute)包被微量滴度板，并用0.01 M甘氨酸阻断。二抗选用过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体(Chemicon/Millipore)。使用标准人抗白喉血清(国家生物标准与控制研究所)定量IU/ml的特异性IgG抗体。检测限为0.01 IU/ml，低于此浓度的值设为0.005 IU/ml，计算几何平均浓度(GMC)。Ab浓度高于0.1 IU/ml被认为具有保护作用[28］．

RNA的分离和定量RT-PCR

使用RNeasy Plus mini kit (Qiagen)从纯化的BMMCs中分离RNA。第一链cDNA合成使用反转录系统(Promega)完成。采用LightCycler 480系统(Roche Diagnostics)、2× SYBR Green 1 Master (Roche Diagnostics)和β-actin作为管家基因进行定量RT-PCR实验，对效应细胞/记忆细胞存活因子进行相对定量。序列特异性寡核苷酸引物采用Primer3软件设计[26]并由MWG生物技术公司(Ebersberg，德国)合成。使用以下引物:IFNγFW 5 ' - GTAGCAATTGCCTGAATAATG-3 '， IFNγRW 5 ' - GTTGTGCCTTCTGAAACT-3 '， IL-15FW 5 ' - attttgggctgtttcagtgc -3 '， IL-15RW 5 ' - ttactttgcaactggggtga -3 ';βactinfw 5 ' -tcctccctgggcatggagt-3 '， βactinrw 5 ' -tctccttctgcatcctgtcg-3 '。

ROS的测量

将BMMCs和pmcs与浓度为1:250的荧光染料二氢乙二胺(Sigma-Aldrich)在完全RPMI中孵育20分钟，37℃。细胞在PBS中清洗，用FACSCanto II (BD Biosciences)测量。

统计分析

Pearson相关性被用来确定统计意义，如图例所示。p数值小于0.05为显著值。为排除年龄对相关性的影响，采用SPSS软件对年龄变量进行偏相关控制。用这种方法，年龄对相关性的影响已经完全消除。没有控制年龄的相关值显示在附加文件中1:表S1。对于种群间的比较(图;1，2和附加文件1:表S1)， p值使用Bonferroni校正进行多次比较。

研究批准

研究由当地机构批准，并根据《赫尔辛基宣言》在纳入研究之前获得所有参与者的书面知情同意。

骨髓中T细胞和B细胞的竞争

我们分析了95名年龄在39岁至87岁的捐赠者的骨髓间充质细胞和外周血母细胞中的主要淋巴细胞群和基于分化的亚群。随着年龄的增长，许多群体，如T细胞、NKT细胞、单核细胞和B细胞的频率在BM中增加(表2)1)，所有进一步的计算都根据年龄进行了统计校正。相关系数(r_p)考虑到年龄的影响而获得的数据在附加文件中报告1:表S2。用于定义这些种群的门控策略显示在附加文件中2:图S1。年轻(31岁)和老年(89岁)捐赠者的代表性血流图显示在附加文件中2:图S2在BM环境中，T细胞和B细胞之间可以看到很强的负相关(p< 0.001)(图1)、T细胞及单核细胞(p= 0.0095)(图1 b)．T细胞与NKT细胞之间无相关性(图。1 c)，或T细胞和NK细胞(图。1 d)．这些数据表明，骨髓中的细胞群可能会相互影响，T细胞和B细胞以及单核细胞之间可能存在一定程度的竞争。

高分化CD8⁺T细胞对骨髓中的B细胞有负向影响

表面标记CD28和CD57被用来定义高分化CD8的群体⁺T细胞(附加文件2:图S1)。以确定是否积累了这些高分化的CD8⁺T细胞亚群可能会对其他细胞群的维持产生负面影响，我们与CD28的频率相关⁻, CD57⁺，和CD28⁻CD57⁺CD8⁺骨髓中T细胞和B细胞频率。

有趣的是，B细胞与CD8水平呈负相关⁺CD28⁻（p= 0.0194)2), CD8⁺CD57⁺（p= 0.0788)(图2 b)和CD8⁺CD28⁻CD57⁺（p= 0.0288) T细胞。2摄氏度)．这些数据表明BM中的B细胞可能受到高分化/终分化CD8的影响⁺T细胞。

BM中促炎分子与B细胞频率呈负相关

促炎标志物的基线水平升高，即“炎症”，发生在衰老过程中，因此我们在mRNA水平上量化了IFNγ和IL-15在bmmc中的表达。IL-15由一些BM细胞产生，并被认为支持高度分化的，因此更多的促炎T细胞[7IFNγ的表达水平与骨髓B细胞呈负相关(p= 0.03)3)，而BM中IL-15的表达水平与B细胞呈负相关(p= 0.10)(图3 b)．此外，刺激后T细胞产生IFNγ的频率与BM中B细胞的百分比呈负相关(p = 0.02)(图2)。3 c)．从这些数据中，我们得出结论，除了高度分化的T细胞外，促炎环境也可能对骨髓中的B细胞维持有负面影响。

血浆中白喉特异性抗体的浓度与细胞群、细胞衰老和骨髓中的ROS相关

骨髓中浆细胞长期存活的支持被认为是由骨髓壁龛中的细胞介导的[26］．因此，我们假设BM环境的变化会影响周围的抗体浓度。在血浆中测量白喉特异性抗体浓度，并与BM和PB的细胞群进行相关性，以表明血液中抗体浓度与BM环境之间的可能联系。我们研究了分化标记，如CD57，衰竭标记，如PD-1，细胞衰老标记，包括p21和KLRG-1，以及ROS作为氧化应激指标的存在。用于定义这些种群的门控策略在附加文件中有报道2:图S3-S4白喉特异性抗体浓度与高分化CD8呈负相关⁺CD57⁺骨髓中的T细胞(p= 0.044)，而与PB中的细胞无相关性(图。4)．PD-1⁺CM CD8⁺T细胞和PD-1⁺CM CD4⁺骨髓中的T细胞(p= 0.029、0.039)(图4B和c -上面板)，与外周抗体浓度负相关。PD-1⁺CM CD8⁺来自外周血的T细胞也表现出类似的趋势，但这种相关性没有统计学意义(图2)。4B和c -低面板)。这些数据支持了这样一种假设，即骨髓中衰老和/或耗尽的T细胞的积累会对外周血抗体浓度产生负面影响。

细胞衰老标记物p21在总bmmc和不同T细胞亚群中测量(图2)。5)．白喉特异性抗体浓度与p21的平均荧光强度(MFI)呈负相关(p= 0.0487)，以及CD8的百分比⁺CD57⁺和CD8⁺KLRG-1⁺BM T细胞表达p21 (p= 0.0043 & 0.0013)(图5A-c，上面板)。相反，在PB中，这种相关性仅在CD8中观察到⁺CD57⁺T细胞(p= 0.0497)，当对相同的人群进行分析时(图。5A-c，下部面板)。另外还测量了ROS水平，白喉特异性抗体浓度与bmmc中ROS水平呈强负相关(p= 0.0132)(图5 d(上图)，但与pmcs中的ROS水平无关(图2)。5 d，下面板)。这些数据进一步证实了我们的发现，衰老细胞和/或高度分化细胞，以及BM中ROS水平升高会对外周抗体浓度产生负面影响。

骨髓中免疫细胞的组成随着年龄的增长而变化，可以观察到从naïve向高度分化群体的转变[29］．这种转变通常用于描述免疫衰老[29］．由于慢性感染或T细胞的重复激活也可以驱动T细胞室内的这些变化，巨细胞病毒(CMV)通常被认为是PB中免疫衰老的贡献者[30.]和BM [11］．CMV是一种来自疱疹病毒家族的终身持续病毒，存在于60-100%的老年人群中(取决于队列)，导致CD8内不可逆转的变化⁺年轻的cmv血清阳性个体的T细胞库通常与老年cmv血清阴性个体的T细胞库有些相似。［11，31］．我们观察到的变化在CMV阳性个体中更为明显(数据未显示)。

BM对于维持抗原经历的适应性免疫细胞非常重要，特别是在BM中生存壁龛的长寿免疫细胞[32］．抗原刺激后，效应T细胞/记忆T细胞和长寿浆细胞积聚在BM生存壁龛内，在那里它们可以维持不确定的时间[33］．我们的实验室之前已经证明了CD8的高度分化⁺T细胞积聚在骨髓中[7，9］．这些效应细胞的表型可能受到BM环境的影响，或者BM中同时存在的不同细胞群可能相互作用并争夺空间和/或BM中可能有限的生存因子。

在衰老过程中BM的免疫变化中，T细胞的百分比增加，而PB的数量和功能都减少[34］．我们质疑骨髓中T细胞数量的增加是否可能是由于衰老或耗尽细胞T细胞的积累，从而影响骨髓中其他细胞群，特别是B细胞。T细胞和B细胞以及T细胞和单核细胞之间的负相关与年龄无关，这激发了这些事件可能相关的想法。

IL-7是记忆CD4存活的关键因素⁺和CD8⁺T细胞，作为其生存和稳态的中心调节器[35］．此外，IL-7是一种重要的B细胞因子，支持B细胞发育，并调节B细胞祖细胞的增殖和存活[36］．其他研究表明，IL-7通过诱导静息记忆T细胞中CD70和BAFF的表达间接支持B细胞，从而刺激记忆B细胞的激活和抗体的产生[37］．该细胞因子也被证明在单核/巨噬细胞的调节中发挥重要作用[38］．因此，由于不同的免疫细胞群具有相同的生存因子IL-7，而IL-7是由位于骨髓内受限区域的基质细胞产生的[14]，我们可以假设IL-7可能在空间竞争中发挥重要作用，至少在T细胞、B细胞和单核细胞之间。事实上，在我们的研究中已经观察到BM中B细胞和T细胞以及单核细胞和T细胞之间的负相关。

随着年龄的增长，越来越多的T细胞失去了表面共刺激分子CD28，这对T细胞活化很重要[39］．导致T细胞表面CD28缺失的原因有几个，包括慢性抗原刺激和T细胞重复活化[10］．除了CD28缺失外，一些细胞获得CD57表达，这与无法增殖以及高细胞毒性潜能有关[40］．因此这些CD8⁺CD28⁻CD57⁺T细胞被认为是终分化的T细胞[10］．B细胞与CD8呈强负相关⁺CD57⁺, CD8⁺CD28⁻， CD8⁺CD28⁻CD57⁺T细胞，提示这些高度分化的T细胞影响骨髓中的B细胞维持。与早期分化阶段的T细胞相比，高度分化的T细胞对IL-7的反应较弱，因为它们表达较低水平的IL-7Rα [41］．因此，它们似乎不太可能与B细胞竞争这种细胞因子[41]，而是认为相关性是间接影响的结果。高度分化T细胞的积累，导致促炎细胞因子和ROS水平升高[11]可能还会给B细胞带来压力环境[42］．

随着年龄的增长，可以观察到B细胞反应在数量和质量上的下降。以前已经指出，老化T细胞的功能改变导致B细胞功能缺陷[43］．CD19⁺已知骨髓中B细胞随着年龄的增长而减少[43]，粘附分子CD49d和CD50的表达在老年受试者中降低，这对B细胞粘附上皮细胞很重要[44］．特别是由最终分化的T细胞大量产生的IFNγ，已被描述为抑制B细胞分化[45］．B细胞反应的定量和定性下降，以及B细胞不利的内在变化也已在以前被探索过，特别是独立于T细胞的影响，因为有缺陷的衰老T细胞被怀疑有助于B细胞的衰退[43］．我们首先考虑了所有bmmc中IFNγ和IL-15的mRNA表达，我们发现在BM中IFNγ和B细胞之间存在显著的负相关。除了mRNA表达外，我们还考虑了单个细胞IFNγ的蛋白表达，发现B细胞与促炎IFNγ产生CD8之间存在很强的负相关⁺T细胞。我们还发现B细胞与促炎IFNγ产生CD8之间存在很强的负相关⁺CD57⁺, CD8⁺CD28⁻， CD8⁺CD28⁻CD57⁺T细胞(数据未显示)，突出了促炎环境对B细胞的负面影响。高度分化的T细胞聚集在骨髓中更容易引发炎症[11]，而促炎环境会对B细胞的发育产生负面影响[45］．B细胞被激活后，迅速增殖并发生体细胞超突变，改变其Ig可变区亲和力[46］．这些“类转换”B细胞是经验丰富的免疫细胞，据报道在吸烟者的外周血中含量更高[47］．综上所述，B细胞多样性的丧失与健康状况不佳密切相关，而非年龄。48]，炎症显然对BM细胞群有很大影响。由于抗原驱动的T细胞活化，IFNγ在骨中的存在先前已被证明刺激破骨细胞形成，导致骨质丢失[49]，进一步强调了炎症对骨/骨髓炎的显著影响。这些数据支持了CD8高度分化的假设⁺在骨髓中积累的T细胞不仅支持炎症，而且直接影响B细胞的维持。外周抗体浓度在很大程度上依赖于骨髓中寿命长、产生抗体的浆细胞[50］．这与临床相关，因为在接种疫苗后和在重复暴露于同一病原体的情况下，血清抗体可确保保护[51］．我们认为BM环境和高分化T细胞的积累可能会影响外周抗体浓度。我们调查了白喉特异性抗体浓度，因为白喉特异性抗体浓度是由全球最常用的疫苗之一诱导的，并且已被证明在老年人中维持得不好[27］．

白喉特异性抗体浓度与高分化CD8呈负相关⁺CD57⁺T细胞，耗尽的PD-1⁺CM CD8⁺T细胞和PD-1⁺CM CD4⁺骨髓中的T细胞。PD-1可以在活化的T细胞上表达，并不总是表示细胞衰竭。PD-1的表达与CD45RA的表达呈负相关，记忆细胞中PD-1的表达比例最高[52］．我们用了PD-1⁺因为CCR7，一种在CM T细胞上表达的淋巴组织的归巢标记物，在表达CD8的PD-1中几乎检测不到⁺T细胞[24]，在EM CD8上观察到PD-1的高表达⁺健康人外周血中的T细胞[52］．BM中的细胞衰老，表现为p21在总bmmc中的表达，以及高分化和/或衰老的CD8⁺CD57⁺和衰老的CD8⁺KLRG-1⁺T细胞与外周血白喉特异性抗体降低有关。ROS水平升高也与低抗体浓度相关。外周血中相应的T细胞数量几乎不影响抗体浓度。不幸的是，我们的样本中没有关于白喉疫苗接种的信息。由于我们的队列包括最近接种疫苗的人和几年前接种疫苗的人的混合物，这些方面在相关性中相互补偿。尽管如此，在我们的研究中，不可能区分最近接种了低Ab浓度疫苗的捐赠者和多年前接种了疫苗的捐赠者。

总之，这些结果表明细胞衰老、ROS和衰老CD8的积累⁺骨髓内的T细胞，而非周围的T细胞，可以改变骨髓内长寿命浆细胞产生的抗体，导致抗体浓度降低。

我们的工作进一步证明了脑基质在调节记忆和效应细胞存活方面的重要作用。BM环境的改变或某些群体的积累可能会影响“健康”记忆细胞和浆细胞的生存，导致抗体产生受损。更好地理解这些影响可能有助于我们开发更成功的方法来维持终身保护性抗体滴度。为了保证老年人具有有效的适应性免疫，应在未来的研究中探讨对抗骨髓细胞衰老、ROS和炎症的策略。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

BM:

骨髓

BMMCs:

BM单核细胞

NKT:

自然杀伤T细胞

铅:

外周血

PBMCs:

PB单个核细胞

ROS:

活性氧

T_新兴市场：

效应记忆T细胞

T_EMRA：

效应记忆细胞重新表达CD45RA

我们要感谢因斯布鲁克生物医学老化研究所的每一个人，以及使这项工作成为可能的Klinikum wells - grieskirchen骨科。

这项工作得到了奥地利科学基金(FWF;博士项目HOROS, W1253)和欧盟H2020项目“一个综合方法来解剖免疫系统衰老的决定因素，风险因素和途径”(免疫老化，H2020- phc -2014资助协议号:633964)。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

作者指出

1. 艾琳·奈史密斯(Erin naissmith)和卢卡·潘格拉茨(Luca Pangrazzi)对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 因斯布鲁克大学生物医学老化研究所，Rennweg 10, A-6020，因斯布鲁克，奥地利

   Erin naissmith, Luca Pangrazzi, Marco Grasse, Michael Keller, Carina Miggitsch, Birgit Weinberger和Beatrix Grubeck-Loebenstein

2. 奥地利韦尔斯市格里斯基什纳大街42号韦尔斯-格里斯基兴医院整形外科

   Klemens Trieb

贡献

稿件准备:EN、LP、BW。实验工作:EN, LP, MK, CM, MG数据分析:EN和LP。研究/方案设计:LP、BW和BGL。样本收集和研究设计:KT。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到卢卡Pangrazzi．

伦理批准并同意参与

根据《赫尔辛基宣言》，研究由当地机构批准，所有参与者在纳入研究前均获得书面知情同意。

发表同意书

根据《赫尔辛基宣言》，所有参与者在纳入研究/发表前均已获得书面知情同意。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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