粪便钙保护蛋白作为COVID-19患者缺氧肠道损伤生物标志物的作用

背景

2019冠状病毒病(COVID-19)的胃肠道表现似乎很明显。粪便钙保护蛋白是COVID-19相关胃肠道炎症的一种有前景的生物标志物;然而，它在COVID-19严重程度方面的作用仍然有限。我们进行了一项研究，分析COVID-19的严重程度与低氧性肠道损伤之间的关系。

方法

根据PaO2/FiO2 (P/F)比值评估44例住院COVID-19肺炎患者的严重程度。从血液样本中测量炎症标志物，从粪便样本中获得粪便钙保护蛋白。

结果

本研究涉及的COVID-19患者(n = 44)的粪便钙保护蛋白中位数水平随着低氧血症的严重程度而显著升高，如非急性呼吸窘迫综合征(ARDS)组21.4µg/g(5.2-120.9)，轻度ARDS 54.30µg/g(5.2-1393.7)，中度ARDS 169.6µg/g(43.4-640.5)，重度ARDS 451.6µg/g(364.5-538.6)。我们还发现，根据ARDS的严重程度，粪便钙保护蛋白水平存在显著差异(P< 0.001)，尽管患者被分为ARDS组和非ARDS组(P< 0.001)。此外，我们发现P/F比与粪便钙保护蛋白水平之间存在很强的负相关(r=−0.697，P< 0.001)。

结论

我们的研究结果支持粪便钙保护蛋白作为COVID-19肠道炎症的生物标志物的潜在作用，这是缺氧肠道损伤的结果，并且P/F比降低。

2019冠状病毒病(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的传染病。它于2020年3月被宣布为大流行，目前仍是一个全球卫生问题[1，2，3.］．COVID-19表现出广泛的临床症状，从无症状病程到严重肺炎，可导致以PaO2/FiO2 (P/F)比值降低为特征的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。除呼吸道疾病外，COVID-19还可引起肺外症状，包括胃肠道症状[4，5，6，7，8］．厌食、恶心、呕吐和腹痛等胃肠道症状常见于约20-50%的COVID-19病例;然而，即使没有胃肠道症状，肠道损伤也可能发生[9，10，11，12，13］．

COVID-19胃肠道损伤的病因可分为原发性和继发性。原发性损伤是由SARS-CoV-2直接感染胃肠道系统引起的，而继发性损伤则由几种情况引起[14，15，16，17，18］．损伤可能与低氧血症有关，表现为P/F比值降低，导致低氧性肠道损伤。免疫反应失调也可能导致损伤，也称为细胞因子释放综合征，可引起全身炎症[19，20.，21，22］．SARS-CoV-2感染还会导致高凝和微循环功能障碍，从而导致包括胃肠道系统在内的组织缺血[23，24］．另一方面，胃肠道的炎症过程也可能通过一种称为肠道串扰的机制使正在进行的全身炎症恶化[25］．在内镜手术过程中可能会观察到这种炎症，由于安全问题，内镜手术在COVID-19大流行期间的表现受到限制[26］．

粪便钙保护蛋白可在粪便中稳定5-7天，是一种敏感的、非侵入性的肠道炎症生物标志物[27，28］．粪便钙保护蛋白是一种钙结合蛋白，主要是中性粒细胞特异性蛋白，在急性炎症期间，由于中性粒细胞解体级联而释放到细胞外环境中。有趣的是，粪便钙保护蛋白(calprotectin)的浓度与肠黏膜中性粒细胞的浓度成正比，钙保护蛋白占中性粒细胞细胞质蛋白的60%，肠黏膜缺血严重影响其功能[26，29，30.］．因此，粪便钙保护蛋白是COVID-19患者缺氧肠道损伤的潜在生物标志物。

利用粪便钙保护蛋白水平评估COVID-19患者肠道炎症的研究仍然有限。只有六项研究和一项荟萃分析评估了受试者[23，31，32，33，34，35，36］．在这些研究中，只有三项研究了COVID-19的严重程度与肠道炎症之间的关系。这三项研究使用了不同的疾病严重程度定义，结果相互矛盾[31，34，35］．意大利的一项研究表明，粪便钙保护蛋白水平升高与以肺炎为特征的COVID-19疾病严重程度之间存在显著相关性[34］．伊朗的另一项研究也表明，粪便钙保护蛋白水平升高可能是严重疾病的一个特征，疾病严重程度与粪便钙保护蛋白水平之间存在显著的正相关[35］．相比之下，在美国启动的COVID-19研究中的第一个粪便钙保护蛋白表明，粪便钙保护蛋白浓度与COVID-19疾病严重程度之间没有相关性[31］．

因此，我们使用P/F比值分析了基于低氧血症程度的COVID-19疾病严重程度与由低氧性肠道损伤引起的肠道炎症(由粪便钙保护蛋白水平决定)之间的相关性。我们将P/F比值作为COVID-19疾病严重程度的衡量标准，并考虑患者给予的氧分数，以标准化补充氧和不补充氧患者的低氧血症程度。此外，我们还观察了印度尼西亚人群中COVID-19患者的胃肠道表现、一般症状和炎症标志物的特征。

研究设计和参与者

这是一项采用横断面方法的观察分析研究。我们分析了44例COVID-19确诊患者的血气分析的P/F比和粪便钙保护蛋白，这些粪便样本是基于具有提示性的COVID-19放射表现的鼻咽SARS-CoV-2 PCR拭子阳性[2，37］．我们纳入了2020年10月至12月印度尼西亚泗水Soetomo博士教学医院符合纳入标准的所有非icu COVID-19隔离病房的住院患者。排除标准包括胃肠道恶性肿瘤、炎症性肠病、肝硬化和终末期肾病患者。所有患者均获得书面知情同意，研究方案由印度尼西亚泗水Soetomo博士教学医院伦理委员会批准(0065/KEPK/IX/2020)。我们声明，所有有助于本研究的程序都符合相关国家和机构人体实验委员会的道德标准以及1975年的赫尔辛基宣言(2008年和2013年修订)。

COVID-19疾病严重程度

我们从血气分析中获得P/F比值，血气分析是在收集用于粪便钙保护蛋白检测的粪便样本后24小时内进行的。动脉样本的血气在15分钟内送到实验室或保存在0-4^OC.然后使用GEM Premier®分析样品。我们使用P/F比值来表达COVID-19疾病的严重程度，并对有和没有补充氧气的受试者的低氧血症程度进行标准化，从而表示COVID-19的严重程度[38，39］．我们只纳入了放射学表现提示COVID-19的受试者，以尽量减少因COVID-19 ARDS以外的病因导致P/F比降低的可能性。P/F比(mmHg)根据ARDS柏林标准进行分类;轻度ARDS定义为阈值为200 < P/F≤300，中度ARDS定义为100 < P/F≤200，重度ARDS定义为100 [40］．

粪便calprotectin

将粪便样本收集到最少5 g的清洁容器中，登记，并在2-8°C保存48小时或在−20°C保存48小时以上，然后用于粪便钙保护蛋白测定。从每个样本中提取15毫克粪便，并使用PhiCal进行分析^©钙保护素酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，根据制造商的建议(Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, D-64625 Bensheim)。钙保护蛋白样品在粪便中保持稳定5-7天，参考正常值< 50 μg/g [27，28］．

额外的实验室测量

所有其他实验室参数均在采集粪便样本后24小时内获得，并作为常规实验室分析的一部分在医院实验室确定。使用Sysmex 1000®分析全血计数样本，如白细胞(/µL)、凝血细胞(/µL)和中性粒细胞与淋巴细胞比率(NLR)。采用ADVIA Centaur Ferritin®双位点夹心免疫法分析铁蛋白(ng/mL)。从血清样本中获得d -二聚体(ng/mL)，使用Sysmex CS-2500®浊度免疫法进行分析。c反应蛋白(CRP)使用Dimension®临床化学系统采用颗粒增强浊度免疫分析法进行分析，并定义为mg/L。

统计分析

使用IBM SPSS®统计版本25 (IBM Corp.，美国)进行统计分析。人口统计学数据和临床特征以分类数据类型(名义数据和序数数据)的频率和百分比进行描述。连续数据(区间和比值)以均值±标准差(SD)和中位数(最小值-最大值)表示。采用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验。自变量为P/F比，以序数和比率数据表示。因变量为粪便钙保护素水平，以名义数据和比例数据表示。独立t检验用于比较正态分布数据，而Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis检验用于分析非正态数据。本研究中变量之间的关联分析采用Spearman相关的相关数值分析。P-value < 0.05为可信区间(CI)为95%，差异有统计学意义。

患者人口学和临床特征

在本研究中，44例具有影像学提示的COVID-19住院患者中，26例粪便钙保护素阴性(< 50µg/g)， 18例粪便钙保护素阳性(≥50µg/g)。如表所示1，粪便钙保护蛋白阳性(fc阳性)组与阴性(fc阴性)组的性别差异无统计学意义(P= 0.241)。fc阳性组的平均年龄略高于fc阴性组(49.9±14.8岁vs 47.8±13.9岁);然而，两组在年龄上并无显著差异(P= 0.573)。大多数患者(59.1%)有合并症，糖尿病是所有组(总人口、fc阳性组和fc阴性组)的主要合并症。

食欲下降是本研究中最常见的胃肠道症状(63.6%，28/44)。有趣的是，fc阳性组胃肠道症状的所有特征的频率都高于fc阴性组，两组之间在恶心方面有显著的统计学差异(P< 0.001)，呕吐(P< 0.001)，腹泻(P< 0.001)。咳嗽是所有组的主要主诉，其次是发烧、呼吸困难和嗅觉丧失。在fc阳性组和fc阴性组之间，任何测量的全身炎症标志物(NLR，铁蛋白，CRP和d -二聚体)均未发现显著差异。

粪便钙保护蛋白水平升高与低氧血症严重程度相关

重要的是，大多数受试者被发现患有ARDS(33.3%轻度，6/18;50%中度，9/18;与fc阴性组相比，fc阳性组11.11%(2/18)严重，其中仅19.23% (n = 5/26)诊断为ARDS(表2)2)．fc阳性组的平均P/F比也明显低于fc阴性组(190.83±82.41 mmHg vs 396.19±100.45 mmHg)，如图所示。1．

对COVID-19患者粪便钙保护素水平按低氧血症程度分层分析显示，中位粪便钙保护素水平随ARDS严重程度升高而升高，非ARDS组为21.35µg/g(5.20-120.90)，轻度ARDS为54.30µg/g(5.20-1393.70)，中度ARDS为169.55µg/g(43.40-640.50)，重度ARDS为451.55µg/g(364.50-538.60)。Kruskal-Wallis分析也显示粪便钙保护素水平按低氧血症严重程度分层有统计学意义(P< 0.001)。我们进一步分析了组间的两两差异，发现单个ARDS组相对于非ARDS组有显著差异，如图所示。2．

考虑到本研究假设基于低氧血症程度的疾病严重程度可能与粪便钙保护蛋白测定的肠道炎症有关，我们建立了相关性分析。斯皮尔曼相关，如图所示。3.，结果显示P/F比与粪便钙保护蛋白水平呈强负相关(r= -0.697,P< 0.001)。这一结果揭示了P/F比与粪便钙保护素之间的关系，从而得出了粪便钙保护素水平升高所表现的肠道炎症恶化与P/F比降低所表现的低氧血症恶化的统计学结论。

据我们所知，这是第一个调查COVID-19中P/F比与粪便钙保护蛋白之间关系的研究。COVID-19患者粪便钙保护蛋白水平显著升高，低氧血症恶化。不同组ARDS患者粪便钙保护蛋白水平的分布也与非ARDS患者存在显著差异。本研究发现的P/F比与粪便钙保护蛋白之间的强相关性也突出了COVID-19患者因缺氧肠道损伤引起的肠道炎症与疾病严重程度之间的关系。粪便钙保护蛋白是一种中性粒细胞特异性蛋白，其作用受肠缺血影响较大[23，30.］．这些结果与意大利之前的一项研究一致，该研究发现COVID-19肺炎与COVID-19粪便钙保护蛋白水平之间存在显著关系，其中肺炎代表疾病严重程度[34］．

有趣的是，尽管P/F比值与粪便钙保护蛋白水平之间存在显著相关性，但我们的结果显示，与非ARDS组相比，ARDS各程度之间以及ARDS与非ARDS组之间存在统计学上的显著差异。这些结果表明，粪便钙保护蛋白在代表肠道炎症中的作用主要可以通过比较有无低氧血症的情况来观察，但在低氧血症的程度之间不太突出。这一特殊的发现将我们带到了缺氧和粘膜炎症的理论，其中缺氧诱导因子(HIF)可能发挥了重要作用。HIF是肠道炎症性缺氧在炎症消退方面的关键调节因子[41］．在肠道中刺激HIF-1α，通过增强粘液、防御素和紧密连接蛋白，以及在损伤时重新填充ATP池，产生一个屏障保护途径。HIF还调节红细胞生成、血管生成和肠道代谢，以适应缺氧[42］．这种适应导致炎症消退，如受影响较小的粪便钙保护蛋白水平所示(不同程度的ARDS之间没有统计学上的显著差异)。

本研究的主要胃肠道症状是食欲下降，但fc阳性组的主要症状是恶心。这一发现与78项研究中12,797名COVID-19患者胃肠道症状患病率的系统综述和荟萃分析相平行，其中食欲不振最为普遍(约占患者的五分之一)[43］．与之前的两项研究相比，本研究中的恶心、呕吐和腹泻在fc阳性组和fc阴性组之间显示出显著的统计学差异[31，35］．在这方面，奥地利先前的一项研究表明，SARS-CoV-2感染会引起肠道炎症反应，表现为腹泻和粪便钙保护蛋白升高[33］．然而，由于我们没有从粪便样本中评估SARS-CoV-2 PCR，因此目前判断本研究中的腹泻和其他胃肠道症状是由直接病毒病因引起还是由肠粘膜的其他炎症过程引起还为时过早。

另一个值得注意的发现是，本研究中fc阳性组和fc阴性组在所有炎症参数上均无统计学差异。在这方面，先前的一项研究发现粪便钙保护素与血清IL-6浓度之间存在显著相关性(P< 0.001)，而c反应蛋白或铁蛋白[33］．此前在奥地利进行的这项研究结果可能支持SARS-CoV-2诱导胃肠道炎症而不直接侵袭肠道细胞的假设。循环炎性细胞因子可诱导细胞浸润肠壁，进而导致钙保护蛋白释放[35，44］．尽管如此，我们的研究结果表明，这种特殊机制的作用在我们的研究人群中不那么显著。与之前意大利的另一项研究相反，我们发现粪便钙保护蛋白组之间d -二聚体水平没有显著差异[23］．这一结果表明，在我们的研究对象中，高凝在引发肠道炎症中的作用是微妙的。

这项研究有几个局限性。首先，样本量相对较小，因为这是单中心研究;因此，如果可能的话，应通过更大样本量的额外研究和多中心研究来验证结果。其次，这是一项横断面研究，而不是前瞻性研究。使用这种方法很难确定P/F比和粪便钙保护蛋白之间关系的方向，因为这两个变量可能相互干扰。前瞻性研究也可以让我们评估整个住院期间粪便钙保护蛋白水平的趋势，并确定结果。我们也没有有关症状发作和住院至血液和粪便样本收集的时间的数据，这可能为COVID-19临床病程与肠道炎症之间的关系提供信息。最后，我们没有对粪便样本中的SARS-CoV-2进行PCR检测;因此，我们不能排除是否有病毒直接侵入肠粘膜，引发肠道炎症。尽管如此，本研究作为一个初步研究是有价值的，以加强这一领域的进一步研究。

总之，我们的研究结果支持了目前对COVID-19严重程度与肠道表现之间关系的理解。粪便钙保护蛋白显示出在COVID-19中作为肠道炎症生物标志物的潜在作用，这是低氧肠道损伤的结果，正如P/F比降低所表明的那样。尽管如此，还需要更多的研究来研究COVID-19患者胃肠道表现和粪便钙保护蛋白水平升高的病因学，以及它们在预测胃肠道并发症和临床结果方面的潜力。

当前研究的所有序列和相关元数据均可根据合理要求从通讯作者处获得。代表研究合作和发展，允许患者和伦理委员会在通讯作者的考虑下共享数据。

不适用。

本研究由Airlangga大学研究与社区服务研究所资助。

作者及隶属关系

1. Airlangga大学Soetomo教学医院医学系内科，博士，印度尼西亚泗水，60286

   Deasy Natalia Adriana

2. 印度尼西亚泗水Airlangga大学Soetomo博士教学医院，内科，消化病学和肝病科，泗水60286

   Titong Sugihartono, Iswan Abbas Nusi, Poernomo Boedi Setiawan, Herry Purbayu, Ummi Maimunah, Ulfa Kholili, Budi Widodo, Husin Thamrin, Amie Vidyani, Yoshio Yamaoka和Muhammad Miftahussurur

3. 印度尼西亚雅加达，印度尼西亚大学医学院，内科消化内科

   哈桑Maulahela

4. 印度尼西亚泗水大学热带病研究所幽门螺杆菌和微生物群研究组

   山冈吉夫和默罕默德

5. 大分大学医学系环境与预防医学系，日本大分县御夫市hasama町1-1 iddaiigaoka, 879-5593

   Yoshio山冈

6. 美国德克萨斯州休斯敦市贝勒医学院消化病学和肝病科医学系

   Yoshio山冈

贡献

概念化，DNA, TS, MM;方法学，DNA, IAN, HP;软件，DNA, MM;验证，PBS, UM, HM, YY;调查，DNA, MM, AV;资源，DNA, TS, BW;数据管理，DNA, HT, HP, AV;写作-初稿准备、DNA、MM、YY;审稿、编辑、DNA、MM、HT、AV、HM;可视化，HP, UM, AV; supervision, TS, YY, MM. All the authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

相应的作者

对应到Titong Sugihartono或Yoshio山冈．

伦理批准并同意参与

研究方案由印度尼西亚泗水Soetomo博士教学医院伦理委员会批准(0065/KEPK/IX/2020)。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称没有潜在的利益冲突。

出版商的注意

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