生殖系缺失EPCAM基因作为Lynch综合征的病因-文献综述

Lynch综合征(临床上称为HNPCC -遗传性非息肉病性结直肠癌)是一种常见的常染色体显性遗传的癌症易感性综合征，主要由影响DNA错配修复基因的各种种系改变引起一种和MSH2。遗传这种易感性的患者易患结直肠、子宫内膜和其他结肠外肿瘤。最近的研究表明，基因的最后几个外显子的种系缺失EPCAM基因与林奇综合征的病因有关。这种结构突变导致邻近基因随后的表观遗传沉默，MSH2导致林奇综合症。的最后几个外显子的缺失EPCAM构成了一类与HNPCC相关的突变。在世界范围内，一些调查人员报告了一些家庭EPCAM3 'end删除。大肠直肠癌的风险EPCAM缺失的情况与患者的情况相当MSH2突变携带者，并与高表达水平的EPCAM在结直肠癌干细胞中。子宫内膜癌的风险也较低。到目前为止，Lynch综合征的标准诊断测试包括免疫组织化学和错配修复基因微卫星不稳定性测试等分析。的鉴定EPCAM删除或更多EPCAM-MSH2缺失应该包括在常规突变筛查中，因为这对癌症易感性有影响。

Lynch综合征;HNPCC(遗传性非息肉性结直肠癌)是最常见的癌症易感综合征之一，约占所有结肠癌病例的1-4% [1]。它的特点是结直肠癌(CRC)的早期发病和几种结外恶性肿瘤(特别是子宫内膜癌)发生的风险增加[2]。在最大的已发表的系列研究中，1%的结直肠病例熟悉LS [3.]。HNPCC是由错配修复(MMR)系统基因的种系突变失活引起的MSH2，一种，MSH6，但也PMS2） [4]。根据NCBI数据库的数据一种和MSH2突变约占Lynch综合征相关突变的90%;MHS6占7-10%PMS2在不到5%的变异中发现。根据最近的研究，还有另一种基因对Lynch综合征有影响(在荷兰和德国人群中大约有1-3%的LS患者)，这是EPCAM基因(图1） [5]。

Lynch综合征相关肿瘤通常以DNA错配修复缺陷为特征，由第二体细胞事件引起，该事件使剩余的功能性错配修复基因等位基因失活[6，7]。由于缺乏错配修复，在短重复序列中积累的继发性突变促进了肿瘤的发生，这种表型称为“高水平微卫星不稳定性”(high- msi)。

换句话说，MMR基因在一个等位基因上的缺陷会导致进一步突变的易感性，这些突变可能会影响第二个等位基因，导致细胞缺乏错配修复功能。这导致此类肿瘤中编码和非编码微卫星突变的积累:即所谓的“微卫星不稳定性”(microsatellite instability, MSI)，这是95%以上ls相关crc的一个特征[8]，除了突变错配修复基因的表达缺失外[9]。基因突变的携带者一种MSH2或MSH6患结直肠癌的累积风险为30-80% 70岁以下女性患子宫内膜癌的累积风险为27-71% [2]。主要临床特征为发病年龄早、多发肿瘤的发生。

LS的诊断主要有两种方法。其中之一是，在所有就诊的病人中，都要关注足够的家族史。修订后的Bethesda指南可能是选择结直肠癌患者进行进一步分子检测的最常用标准[10，11)(表1）.另一种方法是通过肿瘤组织中的高水平微卫星不稳定性或免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)对所有结直肠癌患者进行MMR功能丧失的系统检测。免疫组织化学的优势还在于可以预测哪些错配修复基因可能受到种系突变的影响[10]。在我们的国际遗传癌症中心，根据Lynch综合征的典型临床特征或标准和谱系将患者分类为Lynch综合征，Kladny和Lubinski [12]。一个家谱的例子，一个家庭有明确的HNPCC和EPCAM载体如图所示2。

在一些Lynch综合征患者中，MMR基因突变搜索失败。研究人员对这一群体特别感兴趣，他们试图找到导致这种疾病的遗传因素。在一些LS患者中，已经证明MMR基因甲基化导致疾病发生[13- - - - - -16]。这方面的一些证据来自研究一种基因是非种系携带者的HNPCC患者种系组织中甲基化的目标一种突变(17]。此外，可遗传的种系增殖MSH2在一些MMR种系突变阴性的LS家族中也有报道[18]。

一种新的失活机制MSH2因此，基因被预测到了。在多例疑似LS的患者中，在MMR基因中未发现种系突变，发现了杂合的种系缺失，包括位于最后两个外显子的聚腺苷化位点[8，9的;EPCAM基因(omim# 185535)，以前被称为TACSTD1） [19]。这种缺失破坏了dna的3 '端EPCAM基因，导致突变基因的转录解读EPCAM邻近基因的等位基因和表观遗传失活和沉默MSH2。MSH2位于?下游17 KB处EPCAM在2号染色体上，并导致Lynch综合征[20.]。这种表观遗传失活仅限于细胞表达EPCAM因此，患者携带EPCAM删除显示马赛克图案MSH2失活，与基因突变的携带者相比MSH2，可能导致肿瘤发生或频谱的差异[20.]。什么是有趣、高的表达EPCAM在结直肠癌中，干细胞回答了为什么携带an的携带者EPCAM3 '端缺失的人患结肠癌的风险大大增加。

Kempers和同事(2011)在他们的研究中建立了不同的癌症风险与EPCAM删除，具体取决于删除是否仅影响EPCAM或者两者都有EPCAM以及它的邻近基因MSH2（EPCAM-MSH2）.然后将这些风险与MMR基因突变的Lynch综合征携带者的风险进行比较。这是第一个描述累积癌症风险和癌症概况的研究EPCAM删除载体[21]。他们报告说，子宫内膜癌的风险较低EPCAM与MMR基因突变相比在194个人中EPCAM在他们的研究中包括突变，16例发展为结肠癌或子宫内膜癌以外的癌症[十二指肠:n=3;胰腺:n=4;是最常见的。

Kloor等人(2011)最近的一项有趣的研究表明，伴随的缺乏EPCAM和MSH2蛋白质表达是癌症的一个高度特异性特征EPCAM删除载体，建议EPCAM免疫组织化学作为鉴别Lynch综合征患者的潜在分析工具EPCAM种系缺失[22]。然而，这种方法有一个问题，因为EPCAM在某些癌症中，蛋白质表达得以保留EPCAM突变携带者。调查人员尚未确定两者之间的关系EPCAM肿瘤蛋白表达状态与an定位EPCAM种系缺失[22]。这就是为什么Huth等人(2012)假设第二次身体撞击(导致MSH2失活)决定EPCAM在肿瘤细胞中的表达。(他们分析了4个癌和2个腺瘤EPCAM删除载体EPCAM蛋白表达和等位基因缺失状态EPCAM基因(7]。

的EPCAM基因

的EPCAM上皮细胞粘附分子;选择的名字TACSTD1-肿瘤相关钙信号传感器1 (OMIM#185535)编码一种癌相关抗原，该抗原是一个家族的糖基化成员，该家族包括至少两种I型膜蛋白[23]。它位于2号染色体短臂上的第21位。更准确地说，从第2号染色体上的47,596,286碱基对到47,614,166碱基对。

在健康组织中EPCAM位于基底外侧膜，但在癌组织中，这种蛋白均匀分布在细胞表面。EPCAM不仅参与介导上皮特异性细胞间粘附，还参与细胞内信号转导、迁移、增殖和分化。的细胞外部分EPCAM包含表皮生长因子样结构域和推测的甲状腺球蛋白结构域。激活EPCAM信号是通过膜内蛋白水解介导的，通过这种水解，胞外结构域脱落，胞内结构域(EpICD)释放到细胞质中(图2)3.）.在这里，它成为一个大型核复合体的一部分，该复合体包含转录调节因子β-连环蛋白和左链蛋白，它们都是dna的组成部分wnt信号通路[2]。

因此，据推测EPCAM在正常上皮上是隔离的，因此抗体比EPCAM在癌组织中，它均匀地分布在癌细胞表面[23]。

抗原EPCAM目前正被用作人类癌症免疫治疗的靶点。

涉及转录终止信号的缺失EPCAM在1%到2.8%的林奇综合症家庭中是致病的。其他EPCAM不影响转录终止信号的改变导致常染色体隐性先天性簇状肠病[24]。

的表观遗传沉默MSH2

EPCAM缺失的原因MSH2基因沉默的机制被称为启动子超甲基化。附加的甲基连着MSH2启动子的表达减少MSH2基因，这意味着上皮细胞中产生的蛋白质更少。MSH2蛋白在修复DNA错误中起着至关重要的作用，因此这种蛋白的缺失会阻碍DNA的正常修复，并在细胞继续分裂的过程中导致错误的积累。这些错误会导致细胞生长失控，增加患癌症的风险。缺乏EPCAM免疫染色在msh2阴性的crc中表明EPCAM基因改变，因此Musulen Eva和Blanco Ignacio推荐(2013)的表现EPCAMMLPA(多重连接依赖探针扩增)分析前的免疫组化[4]。

Van der Klift和他的团队(2005)首次报道了包含3 '末端的缺失EPCAM哪一个不影响开放阅读的框架MSH2，在一组怀疑患有ls的病人中[25]。5年后3 '端缺失关系EPCAM和失活MSH2由两组独立报道。Kovacs等人(2009)发现了四个不同的缺失，包括基因的最后几个外显子EPCAM在有一个或多个肿瘤表现出微卫星不稳定性和MSH2蛋白缺失的5个家族中[18]。与此同时，Ligtenberg et al.(2009)也发现了类似的现象EPCAM在4个荷兰结直肠癌家族中发现了3 '端缺失，表现出高度的微卫星不稳定性和MSH2蛋白的缺失，但其中没有突变MSH2被发现。此外，在这些家庭中，缺失与发生的共分离MSH2-缺乏的肿瘤，此外，被发现导致转录穿透进入MSH2轨迹(19]。更重要的是，Ligtenberg的研究小组(2012)注意到，这种转录解读诱导了基因的单等位基因超甲基化MSH2启动子存在于与3 '端相同的等位基因上EPCAM删除。序列分析确定了缺失断点，缺失4909 bp，从859-1462_*1999delEPCAM互补脱氧核糖核酸。单倍型分析表明，这种突变起源于一个共同的创始人。所有来自这些家族的6个高msi肿瘤都显示了甲基化MSH2启动子通过甲基化特异性PCR和随后的亚硫酸盐测序(表2）.这些观察结果令人信服地表明，3 '末端的缺失EPCAM会导致MSH2因此，应将其视为Lynch综合征的新病因[2]。

Ligtenberg et al.(2009)也分析了Chan et al.(2006)报告的家族遗传MSH2启动子甲基化并鉴定出22.8 KB的杂合缺失(EPCAMcDNA, 555+894_+14194del)与疾病分离[19]。该缺失从基因的内含子5开始延伸EPCAM基因上游约2.4 KBMSH2的3 '端EPCAM然后离开MSH2启动子完好无损。同样的作者在另一个中国家庭中发现了同样的突变，但没有证据表明存在创始突变。来自受影响个体的组织样本的RT-PCR和甲基化特异性PCR等分析表明MSH2被限制为EPCAM-表达细胞(表12）.

Huth等人(2012)报道，在Lynch综合征患者的许多肿瘤中，EPCAM表达缺失，但不是全部EPCAM种系缺失[7]。EPCAM表达的差异与细胞的定位无关EPCAM生殖系删除。因此，他们假设有一种类型的第二次身体撞击，导致MSH2在肿瘤发生过程中失活，决定了EPCAM在肿瘤细胞中的表达。在6个肿瘤中的4个中，研究人员检测到EPCAM表达缺乏，并伴有影响肿瘤的双等位基因缺失EPCAM基因。相比之下，单等位基因的保留EPCAMEPCAM基因在其余2个肿瘤中表达。这些结果表明EPCAM在肿瘤中的表达EPCAM删除载体依赖于第二个失活的体细胞命中的定位MSH2。这些数据表明，EPCAM蛋白在种系突变和第二次体细胞攻击的肿瘤中缺乏表达。它们也显示出杂合性EPCAM种系缺失并不一定与肿瘤组织中EPCAM表达的缺失相关。检测引起体细胞突变的事件MSH2其中一个的失活EPCAM阳性肿瘤，解释了为什么有些肿瘤来自EPCAM删除载体显示丢失MSH2，但保留了EPCAM表达[7]。

的发生率EPCAM缺失似乎在不同人群中有所不同，并且被发现代表了至少1-3%的已解释的林奇综合征家族。详细分析EPCAM删除显示了他们的变化范围以及他们的运算器-重复介导的起源可能是这些重排的机制[5]。实际上,所有EPCAM不同作者特征的删除断点位于重复运算器元素(表2）.

运算器元件是一个只在灵长类动物中发现的短穿插核元件(sin)家族，占人类基因组的10.5% [26]。这些是可移动的反转录转座元件，也包含重组动机，导致它们具有重组活性。然而，它们的移动性和对重组的易感性可能受到这些富含cpg元素的宿主防御性甲基化的抑制[26]。通过不平等形成的缺失运算器-介导的同源重组涉及两个亲本之间共享序列相同区域的交叉运算器在相同的方向上位于顺式的元件，在交换过程中失去了干预基因组序列的环。这些删节可通过完全的签字束来识别运算器衍生的序列身份，重叠或邻近的缺失断点，这样的缺失连接不能映射到一个精确的核苷酸。Perez-Cabornero及其同事(2011)将每个缺失断点映射到融合的短段内运算器与其亲本具有密切同源性的序列运算器元素(27]。这是迄今为止第一次这样的发现，并促使人们重新审视运算器Lynch综合征的病因因素。

普遍存在的EPCAM删除

在世界范围内,EPCAM在来自不同地理起源的不同人群中发现了缺失[18，28)(表2）.研究发现，这些人群的患病率有所不同，部分原因是存在各种始祖突变[5]，并占到全球的10%MSH2灭活突变。所有林奇综合征相关肿瘤来自EPCAM可用于测试的缺失载体显示出高甲基化MSH2启动子(13]。对这些缺失的断点的详细分析表明，它们主要来源于运算器重复介导的重组事件[2]。多种不同的缺失可以反映在不同的重组事件中，这是由大量的运算器重复序列分布在这个位点上[9]。

Grandval等人记录了这种情况。[29),即EPCAM7个病人中有3个基因缺失新创突变，这可能反映了相对较高的运算器该位点重复介导的重组频率[2]。

我们未发表的55例LS患者的研究数据表明，基因的8和9个外显子缺失EPCAM7%的LS病例没有MMR突变。

肿瘤谱EPCAM删除

无论细胞类型如何，影响基因开放阅读框的结构重排通常会导致这些基因的结构失活。相反，在EPCAM3 '端缺失载体MSH2失活是细胞类型特异性的，因为表观遗传沉默MSH2局限于细胞中EPCAM位点是活跃的，并且发生转录通读。这样做的结果是，携带者EPCAM删除显示马赛克图案MSH2失活。这种现象涉及到其中一个的失活EPCAM等位基因可能导致不同于直接影响种系突变的肿瘤谱MSH2［2]。

一些研究人员比较了基因内携带者的癌症风险MSH2突变，一个组合EPCAM-MSH2的3 '端缺失EPCAM。结直肠癌的风险EPCAM从诊断时的平均年龄和70岁时的累积风险来看，突变携带者与EPCAM-MSH2或MSH2突变携带者。相比之下，70岁时患子宫内膜癌的累积风险在3岁时显著降低EPCAM删除载体比合并EPCAM-MSH2删除载体和MSH2突变携带者(表)3.）.重要的是，肿瘤风险的比较EPCAM和EPCAM-MSH2缺失携带者表明子宫内膜癌风险的差异与基因的马赛克失活有关MSH2而不是结构性的损失EPCAM［20.]。在其他几项研究中也观察到子宫内膜肿瘤的发病率相对较低[30.]。

如前所述，平均发病年龄、结直肠癌发病风险与肿瘤表型有关EPCAM缺失携带者与携带典型错配修复基因突变的人相当一种或MSH2，而患子宫内膜癌的累积风险则低得多[5，20.]。在EPCAM缺失基因携带者患子宫内膜癌的风险相对较低，而子宫内膜癌是错配修复突变携带者中第二常见的林奇综合征相关恶性肿瘤。EPCAM基因缺失携带者可能比基因缺失携带者更容易被识别MSH6突变，其结直肠癌风险随发病年龄的增加而降低[2]。

在Grandval et al.(2012)的队列中，EPCAM缺失基因携带者仅发生消化道肿瘤。他们患结肠直肠癌的风险特别高，29名年龄超过30岁的缺失基因携带者中只有2人未受影响[29]。

EPCAM创始人删除

在MMR基因中已经发现了许多创始突变，但只有一种基因影响EPCAM基因(19，31]。这个4.9 kbEPCAM迄今为止，Ligtenberg等人在7个荷兰家族中观察到的创始人缺失，在另外10个荷兰家族中有9个发现了创始人缺失，但在其他地理来源的家族中没有发现创始人缺失，从而证实了创始人缺失的性质(表1)2） [5]。2013年，穆尔和皮内达发现了两个EPCAM缺失:c.858+2568 *4596del(在三个家族中发现)和c.858+2488 *7469del(在两个家族中发现);所有五个都是没有血缘关系的西班牙LS家庭)。此外，他们描述了EPCAMC.858 +2568_*4596del突变为首次报道EPCAM西班牙的创始人突变(表1)2） [32]。

此外，六。EPCAM在多个原产于德国的家族中发现了缺失(表中缺失2和14)2，n= 2和n= 4)，瑞士(表中删除3)2，n= 2)，美国(表中删除6)2，n= 2)或来自多个来源(表中删除5和10)2，n= 3) [5]。

诊断的EPCAM3 '端缺失载体

基因3′端缺失携带者的突变筛选EPCAM是基于匹配阿姆斯特丹或Bethesda标准，并与肿瘤中MSI表型或MMR蛋白表达缺失有关。

免疫组织化学分析MMR蛋白表达是Lynch综合征诊断的标志，但它不能区分EPCAM删除载体和MSH2突变携带者[33]。EPCAM表达对种系和体细胞改变的依赖性解释了其中的原因EPCAM免疫组织化学可以在肿瘤的一个亚群中产生不明显的结果EPCAM删除载体，即如果是第二体细胞MSH2取消激活命中不会影响EPCAM基因(7]。此外，Huth和他的团队报告了EPCAM蛋白在结直肠腺瘤中的表达缺失，这表明EPCAM免疫组织化学可检测EPCAM已经在癌前阶段的缺失[7]。

生殖系重排EPCAM基因和MSH2通过使用包含特定区域探针的多重连接依赖探针扩增(MLPA)分析来检测启动子甲基化[9，19，32]。Huth et al.(2012)在MLPA分析后发现，双等位基因缺失会影响基因EPCAM6个肿瘤中有4个的基因。在剩下的两个肿瘤中，没有双等位基因EPCAM观察到缺失，并获得等位基因谱EPCAM从肿瘤组织中分离的DNA和匹配的血液样本中的基因区域是相同的。所有肿瘤均显示双等位基因缺失EPCAM基因区EPCAM蛋白表达均为阴性，而EPCAM蛋白在保留1个正常的肿瘤中均有表达EPCAM等位基因。这些科学家还证明了MLPA技术适用于检测石蜡包埋肿瘤组织中分离的DNA的杂合和纯合缺失(例如当没有血液可用时)[7]。

作为检测指定删除的附加方法EPCAMLigtenberg和Kuiper(2009)采用了远程PCR和实时定量RT-PCR。在荷兰家族中，对于跨缺失的长距离PCR，使用TAKARA PCR试剂盒，在缺失的两侧使用引物。此外，他们通过直接测序确定了缺失，使用正向引物和内部反向引物组合。对于中国家庭，他们进行了多次远程pcr，结果产生了一个异常扩增子，表明存在大的缺失突变[19]。为了检测融合转录本，采用直接RT-PCR反应或巢式RT-PCR反应[19，21]。

最近，来自美国的Pritchard和他的团队(2012)发布了一种名为“ColoSeq”的全面且具有成本效益的测试方法，该方法使用基于溶液的靶向捕获和下一代测序技术，可以检测Lynch和息肉病综合征基因中的所有类型的突变[34]。由于这种技术，他们正确地鉴定了28/28(100%)的致病突变Mlh1, msh2, msh6, pms2, epcam, apc和MUTYH包括单核苷酸变异(snv)、小的插入和缺失以及大拷贝数变异。这些科学家专注于确定杂合子变异检测的敏感性，因为Lynch综合征和息肉病综合征的致病突变几乎总是杂合子的，除了MUTYH基因。独立运行间突变检测的重复性为100% [34]。Coloseq试验显示，对于所有大的缺失和重复，至少具有外显子水平的分辨率，这与MLPA等传统突变分析方法的分辨率相当，甚至更好，MLPA中无法确定确切的断点，因为它们通常存在于dna中运算器或其他重复的DNA元素[34]。

根据以前的世界范围的结果，有一个强烈的建议，实施EPCAM在疑似Lynch综合征家族的常规诊断中应考虑缺失定位。一些研究表明EPCAM在msh2阴性肿瘤患者(来自免疫组化结果)中，高达30%的缺失是Lynch综合征的病因，而在MMR基因无突变的LS患者中，这一比例约为20% [18，22]。

这强调了……的重要性EPCAMLynch综合征的缺失，因为它是比突变更常见的LS的原因PMS2或MSH6［33]。

体细胞缺失的频繁发生影响EPCAM基因是治疗肿瘤的第二招EPCAM缺失携带者表明，Lynch综合征中失活错配修复基因的体细胞事件的定位不是随机的，而是与潜在的种系突变有关[7]。

总之,EPCAM3′端缺失是Lynch综合征的复发性原因，应在常规Lynch综合征诊断中进行检测。

该研究由波兰科学和高等教育部(MNiSW)资助，项目编号MB-158-77/13。

作者及单位

1. 波美拉尼亚医科大学国际遗传癌症中心遗传病理学系，Połabska 4,70 -115，波兰什切琴

   Katarzyna Tutlewska, Jan Lubinski & Grzegorz Kurzawski

相应的作者

对应到Katarzyna Tutlewska。

相互竞争的利益

作者声明他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

概念与设计:KT;起草稿件:KT;重要知识内容的批判性修订:GK;最终批准:KT、GK、JL。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇基于知识共享署名许可(http://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用原创作品。

转载及权限