真菌如何塑造生物技术:100年黑曲霉研究

1917年，一位名叫詹姆斯·柯里(James Currie)的食品化学家有了一个很有前途的发现:丝状霉菌的任何菌株黑曲霉在糖培养基中生长会产生高浓度的柠檬酸。这种三羧酸，我们现在知道是克雷布斯循环的中间产物，以前从柑橘类水果中提取，用于食品和饮料生产。居里的发现两年后，工业化生产开始使用答:尼日尔开始，生化发酵产业开始蓬勃发展，工业生物技术诞生。一个世纪后，使用这种模具生产柠檬酸是一个价值数十亿美元的产业答:尼日尔此外，生产各种蛋白质，酶和次级代谢产物。在这篇综述中，我们评估了领域的主要发展答:尼日尔生物学在过去的100年，突出科学突破和发现，这是有影响的基础和应用真菌研究内外答:尼日尔社区。我们特别关注过去十年的两个发展:系统生物学和基因组编辑。并对当前国际形势进行了总结答:尼日尔最后，我们将对这种迷人真菌的基础研究及其在工业生物技术中的开发进行展望。

几千年来，人类一直在实践初级的生物技术:通过发酵谷物和水果中的淀粉和糖，古代文明能够生产面包、啤酒、葡萄酒和其他酒精饮料。在19世纪末和20世纪初之前，这些过程是在不了解潜在生物事件的情况下进行的。现在，酿酒厂和葡萄酒酿造是一个众所周知的、受控的工业过程。同样，在短短一个世纪里，工业生物技术发生了巨大的变化，并蓬勃发展，从最初在Erlenmeyer烧瓶中进行的原理验证实验，发展到价值数十亿美元、生产百万吨有用分子的工业。1］．真菌生物技术无疑是这一成功的主要贡献者和驱动力。仅举一个例子，2016年丝状真菌植物降解酶的估计市场规模为47亿欧元，预计在未来十年内将达到100亿欧元[2］．在这个值得庆祝的历史概述中，我们概述了丝状霉菌的一些关键进展黑曲霉从100年前第一次使用这种真菌的生物技术实验开始。

与大多数人的想法相反，柠檬酸不是——或者不再是从柑橘类水果中分离出来的，而是由丝状真菌在工业上生产的答:尼日尔．这一过程是由食品化学家詹姆斯·柯里(James Currie)首创的，他在100年前发表了一项研究，描述了这种食品的优越特性答:尼日尔用于酸的工业生产[3.］．特别地，Currie展示了柠檬酸生物合成所需的生长介质，以及真菌在低pH值(2.5-3.5)下生长的能力，同时仍然能够产生大量的代谢物。此外，这项工作证明了培养基底物量与产物量之间的直接相关性，为现代柠檬酸的工业发酵奠定了基础[3.］．与1917年报道的能产生柠檬酸的其他真菌种类相比，每一株答:尼日尔当在糖溶液中生长时，Currie测试的这种分子可以有效地产生这种分子。两年后，美国辉瑞公司建立了生化生产柠檬酸的试验工厂，并在20世纪20年代中期，生产使用答:尼日尔发酵远远超过柑橘类水果的提取[4］．

在接下来的几十年里，柠檬酸循环被全面确定，导致Hans Krebs和Fritz Lipmann在1953年获得诺贝尔奖。循环中的第一个和最后一个反应包括由草酰乙酸、乙酰辅酶a和水形成柠檬酸盐，最终以三磷酸腺苷(ATP)的形式产生化学能。包括詹姆斯·柯里(James Currie)在内的工业微生物学家的目标是利用这个循环，以及许多其他代谢途径，发酵有用的分子。

虽然发酵技术有所不同，但一般来说，柠檬酸的工业生产需要有氧，浸泡生长答:尼日尔在糖溶液中，通常从廉价的来源中获得，如糖蜜，玉米浆，或水解玉米淀粉等。发酵后,答:尼日尔通常通过过滤物理去除，柠檬酸通过与氢氧化钙(石灰)发酵混合物的沉淀分离，以生成柠檬酸钙盐。随后用硫酸处理产生柠檬酸产品。

柠檬酸的广泛应用可以从目前关于这种代谢物的数据中看出:2007年，全球产量估计为160万吨，2014年估计价值为26亿美元，预计到2020年将上升到36亿美元[1，5］．作为一种弱酸，它可以用作食品和饮料中的抗氧化剂、防腐剂、酸性剂、ph调节剂或调味剂，以及在制药和化妆品行业中的类似应用。柠檬酸目前主要在中国生产，约占全球产量的60% [1］．然而,答:尼日尔工业应用不仅仅局限于柠檬酸的生产;作为一个多产的分泌物，许多工业相关的酶和其他分子是由这种真菌产生的。下面，我们总结了上个世纪该领域的一些关键发展。

基础的和应用的科学发现使用答:尼日尔在过去的100年里是非常多样化的。正如柯里在1917年所写的那样:“对于一个能够产生如此多种化学转化的有机体的新陈代谢，很少有简明的陈述黑曲霉”(3.］．然而，关于历史的一些趋势答:尼日尔一般来说，研究领域是可以破译的。我们进行了一项调查答:尼日尔自Currie的开创性研究以来，通过询问PubMed数据库[6]，适用于任何载有“黑曲霉标题中写道。生成的文章(> 3000，参见附加文件1:表S1)根据出版日期分为5个20年的时间段，将每个时间段内可用标题中最常见的20个词汇可视化为词云(图1)。1)．尽管在PubMed数据库中查询黑曲霉的关键词导致了更多的退稿(> 8700次点击)，我们决定将我们的词云分析专门限制在标题上。我们应用了这一限制，因为在手稿摘要中搜索返回了研究人员使用的大部分点击答:尼日尔在简单的生长试验中，验证假定的抗真菌药物的有效性。虽然有趣，但这些研究工作(从1977年开始非常普遍)并不是特别感兴趣的答:尼日尔生物学本身。

我们对100年的分析答:尼日尔出版物表明，毫不奇怪，“柠檬酸”和“发酵”是每个时期标题中最常见的返回词(图2)。1)．显然，Currie发现的最大限度地提高柠檬酸产量的条件[3.的确是一场生物技术革命，并将成为下个世纪研究的主要焦点。的确,答:尼日尔在过去的40年里，研究迅速发展(图2)。2)．从我们的分析中可以明显看出不同的历史趋势(图2)。1)．

的基础答:尼日尔研究

从1937年到1956年，答:尼日尔研究人员主要关注培养培养基中微观/宏观营养物质的影响以及优化柠檬酸发酵的生长参数(图2)。1, (7，8])。大多数研究专门利用了浸泡培养，这显然反映了需要控制生长、形态，并最终控制发酵过程中柠檬酸的产生(附加文件)1:表S1及[9])。1946年，赫尔曼·穆勒(Hermann Muller)因在x射线照射下的突变研究而获得诺贝尔奖。20世纪40年代末和50年代初，生物科学领域首次出现突变研究答:尼日尔以产生柠檬酸产量提高的菌株[10］．从1957年到1976年，紫外线、x射线和化学诱变的数量有所增加，其中大多数集中在提高柠檬酸的产量(例如[11]和无花果。1)．

值得注意的是，从1957年到1976年期间，我们看到了一个范式的转变答:尼日尔在生物技术研究领域，人们普遍认识到这种真菌不仅适用于柠檬酸发酵，而且还是有用酶的多产生产者(图2)。1)．研究的迅速增长，促进了色谱技术的进步，进行了不同范围的纯化和酶促分析答:尼日尔蛋白质，包括各种氧化酶，脱氢酶，水解酶，纤维素酶和果胶酶，以及其他(图。1, (12，13，14，15，16])。这些发现不仅有助于酶的工业化生产，而且对酶的基本功能的认识做出了重大贡献。在20世纪60年代末和70年代初首次纯化的一对著名同工酶是答:尼日尔葡糖淀粉酶(17，18］．这些发现最终导致了……的广泛应用答:尼日尔发酵、食品和饮料工业中的葡萄糖淀粉酶，这些酶催化部分加工的淀粉糖化成葡萄糖。事实上，从1977年至今，糖淀粉酶研究在出版物中大量出现(图。1)．有趣的是，最近的一份商业报告显示，糖淀酶市场对领先的跨国生物技术公司的成功发挥了重要作用，包括AB酶、天野酶、帝斯曼、Genencor、Novozymes和Verenium [19］．

在工业微生物学领域之外，20世纪70年代，人们对由细菌引起的疾病的临床谱系产生了早期兴趣曲霉属真菌属，与作者首先关联答:尼日尔哮喘发作时吸入孢子[20.］．真菌疾病对人类健康和作物破坏的严重威胁现在得到了更好的理解[21］．事实上，真菌感染影响并估计全球有12亿人，每年造成约150万至200万人死亡。由于有限的抗真菌治疗选择和及时诊断，死亡率可能极高，在免疫功能受损患者和/或耐药菌株引起侵袭性曲霉菌病或其他全身性真菌病的情况下，死亡率可高达90% [2］．事实上，2014年用于控制农业和医药领域真菌生长的杀菌剂市场规模估计为100亿欧元[2］．

分子生物学的曙光和第一次答:尼日尔转换

随着分子生物学的出现，1977年至1996年间发生了一场生物技术革命。这些技术的发展和迅速的发现答:尼日尔分子生物学和遗传学反映在沉重的社会广泛关注基因，克隆和序列分析(图。1)．可以说，对任何生物体进行分子分析的最基本技术是将外源DNA转化为靶细胞并将其整合到受体基因组的能力。在一项开创性的研究中，Peter Punt和Cees van den Hondel利用了一种来自大肠杆菌，编码磷酸转移酶，作为一种显性选择标记答:尼日尔而且答:nidulans［22］．除了成为真菌转化中最常用的显性选择标记之一外，这项工作还开创了利用载体pAN7-1在丝状真菌基因组中进行质粒介导的盒式整合。此外，作者进一步验证了的使用答:nidulans甘油醛-3-磷酸脱氢酶(加仑日)推广者，以及trpC终结者。在另一种方法中，其他研究优化了使用orotidine 5 ' -磷酸脱羧酶基因的同源转化系统pyrG［23，24］．这种可回收的营养不良标记最终将促进数百项研究答:尼日尔基因功能，至今仍在使用，最明显的是作为一种转化系统，但也作为异体和同源基因表达研究中盒整合的方便位点[25］．

这种分子研究的引入开始使工业微生物学家在研究丝状真菌时能够避免各种各样的技术挑战。仅举一例，猪胰腺磷脂酶基因的异源表达答:尼日尔大卫·阿彻的实验室最初没有产生可检测到的蛋白质，这是由于细胞内和细胞外的这种酶的降解答:尼日尔蛋白酶(26］．因此，作者使用当时最先进的PCR和限制性内切酶克隆方法(实际上在今天的大多数分子实验室仍在使用)在蛋白酶缺陷中表达磷脂酶-葡萄糖淀粉酶原融合蛋白答:尼日尔压力。这种重组方法使融合蛋白的分泌浓度为10 μg/mL。

的使用答:尼日尔在1977年至1996年期间，用于生产各种酶的研究也在继续，这一时期蛋白酶的发酵和纯化的大量工作就是一个例证(图2)。1)．真菌蛋白酶在广泛的非生物条件下(例如pH值、温度)都有活性，因此现在被应用于食品、洗衣液和制药工艺等(在[27])。

在过去的20年里:快速发展答:尼日尔研究领域

的发展答:尼日尔分子工具箱从1997年到2017年加速发展。值得注意的里程碑包括在我们实验室和Arthur Ram实验室的合作中产生非同源末端连接(NHEJ)突变体[28]，这使得在真菌转化过程中增加外源DNA盒与受体基因组的靶向效率。丝状真菌NHEJ突变体首次在模式生物中被描述粗糙脉孢菌2004年[29]和盒式靶向率的急剧增加(高达100%的转化真菌细胞)导致研究人员在该工具的快速应用曲霉属真菌属,包括答:尼日尔［28，30.］．

的应用答:尼日尔作为有用酶的细胞工厂，在1997年至2017年期间继续迅速扩张(图2)。1)．例如，植酸酶于1991年首次上市，通过从植酸中产生无机磷来提高动物饲料的营养含量，植酸是植物种子中有机磷的主要形式[31］．植酸酶的生物技术生产市场估计每年超过1.5亿欧元答:尼日尔最常用的微生物之一[32］．

除了单一工业相关蛋白的同源或异源生产外，答:尼日尔和其他曲霉菌在过去十年中越来越多地用于合成各种酶混合物。这种酶鸡尾酒的一个关键应用是植物多糖的降解，其中纤维素，半纤维素和果胶可以被分解成低聚糖和单糖答:尼日尔预测编码植物生物量降解蛋白的基因超过170个[33］．此外，调节这些基因的转录因子正在被迅速阐明，例如淀粉溶解调节因子AmyR(第一个在基因中发现的调节因子)答:尼日尔) [34]，果胶溶解调节剂RhaR [35]，半纤维素调节因子XlnR [36，37]，以及其他几项(在[33])。整合转录因子网络知识与上游分子传感器和信号级联的全面理解可能使工程答:尼日尔具有增加植物生物量降解能力的分离物。这种微生物细胞工厂的影响将使可再生能源成为生产生物燃料和其他工业过程的起始材料。因此,未来答:尼日尔压力可能会使我们从目前的化石经济向生物经济过渡，未来的燃料将从可再生资源中产生。

总的来说，从1996年到现在，酶表达的应用已经取得了很大的进展答:尼日尔，随着分泌蛋白滴度增加的可能性越来越大(例如葡萄糖淀粉酶30 g/L是常见的)(在[38，39])。这些进展已通过几种常规方法实现，包括非真菌基因的密码子优化，以及在某些情况下使用融合载体蛋白[38］．然而，抑制分泌蛋白的最大产量的一个重要瓶颈是对丝状真菌分泌的不完全理解。在Taheri-Talesh假设的模型中答:nidulans［40]，分泌和极性生长在菌丝尖端物理耦合(首次显示在答:尼日尔作者:Han Wösten等，1991年[41])。然而，目前，真菌蛋白质分泌的潜在机制还没有被理解为一个完整的系统，有许多悬而未决的问题阻碍了合理的菌株工程。例如，通过研究同心带的分泌组答:尼日尔已观察到菌落的分泌和生长可以不耦合[42］．如何进一步利用这一现象，在不影响菌丝尖端生长的情况下进一步增加分泌产量?什么分子信号和调控因子控制和限制蛋白质分泌?我们推测，在系统层面上理解支撑真菌分泌的分子和细胞机制将是未来20年的主要研究目标之一。

在过去的十年中，一些研究询问了丝状微观和宏观形态在工业应用中对分泌的影响。例如,答:尼日尔已经产生了高分支表型，以研究潜在的形态发生基因网络控制极性生长，以及其他地方的分泌或宏观形态答:尼日尔已通过向浸没介质中加入微粒而得到改进[43，44］．这些遗传或微生物方法提供了越来越精确的菌丝分枝长度控制，使发酵培养粘度优化，并最小化答:尼日尔对剪切应力敏感。有趣的是，最大化工业蛋白质滴度的一个有前途的研究途径来自于对蛋白质分泌的分析答:oryzae，该研究最终证明隔膜连接处也有分泌[45，46］．这可能会被工业微生物学家利用，作为一种二级分泌途径，以最大限度地分泌有用的酶在曲霉菌物种，包括答:尼日尔．后面是另一个层次的复杂性答:尼日尔Han Wösten、Arthur Ram和Cees van den Hondel实验室的开创性研究发现了真菌分泌物在细胞上的异质性[47]，连字符[48]和菌落水平[49］．这项工作为模型曲霉菌和工业曲霉菌种群异质性的后续研究奠定了概念框架[50，51，52］．

在工业微生物学领域之外，一个令人担忧的观察是上个世纪的答:尼日尔研究跨越了青霉素的发现，亚历山大·弗莱明、恩斯特·钱恩和霍华德·弗洛里因此在1945年获得诺贝尔奖，以及随后全球出现的耐药病原微生物。目前，随着耐药发生率的增加，批准用于农业或临床的化合物数量正在减少[53］．鉴于微生物次生代谢产物是新型生物活性分子的丰富来源[54]，我们实验室和其他实验室在过去5年的重点是建立答:尼日尔作为药物发现和天然产物生产的工业平台菌株。这一目标是基于这样的假设，即细胞内向柠檬酸(及其衍生的氨基酸)的高糖酵解通量可以被利用并重新定向到非核糖体肽的合成中。最近的研究表明，我们确实可以进行基因工程答:尼日尔非核糖体肽合成酶(NRPS)的异源过度表达镰刀菌素以克/升数计的sp [55］．此原理实验证明，利用高度优化和可滴定的合成Tet-on基因开关[25]来生产抗菌环六肽，有望为未来生产多种次生代谢产物铺平道路。事实上，最近，我们可以生产答:尼日尔分离株表达截断的enniatin NRPS酶或关键结构域位置交换，以产生高滴度的新分子(例如1.3 g/L) [56］．令人兴奋的是，与现有药物相比，其中一些新分子表现出了增强的抗寄生虫活性[56］．鉴于真菌次生代谢产物基因的高度多样性，以及它们在实验室条件下频繁的转录沉默，表达使用答:尼日尔作为一种异体宿主，以及这两项研究验证的分子方法，为农业和制药工业中化合物开发发现新的化学先导物提供了巨大的希望。最近的工作进一步支持了这一点，该工作应用了病毒DNA序列(例如，编码2A肽)，以使多顺子基因在答:尼日尔［57，58］．这些研究证明了复杂的次生代谢产物，需要多种酶进行生物合成，可以通过多顺子基因开关产生答:尼日尔．

总而言之，在詹姆斯·柯里(James Currie)在生物技术柠檬酸生产方面的开创性工作一个世纪后，他的评估基本上仍然是正确的:很难对柠檬酸的生产能力做出全面的陈述答:尼日尔由于其代谢的多功能性，以及许多尚未披露的代谢途径。然而，分子生物学的曙光，与最近合成生物学的突破有关答:尼日尔他们最终从柠檬酸生产商中设计出了一个多功能细胞工厂。答:尼日尔是用途最广泛的丝状真菌平台菌株，现在可以利用它来生产酸、蛋白质、酶和药物(表1)．在过去十年中发生的两项发展有望为科学研究开辟全新的途径答:尼日尔:基因组测序和基因组编辑的引入。下面几节将更详细地讨论这两个发展。

第一个被发表的丝状真菌基因组是子囊菌模型的基因组粗糙脉孢菌2003年，也就是在巴黎一家面包店发现这一物种160年后[59］．在这一开创性的草案中，报告了真菌基因组的几个特征，特别是(1)用于次生代谢物生物合成的连续基因簇;(2)通过重复诱导点突变防御寄生移动遗传元件;(3)端粒基因含量与端粒远端染色体区域的差异;(4)以及两种假定的RNA沉默途径的存在[59］．正是在这种背景下，第一个答:尼日尔基因组于2007年公布[60]，那时三个曲霉菌基因组也公开了:答:nidulans［61),答:oryzae［62),而答:来自烟［63］．这些基因组是广泛的用途和挑战的代表曲霉属真菌属:分别为模式生物、食物生产者和人类感染真菌。《答:尼日尔因此，基因组是第一个，也可以说是最重要的工业曲霉属真菌基因组测序。在这个草图中，赫尔曼·佩尔和同事们使用了产酶分离物CBS 513.88，这是一种衍生物答:尼日尔NRRL 3122，通过经典诱变产生的葡萄糖淀粉酶a [60］．因此，这是第一次全球性的分析答:尼日尔基因组库已经在工业应用中应用了几十年，并且仍然是最全面注释的基因组资源之一答:尼日尔社区。

的适用性的众多解释答:尼日尔从估计的34 Mb基因组中鉴定出用于工业应用的基因，估计有14,165个编码基因。例如，作者预测了可能导致生产柠檬酸前体草酰乙酸所需基因扩增的各种基因复制事件[60]，这一观察结果解释了柠檬酸生产的显著能力答:尼日尔．事实上，这一假设已经得到罗纳德·德·弗里斯(Ronald de Vries)领导的一个社区最近对黑曲霉菌进行的全面比较基因组分析的支持。64]，这本书在《。》公开发行整整10年后出版答:尼日尔基因组序列。关于营养的多功能性答:尼日尔，编码假定的营养转运蛋白的基因被富集答:尼日尔当与答:nidulans或答:来自烟．这些基因被认为能够吸收或感知不同的碳和氮来源[60］．

在新的生物活性分子发现的背景下，基于多酮合酶(PKS)或NRPS编码基因的存在，确定了许多假定的次生代谢产物位点[60］．有趣的是，这些簇中的绝大多数缺乏实验验证或预测的生物合成产物，从而表明了新的药物发现的潜力答:尼日尔及其他曲霉菌[65，66］．事实上，这些观察结果已经被最近的比较基因组分析所证实曲霉属真菌属(64]，表明答:尼日尔CBS 513.88预测了57个次级代谢产物簇，而另一项研究预测了81个次级代谢产物簇[67]，这是迄今为止所分析的曲霉菌基因组中最高的。后一项研究采用了广泛的人工注释方法，可能更准确地预测了实际的次生代谢物库答:尼日尔．综上所述，这些典型的发现凸显了人类是如何答:尼日尔草案基因组提供了第一个全球解释的许多工业相关的表型，并促进了该物种的正向遗传学的新时代。而且，在这一革命性资源的直接后果答:尼日尔群落，曲霉菌之间的比较基因组分析也将重新定义物种的概念[68]，询问两性是否相配[60]，以及真菌毒力的性质[69]，以及其他重要的发展(在[70])。

DNA测序技术和分析现在已经足够准确和高通量，可以常规应用于回答各种各样的基础研究问题答:尼日尔．最近一个著名的例子是由Arthur Ram的实验室开发的所谓的批量分离分析，该分析被用于识别负责紫外线突变分离物的非酸化表型的单核苷酸多态性(SNP) [71］．在批量分离方法中，答:尼日尔副性循环用于与感兴趣的突变体杂交野生型菌株，并鉴定出感兴趣的表型的单倍体分离。随后，对这些分离物和亲本分离物的DNA进行测序，以鉴定snp。在这些分离物中，在所有分离物中保守的SNP，但在野生型分离物中不存在，是突变表型的原因。有趣的是，他们证明了非酸化突变表型是由于缺乏柠檬酸分泌，SNP位于编码假定的甲基转移酶LaeA的基因[71］．该蛋白是丝绒复合体的组成部分，调节曲霉菌的光反应、发育和次生代谢[72］．因此，这些系统遗传学方法揭示了LaeA，柠檬酸和次生代谢之间的联系答:尼日尔．

分析答:尼日尔基因组序列确定了几个尚未全面解决的挑战

工业应用的几个陷阱答:尼日尔也从基因组草案的发表中得到了强调[60］．不出所料，发现了许多预测的蛋白酶编码基因，其中许多含有分泌肽，这无疑对工业蛋白质生产构成了重大挑战。此外，在CBS 513.88中，预测可生物合成真菌毒素伏马菌素和赭曲霉毒素A的基因簇也存在。随后由Jens Frisvad和他的同事领导的代谢组学分析表明高达10%的工业使用答:尼日尔分离物能够产生这些潜在的致癌物[73］．除了潜在的毒性问题外，不需要的次级代谢物的产生可能会混淆异源代谢物或新天然化合物的生产工作，因为这些分子将在类似的条件下产生，并且可能在概念验证阶段的放大阶段共同提取。然而，利用基因组编辑技术(见下文)，应该可以通过去除真菌毒素簇来解决这一问题[2］．

一个更普遍的问题从答:尼日尔然而，基因组序列的功能预测仅适用于假定的14,165个假定的开放阅读框中的大约一半[60］．后续发布额外的答:尼日尔基因组(74，75]以及在线基因组数据库和分析门户的持续改进和完善[76，77，78，79，80]并没有显著增加基因功能注释的比率。事实上，对产酸分离物ATCC 1015的基因组挖掘[74]使用公开的分析门户网站FungiDB [79]表明4491(约41%)的预测基因编码产物被注释为“假设蛋白质”，也缺乏基于基因本体(GO)或Interpro域的任何功能预测。

这个基因组“黑匣子”对系统层面的理解提出了几个挑战答:尼日尔以及工业应用的合理应变工程。首先，尽管数千个“假设的”基因在不同的实验条件下具有转录活性，其中许多模拟了工业过程[79]，使用时间和劳动密集型的功能丧失方法研究这些基因的动机非常低。功能冗余使情况进一步复杂化，其中单个基因的删除没有可测量的影响。随着分子工具的不断发展，这一问题已得到部分解决答:尼日尔，已开发出高度优化、可滴定和诱导/抑制的启动子[81］．这些分子工具能够使基因的表达高于原生水平，从而在所谓的“功能获得”方法中产生可测量的表型效应，其额外的优势是有可能从功能上表征必需基因。然而，这些策略不太可能具有对数千个基因进行功能表征的必要通量。

其次，使用基因矫形学对基因组“黑匣子”进行功能预测也是有问题的，因为模型(或参考)生物体可能会产生误导。事实上，从单细胞酵母中推断功能，比如酿酒酵母，或其他曲霉菌，如答:nidulans，说好听点说是建议，说难听点是误导，因为基因和编码产物在生物体之间扮演着不同的角色[2，82］．最近在丝状真菌中的基因组编辑应用，可以说是对快速基因功能表征的最大希望答:尼日尔［83，84]，有可能导致对这种生物体的全面、系统级理解，或为高度优化的工业应用设计新的合成或半合成衍生物。

实际上是在30年前的1987年[85]， CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats)元件与相关的内切酶(例如Cas家族的蛋白质)已被普遍利用约5年。早期的细菌基因组DNA测序显示了短的重复序列，功能未知大肠杆菌［85]，然后在许多细菌物种中发现，二十年后被发现是一种针对噬菌体的适应性防御机制[86］．在研究如何降低酸奶生产发酵剂对噬菌体的敏感性时，工业生物技术学家观察到，以前暴露于病毒的培养物在第二次遇到相同的病毒时就会产生抗药性。86-原因是CRISPR/Cas9系统对入侵DNA的特异性识别、双链切割和失活。在2012年的一篇开创性论文中，该系统可以编程，以高特异性切割任何DNA序列[87，该研究产生了一个分水岭，因为内切酶在许多不同的生物(真菌、昆虫、小鼠、人类、植物等)中都能保持其活性。基因组编辑技术在丝状真菌中的应用最近已得到评述[88］．由于真菌细胞壁的原因，将编码系统成分(核酸内切酶、引导RNA)的DNA或体外生成的成分本身递送到真菌细胞中仍然是一个挑战，并且仍然需要原生质体等常见协议，已经开发了不同的策略来提高诸如真菌等物种的效率答:尼日尔和其他曲霉属真菌spp。主产，Coprinopsis灰质，黑粉菌属maydis，木霉属reesei，粗糙脉孢菌，青霉菌chrysogenum，Myceliophthora thermophila，白僵菌brassiana(见[88])。这些策略包括使用有效的推广者，如trpC，gpdA或RNA聚合酶III启动子U6用于内切酶和/或gRNA的体内表达、Cas9密码子优化、内切酶瞬时表达、内切酶整合到宿主基因组、体外合成gRNA或纯化内切酶的递送等。此外，有关使用适当的标记(在CRISPR/Cas组件转化或基因组编辑之后)和内切酶的致命或不需要的(例如脱靶)效应的考虑已在丝状真菌中得到解决。对于后者，基因组编辑的特异性可以通过以下途径提高:(1)在DNA切割后倾向于宿主同源定向修复(HDR)而不是非同源末端连接(NHEJ)途径，或(2)通过使用修饰的Cas9 (nickase Cas9, a.k.a)产生长悬悬物的DNA双链断裂。nCas9-able将只有一个DNA链,从而与两个不同的复式后gRNA产生长“粘性”结束)(89］．

在适当的策略下，CRISPR/Cas技术看起来就像一只能抓到几只苍蝇的蜘蛛;事实上，应变工程出现了广泛的机会。最近的一个例子说明了这项技术应用的范围答:尼日尔以及其他丝状真菌。Kuivanen等人。[90]使用CRISPR/Cas技术删除了多个基因答:尼日尔为生物技术生产化学半乳糖酸的平台。来自d-半乳糖醛酸是天然聚合物果胶的主要成分，半乳糖醛酸被用作尼龙的前体和护肤化妆品[90］．虽然答:尼日尔能水解果胶，d-半乳糖醛酸也是真菌半乳糖醛酸途径的前体，半乳糖醛酸可以通过一种未知途径分解。作者删除了7个参与分解代谢的基因d-半乳糖醛酸和半乳糖醛酸答:尼日尔采用体外合成gRNA和质粒编码Cas9的策略。用这样一个工程答:尼日尔在菌株中，作者展示了在单一过程中将富含果胶的生物质消化成半乳糖酸[90］．

为了绘制国际研究小组目前正在研究的图景答:尼日尔，我们检索了所有PubMed的文章。黑曲霉在过去5年(2013-2017年)发表的标题、摘要和关键词中，导致2068次点击(附加文件3.:表S3)。社区成员的定义是在过去5年里至少撰写了5篇文章。然后，该研究人员列表被手动策划，以突出小组负责人/ pi，以及研究小组之间的合作(由至少一个共同作者确定)。我们专注于这个相对较短的时间跨度，以确保研究人员积极工作的映射答:尼日尔，并在搜索过滤器中加入摘要和关键词，将结果扩展到那些不仅研究的科学家的社区答:尼日尔生物学，但也研究真菌在其他相关领域(如生物修复，地球微生物学，致病性，毒素生产和食品安全，农业微生物学)。根据先前报道的资料[91，92，93我们还编制了一份(跨国)公司的名单答:尼日尔作为生产柠檬酸和酶的主力(表1)．我们对地图绘制进行了基础研究和应用研究答:尼日尔(无花果。3.、表1)表明该社区是多样化的，地理上分散的，但(至少对基础研究社区而言)联系良好。

这一历史概述涵盖了一些科学趋势和关键的发现，已经发生在领域答:尼日尔生物技术。显然，自19世纪末和20世纪初早期工业微生物学家首次使用它们以来，还有各种各样与工业有关的真菌和细菌也经历了革命性的进步。工业生物技术的未来是什么答:尼日尔，以及其他微生物细胞工厂?为了回答这个问题，我们对未来20年的共同研究主题和主题进行了预测答:尼日尔研究(图。4)．这一推测表明，未来将重点关注合成生物学(包括无真菌毒素菌株的生成)、网络分析(包括基因组学、基因表达和代谢组学)、共培养技术和CRISPR-Cas9基因组编辑的更多应用，以及继续关注次级代谢、发酵、柠檬酸生产、酶和葡萄糖淀化酶研究(图2)。4)．

总的来说，在生物技术专家的工具箱中，有三个关键组成部分正变得越来越可用;(1)公开的、注释良好的几个基因组数据答:尼日尔菌株和开源生物信息管道，使非编码人员能够进行复杂的比较基因组和其他分析;(2)具有工程宏观形态的指导培养方案答:尼日尔，方便提高产品滴度;(3)一套用于高通量基因功能分析的多功能分子技术，包括基因组编辑。为了充分理解和优化开发，还有更多的事情要做答:尼日尔？我们认为，在不久的将来，社会各界仍需解决以下问题:

1. 1.

   鉴于产生的组学和文献数据越来越多，社区如何努力保持和提高真菌数据集的质量和可用性(从数据沉积到分析)?我们如何验证将功能分配给假设基因的预测算法的准确性?

2. 2.

   我们如何解决“假设的蛋白质问题”，我们如何为这些假设的蛋白质分配功能?将基因组、转录组、蛋白质组和代谢组数据整合为强大的比较组学方法的最佳和最简单的方法是什么?

3. 3.

   我们如何生成精确的全基因组代谢网络，并与其他组学数据相结合?

4. 4.

   在微滴度板(或更小尺寸)中进行微型化培养如何适应答:尼日尔其他丝状真菌用于高通量筛选?

5. 5.

   如何研究细胞的异质性，从而使代谢和基因表达的变化不会在整个菌落或菌丝体上平均，哪些新工具将促进这些单细胞方法?

6. 6.

   怎样才能稳定和可复制的增长答:尼日尔在学术研究(例如研究次生代谢的激活)和工业过程(例如高效的酶生产)中都能实现混合培养?当前微生物培养范式转变的共培养方法和工具[94可以专门用于/开发答:尼日尔其他丝状真菌呢?

7. 7.

   协同努力构建全基因组缺失和/或过表达文库答:尼日尔，类似于现有的酿酒酵母［95),n .菌［96),粟酒裂殖酵母［97]，是否对社会有足够的帮助，以保证投入大量的研究经费和资源?

8. 8.

   一个最小的答:尼日尔定义基因组，用什么方法生成基因组?哪些次生代谢物簇应该包括或省略?

9. 9.

   可以开发或实施哪些合成生物学工具来同时调节不同的代谢途径，例如，用于构建遗传回路以优化代谢通量，以有效地生产酶、有机酸或次级代谢物?

10. 10.

    可以答:尼日尔或其他丝状真菌，被开发用于“太空生物技术”目的，作为宇航员的基本伙伴，自主生产食物，酶，抗生素，或用于地球改造工作?

鉴于人类知识的巨大进步答:尼日尔在过去的一个世纪里，随着生物信息学、培养和分子工具的发展，这种工业真菌有潜力继续成为最通用的真菌平台微生物之一。答:尼日尔为那些无法在更容易处理的细菌系统中生产的产品提供了一个底盘，它不仅能够生产高浓度的蛋白质和酶，而且还能生产有益于人类和动物健康的药物。事实上，我们预测到这一点答:尼日尔将是参与下一次工业革命的关键生物之一:从化石经济到生物经济的转变。在这样的速度下，我们期待着未来会发生什么。

TC、CN、VM共同撰写稿件。作者向在领域中许多优秀发现的作者道歉答:尼日尔我们没有在这篇综述中讨论的研究。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

数据和材料的可用性

支持本文结论的数据集包含在本文及其附加文件中。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

不适用。

资金

TC和CN感谢Technische Universität Berlin的博士后资助。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

作者及隶属关系

1. 生物技术研究所应用与分子微生物学系Universität柏林，古斯塔夫-迈耶- allee 25, 13355，柏林，德国

   蒂莫西·c·凯恩斯，科拉多·奈和维拉·梅耶

相应的作者

对应到蒂莫西·凯恩斯，拉奈或维拉·迈耶．

开放获取本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。

转载及权限