巴西豇豆籽粒蛋白质谱的比较(豇豆属unguiculata)品种的主成分分析

本研究旨在比较四个巴西豇豆品种(BRS Aracê， BRS Itaim, BRS Pajeú， BRS Xiquexique)采用双向电泳(2-DE)和主成分分析(PCA)进行分析。2-DE能有效分离豇豆蛋白质谱，4个品种间具有较高的同源性。主成分分析表明，不同品种间蛋白质含量存在差异。从品种BRS Itaim和BRS Pajeú中分离得到铁和锌生物强化的品种BRS Aracê和BRS Xiquexique。这些结果表明，蛋白质图谱可以用于豇豆品种的鉴别。

图形抽象

豇豆(豇豆属unguiculata)是非洲、巴西北部和东北部地区基本食物篮子的重要组成部分。这种豆类富含蛋白质(23%至30%)，纤维(16%至19%)和其他必需营养素，如维生素B (Aida等人)。2021；巴普蒂斯塔等人。2017；Filho等人。2011；Frota等人。2008)．在蛋白质中，vicilin 7S是豇豆的主要贮藏蛋白，根据不同的品种，它可能被糖基化，也可能不被糖基化，从而干扰其功能特性(Kimura et al。2008)．本文分析了巴西农业研究公司(EMBRAPA)开发的四个巴西品种，分别是BRS Aracê、BRS Itaim、BRS Pajeú和BRS Xiquexique。它们有不同的被膜颜色，颗粒大小不同，其中两种是铁和锌的生物强化(BRS Aracê和BRS Xiquexique) (Embrapa)2009；Filho等人。2011；维拉里尼奥等人。2010年,一个；维拉里尼奥等人。2010 b)．

由于豇豆的蛋白质含量高，与动物蛋白或其他植物蛋白的成本相比，鼓励其消费可能与低成本的蛋白质来源有关。此外，豇豆可以作为素食者和/或纯素食者的替代蛋白质来源;并扩大食物选择，以促进饮食多样性。蛋白质除了营养价值外，还与植物的生理状态、光合作用、生物合成和运输等具体过程以及对生物和非生物因素的反应有直接关系。在种子发育过程中，不同的蛋白质组积累，如所谓的储存蛋白质，作为成熟阶段的标志(Clerens et al。2012；达历山德罗和佐拉2012；拉希德等人。2020)．

通过二维凝胶电泳(2-DE)进行蛋白质分析，可以在两个阶段(等电点和分子质量)促进蛋白质分离，具有很高的效率和鲁棒性(Jorrin-Novo等。2019；Rabilloud & Lelong2011；詹等人。2019)．该技术已广泛应用于与食品质量和安全相关的工具(Alikord et al。2018；Lorenzini等人。2016；罗西等人。2017；瓦伦丁-内托等人。2016)．然而，2-DE每个凝胶生成数百个斑点，当使用单变量分析工具(Jacobsen et al.)进行分析时，这可能会使这一大型数据集的分析成为耗时且困难的步骤。2007；Lualdi & Fasano2019，使得主成分分析(PCA)等多元统计方法更加有效。主成分分析(PCA)用于将包含在几个原始变量中的信息集中在一个较小的统计变量(成分)集中，信息损失最小，因此可以对数据集进行概述，突出这些变量之间可能的关系(Engkilde等人)。2007)．它是蛋白质组学数据分析中最常用的多元分析方法之一(Balsamo et al.)。2015；德梅洛等人。2016；Lualdi & Fasano2019；瓦伦丁-内托等人。2016)．主成分分析是一种比较植物品种蛋白质结构而不需要蛋白质鉴定的有用工具。

在这项工作中，我们对EMBRAPA开发的4个巴西豇豆品种(BRS Aracê、BRS Itaim、BRS Pajeú和BRS Xiquexique)进行了首次比较蛋白质谱研究，采用2-DE和主成分分析。

植物材料

巴西Embrapa Meio-Norte公司开发并提供了四个巴西豇豆品种，分别为BRS Aracê、BRS Itaim、BRS Pajeú和BRS Xiquexique。这些作物于2018年5月至7月在巴西Teresina(纬度:5°5′21″南，经度:42°48′6″西，海拔:87米)Embrapa Meio-Norte试验田灌溉条件下种植。

第一种蛋白质提取方案

应用于四个豇豆籽粒栽培品种的第一种方法先前已用于普通豆类(Rossi等。2017)，由每个品种约30克的颗粒组成，一式三份，在分析磨(IKA, Staufen, Germany)中用液氮研磨，随后在-80°C保存，直到提取的那一刻。

每个品种的蛋白质提取物从每个300 mg研磨样品中悬浮在0.8 mL提取缓冲液[0.5 M Tris-HCl, pH 8;0.7 M蔗糖;100mm EDTA;1 mM PMSF;1% (w/v) CHAPS;14mm DTT;Roche蛋白酶抑制剂(Mannheim, Germany)]，混合物旋涡30 s。样品在2万× g下4℃离心20 min，上清液因体积大小平均分成两个微管，加入0.8 mL含纯丙酮、12.5% (w/v) TCA和0.125% (w/v) DTT的溶液，4℃静置过夜，后再次在2万× g下4℃离心20 min。沉淀物用1ml冷甲醇洗涤三次，用1ml纯丙酮洗涤两次，最后用含有0.1% (w/v) DTT的丙酮洗涤。离心后10000 g×30分钟在4°C,上层的丢弃,和沉淀悬浮在300μL补液缓冲区包含7 M尿素,2 M硫脲,2% (w / v)皮套裤,0.28% (w / v)德勤和1% (w / v) PMSF,保持在21°C 2 h,然后被另一个离心在10000 g×30分钟15°C,两个超小型电子管的上层清液合并为一个,并为进一步量化储存在-80°C。 The protein extracts were quantified using the 2-D Quant Kit (GE Healthcare, Uppsala, Sweden).

改进的蛋白质提取方案

根据第一次提取的结果，对方案进行了如上所述的修改(图。1)，以验证豇豆蛋白的最佳提取条件。

选择BRS Xiquexique品种进行籽粒蛋白质提取，因为之前的蛋白质提取得到的蛋白质含量最低。整个过程在15 mL锥形管中进行，避免了在协议期间进行样品分割。我们还评估了样品初始质量的影响，除了300mg外，在本试验中还使用了第二个500mg样品。最后，在研究的第三个变量中，我们决定排除甲醇洗涤的步骤，观察这是否会减少过程中的蛋白质损失。

定量分析后，将此条件应用于其他品种的籽粒。然后，使用2-D cleanup Kit (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)对蛋白质提取物进行清洗。

2 de

从每个品种中制备3个蛋白质提取物(有和没有2-D清洁试剂盒)，从每个蛋白质提取物中制备一个2-DE凝胶，因此每个品种得到3个蛋白质图谱。2-DE如valententin - neto et al.所述。2016)．

等电聚焦(IEF)使用Immobiline干带凝胶(IPG条，pH梯度4 - 7,13 cm) (GE医疗)，根据(Nogueira等。2007；E。A. R.瓦斯孔塞洛斯等人。2005)大多数豇豆蛋白的PI值在pH值4到7之间，所以在这个范围内使用条带可以更好地分离和显示。总蛋白约250 μg稀释于250 μL 0.2 mL的补液缓冲液中⁻¹使用IPG缓冲液pH 4-7 (GE Healthcare)和溴酚蓝作为跟踪染料。条带集中在以下条件下:第一步从50到25 Vh，第2步从500到500 Vh，第3步从1000到750 Vh，第4步从4000到2500 Vh，第5步从8000到15000 Vh，最后一步从6000到6000 Vh，总共达到25000 Vh，每条条带的限制为50 mA。对焦后，条带保存在-80°C。

SDS-PAGE前，用10 g L孵育条带中所含蛋白质15 min⁻¹5 mL含50 mmol L的缓冲液中⁻¹Tris-HCl, pH 8.8;6 mol L⁻¹尿素;0.2 g L⁻¹SDS;3 ml L⁻¹甘油;2.5 mg L⁻¹溴酚蓝。然后用25 g L烷基化15 min⁻¹碘乙酰胺5毫升相同的缓冲液。SDS-PAGE采用12.5%聚丙烯酰胺凝胶，使用SE 600 Ruby系统(GE Healthcare)。每个凝胶的电流为15 mA，持续30分钟，直到运行结束。使用MultiTempIII恒温循环器(GE Healthcare)将温度保持在10°C。蛋白凝胶用考马斯亮蓝G -250染色(Bio-Rad)染色。

图像和数据分析

凝胶在Image Scanner System II上进行扫描，并使用ImageMaster 2-D Platinum Software Version 7.0(均来自GE医疗集团)进行分析。自动匹配已由手动补充。根据光滑度≥4，显著性≥100，面积≥11的参数检测总斑点数。每个品种的三倍凝胶相互比较，随后，在所有品种之间。为了鉴定差异积累蛋白，通过ImageMaster软件比较不同品种间斑点的相对体积(% Vol)并进行方差分析。现货成交量被认为存在显著差异(p与其他品种相比，各品种的三倍平均值< 0.05)。

统计数据

蛋白质含量以3个重复的均值±标准差表示。显著差异(p采用方差分析(ANOVA)、Tukey's检验和Student's t检验检验结果间< 0.05)。所用软件为STATISTICA 7.0版本。

在主成分分析中，对四个品种的凝胶进行了比较;在12个凝胶中选择相应的点。这些选定的数据被转换为log2，每个样本都以中位数为中心。PCA使用Software R语言执行，包'stats'，函数'prcomp'。

植物样品含有不同水平的次生代谢物和营养物质，即使在同一物种内也有所不同，这取决于成熟阶段、植物的部分甚至环境的影响(Hussein & el - ans萨利2019)．在2-DE中，这些化合物会干扰凝胶质量以及蛋白质的分离和鉴定(Vâlcu & Schlink2006；Wu等人。2010)．建议使用清洁试剂盒进行额外的净化步骤，以进一步去除盐类、脂类、核酸和洗涤剂等污染物，以改善清洁后斑点的分离(图2)。2而且3.)．2-DE清理试剂盒可以有效去除干扰物质，提高豇豆凝胶的质量，其他样品也是如此(Kumar et al. 2017)。

蛋白质图谱比较

在与前面描述的2-DE相同的条件下，每个品种的三个凝胶用于品种和样品之间的蛋白质图谱比较。2-DE已被用于分析和分离食物蛋白质，以及比较不同的植物品种(Abreu等。2014；Jagadeesh等人。2017；Jorrin-Novo等人。2019；Moura等。2014；Rabilloud & Lelong2011；詹等人。2019)．大量的单个斑点，以及低存在的条纹凝胶(图。4)，证明有效的蛋白质提取没有或低浓度的干扰，如盐，碳水化合物，和脂类(Görg等。2004)．每个品种的代表性图谱如图所示。4．BRS Aracê斑点数最多，为501±13个(平均±标准差)，作为对应分析的参考凝胶，BRS Xiquexique斑点数为496±6个，BRS Itaim斑点数为488±16个，BRS Pajeú斑点数最少，为451±5个。

进行两项匹配分析(表1)，在每个匹配类别中，斑点数量较多的凝胶被用作参考凝胶。第一次匹配，每个品种(在同一品种的3个凝胶之间进行)，检测到的斑点百分比大于95%，表示重复之间的相似性，同样，Pearson相关系数(r)在0.95 ~ 0.99之间变化，变异系数小于3.28%。在第二次匹配中，4个品种籽粒蛋白质分布的相似度均高于95%，Pearson相关系数(r)在0.95 ~ 0.98之间。

表中检测到的斑点百分比和Pearson相关系数等数据1在相同品种和所有样品之间的蛋白质图谱和参考凝胶之间显示出强烈的相似性。这样，这些重复具有较高的同质性和2-DE分析允许的重复性，并且罗西等人在普通豆品种中观察到。2017)．虽然在表中观察到凝胶之间有很强的对应关系1(检测斑点对应度在90%以上)，通过PCA分析每个斑点的体积百分比，验证了品种间存在差异。

主成分分析用最小的信息损失减少了近300个点(原始变量)的维数。这种转换对数据执行，组织它们，使第一个成分负责最高可能的变化，因为第二个成分呈现第二大变化(Hongyu等。2015；Jacobsen等人。2007)．数据复杂性的降低有助于更好地观察变量之间可能的联系。先前的研究也表明，不同品种之间的蛋白质组分可能存在差异(Oliveira et al。2004；Teka等人。2020；i.m.瓦斯孔塞洛斯等人。2010)．

对于PCA，只考虑12个凝胶中存在的斑点，因此分析297个斑点的体积百分比(% vol)。在生成的12个主成分(PC)中，前5个主成分占数据总变异量的72.73%，前两个主成分如图所示。5占40.67%，22.61%分配在PC1, 18.06%分配在PC2。根据栽培品种有一个明确的分组(图。5)．品种BRS Aracê和BRS Xiquexique与品种BRS Itaim和BRS Pajeú通过PC1分离，品种BRS Pajeú与品种BRS Itaim在PC2上有明显的分离。在蛋白质分析之前，四个豇豆品种并排种植，因此这些豇豆品种籽粒蛋白质谱之间的差异，即所分析斑点体积百分比的变化，是由于遗传因素造成的(Pullaiahgari等。2019；Thiellement等。2002)．此外，蛋白质的初级序列也会干扰它们在2-DE凝胶中的位置，因此，2-DE凝胶中出现的斑点可以被认为是遗传标记(He et al.;2015；Pullaiahgari等人。2019)．

我们证明了2-DE可以有效地分离豇豆蛋白质，使这四个被评估的巴西品种的籽粒蛋白质分布具有高度的同质性。主成分分析表明，不同品种间蛋白质丰度存在差异，可作为遗传标记。鉴于豇豆籽粒中蛋白质含量高，且蛋白质来源多样，这类研究为豇豆籽粒中蛋白质积累相关的育种计划提供了相关信息豇豆属unguiculata，以及食品安全。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

二:

双向凝胶电泳

家伙:

3 - ((3-Cholamidopropyl) dimethylammonio) 1-propanesulfonate

德勤:

二硫苏糖醇

EDTA:

乙二胺四乙酸

PC:

主成分

主成分分析:

主成分分析

PMSF:

苯基甲烷磺酰氟

柠檬酸:

三氯乙酸

我们要感谢Karina G. Silveira的技术支持。

没有资金支持。

作者及隶属关系

1. 食品科学与技术系，加州CCA UFSC，圣卡塔琳娜联邦大学，罗德。Admar Gonzaga, Florianópolis，圣卡塔琳娜，1346,88034-001，巴西

   Tuany Camila Honaiser, Gabriela Barbosa Rossi和Ana Carolina Maisonnave Arisi

2. Embrapa Meio-Norte, Caixa邮政001,Teresina, Piauí， 64008-780，巴西

   Maurisrael de Moura Rocha

贡献

T.C.H.设计了这项研究，进行了实验，并撰写了手稿。G.B.R.设计了这项研究并进行了实验，M.M.R.提供了蔬菜样本，并为最终版本的手稿做出了贡献。A.C.M.A.设计了这项研究，监督了该项目，并为最终版本的手稿做出了贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Ana Carolina Maisonnave Arisi．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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