BRCA1/2非家族性三阴性乳腺癌和高级别浆液性卵巢癌的变异和拷贝数改变状况

背景

而这个角色BRCA1/2家族性乳腺癌和卵巢癌的基因已得到很好的证实，但它们在这两种癌症的散发形式中的意义仍有争议。随着聚(adp -核糖)聚合酶(PARP)抑制剂的开发，两者之间的确切关系BRCA1/2基因与散发性三阴性乳腺癌/高级别浆液性癌(TNBC/HGSC)的相关性有待进一步研究。因此，我们进行了一项分析研究BRCA1/2摩洛哥TNBC/HGSC患者的点突变和拷贝数改变。

方法

为了达到我们的目标，我们进行了分析BRCA1/2利用下一代测序技术，对65例TNBC/HGSC患者的FFPE组织块和血液样本中的基因进行了检测。

结果

从我们队列中65例成功测序的患者中，我们在6例不同的患者中检测到5个点变异，其中4个被归类为致病性变异，1个意义未知。关于副本编号的更改，我们发现一个副本编号丢失乳腺癌易感基因1基因和一个拷贝数加入BRCA2基因。基因筛选BRCA1/2使用这些患者基因组DNA的基因表明，其中5人存在种系遗传改变。3例发生了体细胞遗传变异。据我们所知，在我们的研究中发现的三点变异以前从未报道过。

结论

根据本研究发现的结果，在没有癌症家族史的人群中，癌症发生的可能性BRCA1/2高级别浆液性癌的躯体致病性变异为7%。而对于三阴性乳腺癌，体细胞点变异和拷贝数改变似乎是一种非常罕见的遗传事件。

乳腺癌易感基因1而且BRCA2基因编码肿瘤抑制蛋白，涉及修复DNA双链断裂(dsb)。这两种蛋白质都在一个称为DNA同源重组修复途径(HRR)的共同途径中工作。其中一个基因的致病性遗传改变会诱导同源重组缺陷(HRD)，这增加了基因改变和基因组不稳定的可能性，从而形成无法检测的癌细胞[1，2］．

在这方面，在过去的十年中进行了大量的分子肿瘤学研究，以调查药物的影响BRCA1/2基因改变及其在癌症中的作用。这两种基因已被证实在遗传性乳腺癌和卵巢癌中起着重要作用[3.］．其中一种基因突变的携带者一生中罹患乳腺癌的风险为40-70%，罹患卵巢癌的风险为10-45% [4，5］．

而这意味着乳腺癌易感基因1/2家族性乳腺癌和卵巢癌中的基因已被广泛了解，但它们在两种癌症的散发性形式中的作用仍有争议。世界各地的许多研究都表明存在着一种联系BRCA1/2基因改变和零星形式的三阴性乳腺癌(TNBC)和高级别浆液性卵巢癌(HGSC)。因为三分之一BRCA1/2突变的BC患者患有TNBC亚型，近一半的OC患者为TNBC亚型BRCA1/2突变形成HGSC亚型[6，7］．这些发现促使科学研究人员猜测是否存在BRCA1/2两种癌症亚型的体细胞遗传改变[8，9］．

目前，随着聚(adp -核糖)聚合酶(PARP)抑制剂的引入，用于BRCA1/2乳癌及卵巢癌突变患者[4的确切关系BRCA1/2基因与散发性TNBC/HGSC的相关性有待进一步研究。

因此，我们进行了一项研究，我们分析BRCA1/2TNBC和HGSC肿瘤中的点变异和拷贝数改变(CNA)。我们研究的主要目的是确定的患病率BRCA1/2两种恶性肿瘤的体细胞点突变和CNA，以及它们是否能代表一个重要的分子标记。

研究人群

在这项研究中，我们招募了65名女性患者。TNBC 37例，HGSC 28例。招募的患者根据以下标准选择:

入选标准:

• TNBC或HGSC。

• 年龄从45岁到70岁不等。

排除标准:

• 癌症家族史。

• 诊断年龄小于45岁。

• 双边肿瘤。

在签署知情同意书后，收集所有招募患者的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织块和血液样本。通过回顾患者的医疗记录收集临床和组织病理学数据。本研究获得了当地研究伦理委员会的批准。

DNA提取

石蜡组织块和血液样本的DNA提取在Maxwell 16仪器上自动进行，FFPE样本使用Maxwell 16 FFPE组织LEV DNA纯化试剂盒，血液样本使用Maxwell 16血液DNA纯化试剂盒。DNA提取是按照制造商的说明进行的。

使用量子比特3.0荧光仪(赛默飞世尔科学公司)测定洗脱的DNA浓度。

第二代测序

遗传分析乳腺癌易感基因1而且BRCA2基因(登录号分别为NM_007294和NM_000059)突变和拷贝数改变使用Oncomine处理BRCA1/2赛默飞世尔定制的研究分析面板。该面板包含275个引物对在两个池，允许全面的测序BRCA1/2基因。

简单地说，使用Ion AmpliSeq Chef Solutions DL8 Kit在Ion Chef平台上自动执行库准备。随后进行克隆扩增，也使用ION AmpliSeq IC 200 Kit(赛默飞世尔科学公司)在ION Chef平台上自动进行克隆扩增。最后将制备好的测序模板在Ion Personal Genome Machine System PGM (Ion Torrent;Thermo Fisher Scientific, Inc.)使用Ion 318™芯片和Ion PGM™Sequencing Hi-Q Kit v2，根据制造商的指南。

生物信息学分析

测序后，生成的数据最初在Ion Torrent Suite软件v5.4上进行处理(Ion Torrent;赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific, Inc.)，用于生成过滤序列读取并删除不良信号剖面读取。结果读取然后对准H19 (GRCh37)基因组，使用的目标参考基因组序列BRCA1/2基因。最后，深度分析和单核苷酸变体调用使用离子洪流覆盖和变体调用插件(版本5;赛默飞世尔科学公司)。

然后在离子报告分析软件(v. 5.10)上使用Oncomine BRCA(5.10)管道(赛默飞世尔科学公司)分析产生的BAM文件，其中包括单核苷酸变异和拷贝数变异。

在我们的研究中，所有检测到的变异都按照美国医学遗传学和基因组学学院(ACMG)的指南进行分类。

我们所有患者的临床和组织病理学资料汇总于表中1．在我们队列中招募的65名女性中，37人患有TNBC，而28人患有HGSC。

37例TNBC患者的中位年龄为53岁，年龄从45岁到67岁不等。22例(59.4%)为左侧乳腺癌，15例(40.5%)为右侧乳腺癌。这些患者中的大多数被诊断为浸润性导管癌(27例，73%)，而只有10例(27%)患有小叶癌。肿瘤分期方面，30例患者(81%)为T3-T4期，7例患者(19%)为T2期。最后，我们的患者中有18例(48.6%)淋巴结呈阳性，19例(51.3%)淋巴结呈阴性。

28例HGSC患者的中位年龄为56岁，年龄从45岁到69岁不等。右侧卵巢肿瘤15例(53.5%)，左侧卵巢肿瘤13例(46.4%)。在肿瘤分期方面，超过一半的患者(15例，53.5%)为III期，其次是IV期(11例，39.2%)，最后是I-II期(2例，7.1%)。最后，我们的HGSC患者中18例(64.2%)淋巴结状态为阳性，10例(35.7%)淋巴结状态为阴性。

后BRCA1/2分子分析中，我们在不同性别的患者中检测到5个变异，在2个不同的患者中检测到2个拷贝数改变，均汇总在表中2．

c.66_67delAG (p.Glu23fs)，在两名不同患者的FFPE和血液样本中检测到变异。第一例患者为一名47岁的TNBC女性患者，患者FFPE和血液样本均为杂合子状态，深度评分分别为842和1150。第二例患者为52岁女性HGSC患者，在FFPE样本中检测到该变体为纯合子状态，深度评分为524，在基因组DNA中检测到该变体为杂合子状态，深度评分为1280。

c.2494_2495delCCinsTT (p.Pro832Leu)，在一名52岁TNBC患者的FFPE和血液样本中均检测到异型合子状态。在FFPE样本中，检测到该变体的深度分数为253，在基因组DNA中，检测到该变体的深度分数为856。

c.4412delG (p.Gly1471fs)，仅在56岁HGSC患者的FFPE样本中检测到变异。患者的FFPE样本测序显示该变体存在于杂合子状态，深度评分为318。

c.643delG (p.Glu215Lysfs)，在一名49岁TNBC患者的FFPE和血液样本中均检测到异型合子状态。该患者的测序结果显示，深度评分为289的FFPE样本和深度评分为993的基因组DNA样本中存在该变体。

c.7632_7633delCG (p.Val2545Phefs)，在一名58岁HGSC患者的FFPE样本中检测到变异。患者FFPE样本测序显示该变体以纯合子状态存在，深度评分为1984。在患者的基因组DNA中没有检测到这种变异。

在我们的研究中检测到的第一个拷贝数变化是拷贝数损失17q21.31(41249158-41,251,946)× 1英寸乳腺癌易感基因1基因。在一名52岁TNBC患者的FFPE和血液样本中检测到该CNV，置信评分分别为45和38。

在我们的研究中检测到的第二个拷贝数变化是一个拷贝数增益，13q13.1(32930545 - 32930,833)× 3英寸BRCA2基因。在一名55岁HGSC患者的FFPE样本中检测到该CNA, CNV置信度评分为36，并在另一次测序中得到证实，该测序也检测到CNV置信度为32。在患者的基因组DNA中没有检测到这种拷贝数增加。

我们进行了一项研究，分析了BRCA1/237例TNBC和28例HGSC患者的点变异和拷贝数改变。我们研究的主要目标是确定的患病率BRCA1/2两种恶性肿瘤中的体细胞变异和拷贝数改变，以及它们是否可以代表一个重要的分子标记。

在我们队列中65例成功测序的患者中，我们能够在6例不同的患者中识别出5点变异，其中3例在15例中乳腺癌易感基因1基因和两个BRCA2基因。关于副本编号的更改，我们发现一个副本编号丢失乳腺癌易感基因1基因和一个拷贝数加入BRCA2基因。基因筛选BRCA1/2使用这些患者基因组DNA的基因表明，其中5人拥有种系BRCA1/2基因改变。而三个则藏匿着一个躯体BRCA1/2基因改变(表3.）.

在我们的研究中报道的第一个变体是c.66_67delAG (p.Glu23fs)。在两个不同的患者中检测到，一个被诊断为TNBC，另一个被诊断为HGSC。根据Clinvar数据库，c.66_67delAG (p.Glu23fs)是一种致病性变异乳腺癌易感基因1由基因外显子2上腺嘌呤和鸟嘌呤两个核苷酸的缺失引起。在蛋白质水平上，这一缺失导致23号密码子上谷氨酸被缬氨酸取代，从而导致新阅读框16号位置的过早终止密码子[10］．据Struewing等人报道，这种致病性变异是德系犹太人的创始突变[11］．此外，在世界上许多其他人群中也有报道，在摩洛哥人群中也是如此[12，13］．

我们研究报告的第二个变体是c.2494_2495delCCinsTT (p.Pro832Leu)。在TNBC患者的基因组和FFPE DNA中都检测到它。这种变异是由于缺失两个胞嘧啶核苷酸和插入两个胸腺嘧啶核苷酸的外显子10乳腺癌易感基因1基因。在蛋白质水平上，这种变体通过亮氨酸取代脯氨酸氨基酸来表达。据我们所知，这种变异从未在任何数据库或研究中被报道过。

在我们的研究中报道的第三个变体是c.4412delG (p.Gly1471fs)。仅在一名HGSC患者的FFPE DNA中检测到。根据Clinvar数据库，该变异是一种致病性突变乳腺癌易感基因1染色体14外显子上鸟嘌呤核苷酸缺失而产生的基因乳腺癌易感基因1基因。在蛋白质水平上，它导致密码子1471上的一个甘氨酸氨基酸被丙氨酸取代，从而在新阅读框的第34位引入了一个过早的终止密码子。Winter等人曾报道过该变异为乳腺癌病例中的体细胞突变[14］．

在我们的研究中报告的第四个变体是c.643delG (p.Glu215Lys)。在TNBC患者的基因组和FFPE DNA中都检测到它。这种变异是由于鸟嘌呤核苷酸的缺失外显子8BRCA2基因。在蛋白质水平上，它导致谷氨酸被赖氨酸取代，从而在新阅读框的658位置产生一个过早的终止密码子。据我们所知，这种变异在任何数据库或研究中都没有报道。

我们研究报告的最后一个变体是c.7632_7633delCG。仅在一名HGSC患者的FFPE DNA中检测到。这种变异是由于删除了两个核苷酸;外显子16处的鸟嘌呤和胞嘧啶BRCA2基因。在蛋白质水平上，它导致2545位的缬氨酸氨基酸被苯丙氨酸取代，从而引发新阅读框2547位的过早终止密码子。据我们所知，这种变异以前从未被报道过。

关于拷贝号的变更，我们检测到一个拷贝号丢失乳腺癌易感基因1基因17q21.31(41249158-41,251,946)× 1，后者在患者的基因组和FFPE DNA中均被检测到。乳腺癌易感基因1基因外显子缺失在HBOC病例中已有报道[15，16］．此外，Pan等人报道乳腺癌易感基因1基因外显子7-8缺失与遗传性卵巢癌[17］．

我们还检测到一个拷贝数增益13q13.1(32930545-32,930,833)× 3英寸BRCA2基因。在患者的基因组DNA中没有检测到这种拷贝数的改变。BRCA2在HBOC病例中，外显子1-2拷贝数重复已被报道过[18］．然而，在任何数据库或研究中尚未报道过乳腺癌或卵巢癌中的外显子15体细胞复制。

在我们的研究中，从37例成功测序的TNBC患者中，我们没有在这两个基因中检测到任何体细胞点变异或拷贝数改变。我们的研究结果与世界各地的几项研究报告一致[19，20.然而，其他研究报告称，非家族性TNBC病例中存在体细胞点变异，患病率在3%至5%之间[21，22］．另一方面，从28例成功测序的HGSC患者中，我们检测到两种体细胞致病变异BRCA2基因(7%)和一个体细胞拷贝数也在增加BRCA2基因(3.5%)。我们的发现与世界上大多数研究一致BRCA1/2非家族性HGSC的体细胞致病变异，患病率为5%至8% [23，24，25］．然而，关于拷贝数改变，据我们所知，世界上大多数研究在非家族性TNBC和HGSC病例中进行了全面的CNA分析。不幸的是，我们找不到一项研究报告BRCA2HGSC的体细胞拷贝数增加[26，27］．

在我们的队列中，65例患者中有4例(6%)患有aBRCA1/2致病性生殖系改变，我们认为这些病例是遗传性乳腺癌和卵巢癌。尽管我们的选择标准旨在避免HBOC患者。世界各地的一些研究报告了不同的频率BRCA1/2未选择的TNBC和HGSC病例中的种系变异[28，29］．这四个病人都藏匿了BRCA1/2我们队列中的生殖细胞改变证实了他们的家族中没有癌症史。不幸的是，我们无法分析他们后代父母的基因图谱。因此，我们无法确认这些基因改变的遗传来源。就我们而言，它们可能是从头改变，这在Kim de Leeneer等人之前已经报道过。[30.］．此外，我们不能忽视的事实是，相当比例的乳腺癌和卵巢癌患者，具有遗传性BRCA1/2基因改变，没有明确的家族史，由于家庭结构小，男性在家庭中占主导地位，以及父系遗传[24］．这只能说明这一点BRCA1/2即使没有遗传性乳腺癌和卵巢癌的选择标准，也应考虑对TNBC和HGSC患者进行基因检测。

在本研究中，我们发现了三个以前从未报道过的点变异和一个拷贝数增益;c.2494_2495delCCinsTT (p.Pro832Leu)， c.643delG (p.Glu215Lys)， c.7632_7633delCG和13q13.1(32930545 - 329930,833)× 3。Oncomine变体类流水线已经将c.643delG (p.g glu215lys)和c.7632_7633delCG这两个变体分类为导致正常蛋白质功能丧失的截断型变体。由于c.2494_2495delCCinsTT (p.Pro832Leu)变种未被Oncomine变种分类管道分类，因此，为了确定该变种的致病性，我们使用了SIFT (TI = 0.36)、PolyPhen (PISC = 0.07)和GRANTHAM (R = 98)的硅晶分析结果。这些结果表明，该变异的意义仍然未知。关于拷贝数增益13q13.1(32930545 - 329930833)× 3，后者也没有被Oncomine管道分类。然而,由于BRCA2基因是一种肿瘤抑制基因。复制数量的增加并不被认为是癌症的驱动因素。28］．尽管如此，它们被认为是上调的基因改变，根据它们在基因中的位置，可能会导致蛋白质过度表达。BRCA2过表达在之前的研究中已经报道过，这些研究分析了乳腺癌肿瘤中的表达谱[31，32］．应进行更多的研究BRCA1/2拷贝数变异及其表型效应。

两种变体c.643delG (p.Glu215Lys)和c.66_67delAG (p.Glu23fs)。在患者的FFPE DNA中检测到纯合子状态。在患者基因组DNA中检测到的第二种变体也处于杂合子状态。后者是一种种系致病性变异，在患者的FFPE DNA中以纯合子状态存在，这一事实鼓励我们支持Knudson等人提出的双基因命中理论。[33］．然而，在我们的队列中，其他3例患者出现了种系BRCA1/2致病变异，他们没有表现出杂合子或复合突变的损失BRCA1/2FFPE DNA中的基因。遗传性乳腺癌和卵巢癌的基因癌变过程仍未完全确定，但许多科学研究表明，这些肿瘤需要其他肿瘤抑制基因或癌基因的额外体细胞突变[34，35］．

据我们所知，这是第一个进行分析的研究BRCA1/2摩洛哥TNBC和HGSC患者FFPE DNA的点变异和拷贝数改变。有效地，我们能够报告HGSC患者的两个体细胞点变异和一个体细胞拷贝数增加。此外，我们能够确定三种种系点变异，据我们所知，以前从未报道过。这项研究提供了临床重要的信息BRCA1/2非家族性TNBC和HGSC病例的遗传筛查。尽管如此，我们队列中的病例数量较少，并且缺乏关于这两个基因甲基化谱的信息，这是我们研究的两个局限性，应该在未来致力于摩洛哥的其他研究中被超越BRCA1/2乳腺癌和卵巢癌的基因。

根据本研究发现的结果，a的可能性BRCA1/2HGSC的体细胞致病性突变为7%。而在TNBC的情况下，点突变和CNA似乎是一个非常罕见的遗传事件。然而，世界范围内的许多研究表明了体细胞的存在BRCA1/2TNBC的基因改变。此外，在我们的队列中，6%的TNBC/HGSC病例存在种系遗传改变BRCA1/2这些基因表明相当比例的非家族性乳腺癌和卵巢癌可能含有乳腺癌BRCA致病生殖系改变。随着Anti-PARP治疗的出现，定义了其存在BRCA1/2非家族性BC和OC的基因意义已成为必然。因此，应该进行更多的研究来确定这两个基因在这些亚型癌症中的影响强度。

在当前研究中分析的数据集和材料需求列表将在合理的要求下从通讯作者那里获得。

TNBC:

三阴性乳腺癌

HGSC:

高度上皮性卵巢癌

公元前:

乳腺癌

机汇:

卵巢癌

CNV:

拷贝数变化

FFPE:

Formalin-fixed石蜡包埋

PARP:

聚(adp -核糖)聚合酶

双边带:

双链断裂

嗯:

同源重组修复

HRD:

同源重组缺陷

中央社:

副本编号更改

her - 2:

人表皮生长因子受体2

的PGM:

个人基因组机

我们感谢卡萨布兰卡Anoual实验室和丹吉尔科学与技术学院生物医学基因组学和肿瘤遗传学研究实验室的支持。

作者没有任何支持或资金报告。

作者及隶属关系

1. 摩洛哥得土安Abdelmalek Essaadi大学丹吉尔科学与技术学院生物医学基因组学和肿瘤遗传学研究实验室

   Fatima Zahra El Ansari, Joaira Bakkach, Naima Ghailani Nourouti, Amina Barakat和Mohcine Bennani Mechita

2. 分子生物学，ANOUAL实验室，卡萨布兰卡，摩洛哥

   Fatima Zahra El Ansari, Farah Jouali, Rim Fekkak和Jamal Fekkak

贡献

FZE为研究的构想、设计、稿件的撰写、数据的获取和分析做出了贡献。FJ参与了研究的设计并帮助进行了数据分析。RF在研究概念和数据分析方面做出了贡献。BJ、GN和AB参与了研究设计和数据解释，MB和JF参与了研究设计、数据解释和批准分析的文献数据，所有作者阅读并批准最终手稿。

相应的作者

对应到法蒂玛·扎赫拉·埃尔安萨里．

伦理批准并同意参与

这项研究得到了哈桑二世大学研究伦理委员会的批准。所有参与者都提交了书面知情同意书以参加研究。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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