亚麻荠(camelina sativa (L.))分离蛋白的功能特性Crantz)和flixweed (sophia, Descurainis sophia L.)种子餐

采用传统提取法和超声辅助提取法在40 kHz、20 min条件下分别制备了亚麻籽和亚麻籽分离蛋白，并对其功能特性进行了研究。SDS-PAGE结果表明，超声辅助提取和常规提取的提取液蛋白谱相似。超声的应用显著提高了亚麻分离蛋白和索菲亚分离蛋白的蛋白质提取/含量和功能特性(持水能力、吸油能力、乳化起泡性能和蛋白质溶解度)。索菲亚分离蛋白的持水和吸油能力明显高于亚麻分离蛋白。这些结果表明，亚麻荠分离蛋白和索菲亚分离蛋白可作为天然功能性成分应用于食品工业。

图形抽象

蛋白质在生物系统和人体营养中都起着至关重要的作用。与动物源性蛋白质相比，植物源性蛋白质目前受到了广泛的关注，因为它们具有可持续性和唾手可得的经济吸引力(Deng et al。2019；Du等。2018)．因此，植物蛋白的多样化来源越来越多地解决了全球范围内作为食品工业原料的需求。

在过去的几年里，人们对食品加工副产品中蛋白质的吸引力有所增强。分离蛋白在开发具有理想功能特性的食品中起着不可或缺的作用(Yagoub等。2017)．人们一直在努力开发高效的方法来生产具有良好利用价值的优质蛋白质。亚麻荠(亚麻荠漂白亚麻纤维卷(l)Crantz)和flixweed，也被称为sophia (Descurainis索菲娅L.)属于十字花科，可作为植物蛋白质的新来源。此外，亚麻荠是北美一种新的潜在油籽来源，特别是用于水产养殖饲料。亚麻粉是从亚麻籽中提取油脂的副产品。脱脂的亚麻粉含有大约45%的蛋白质，4.9%的残余粗脂肪，高达15%的不溶性纤维，高达10%的碳水化合物，3%的矿物质，和大约4%的植物化学物质，主要是酚类物质和其他化合物，如维生素(Das等。2014；拉赫曼，Costa de Camargo和Shahidi，2018)．此外，亚麻蛋白的营养质量与油菜籽蛋白相似，并与大豆蛋白在一些针对植物蛋白的应用上竞争(Li et al。2015)．然而，很少有研究从亚麻荠中提取蛋白质和水解产物(Boyle et al。2018；李等人。2014)．

索菲亚种子被用作一种传统药物，可以缓解咳嗽和胸部不适，预防哮喘，治疗癌症。它可以在加拿大以及伊朗和中国找到(HadiNezhad et al。2015)．种子含有28%的蛋白质，33%的油，和4%的灰分(拉赫曼等。2018)．它们的氨基酸包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸(Mohamed和mahous2009)．一些研究调查了索菲亚种子的脂肪酸结构和酚类化合物(Rahman, Ambigaipalan, et al.)。2018；拉赫曼，科斯塔·德·卡马戈，等。2018)．然而，目前还没有研究确定索菲亚种子中的蛋白质，并评估其功能特性。

在分离和回收蛋白质方面，由于其简单和成本效益，碱性萃取已成为制备蛋白质的最流行技术(Pastuszewska et al。2000；Phongthai等。2016)．然而，该技术存在一些潜在的问题，例如存在具有不同等电点的复杂蛋白质成分和大范围的分子量分布(Berot et al.;2005)．因此，高效的提取技术在蛋白质的提取中起着至关重要的作用。大量研究表明，超声辅助提取(UAE)是最成功的提取方法之一，因为它提供了一些潜在的好处，如提取时间短，提取率高，低溶剂用量，提高溶解度(Yagoub等。2017；邹等。2017)．最近的研究也报道了超声波对向日葵分离蛋白的结构和功能特性的影响(Malik和Saini2018；马利克等人。2017)、核桃(Zhu et al.;2018)、蚕豆(Martinez-Velasco et al.)2018)和油菜籽分离蛋白(Flores-Jimenez et al.)。2019)．此外，超声蛋白提取增加了凝胶能力，同时降低了起泡能力(Ly等。2018)．这将有助于利用超声辅助技术开发的食品蛋白质的功能和营养特性的改善。但超声处理对亚麻分离蛋白(CPI)和索菲亚分离蛋白(SPI)品质影响的研究尚未见报道。因此，需要进一步的研究来填补关于亚麻荠和索菲亚分离蛋白功能特性的现有空白，以扩大其在食品工业中的潜在应用。本研究采用超声辅助提取法制备CPI和SPI，并与常用的碱提取法进行比较。

材料

本研究以亚麻荠、亚麻草、索非亚种子为研究对象。亚麻籽由纪念大学的Parrish教授从加拿大萨斯卡通的林奈植物科学公司获得。索菲亚种子来自伊朗哈麦丹市附近的Daghdagh Abad，从加拿大安大略省多伦多的Tavazo商店购买。所有使用的化学品均来自Fisher Scientific Ltd.(渥太华，ON，加拿大)或Sigma-Aldrich Canada Ltd.(奥克维尔，ON，加拿大)。

脱脂

在室温下，用正己烷以1:5 (w/v)的比例在Waring搅拌机中脱脂5分钟。上述步骤重复三次，然后将样品风干并在-20℃保存^oC在蛋白质分离之前。

分离蛋白的制备

pH增溶法从脱脂样品中提取蛋白质

根据Chavan、McKenzie和Shahidi(2001)的研究，蛋白质分离物是从脱脂食物中提取的，并进行了一些修改。脱脂样品悬浮在蒸馏水(DW) (3.0%， w/v)中。用磁力搅拌器搅拌混合物30分钟，然后加入已知量的2 M NaOH，将pH调至12，在室温下再搅拌60分钟。在类似条件下，用蒸馏水(DW)再提取两次残基。将上清液混合，加入2 M HCl调整pH至4.5，然后在4下以10000 x g离心30 min^oC使蛋白质沉淀。收集颗粒，然后用DW洗涤两次。沉淀蛋白在DW中再分散，用1 M NaOH调整pH至7.0。将提取的蛋白质冷冻干燥并保存在-20℃下^oC用于后续分析。

超声辅助从脱脂样品中提取蛋白质

超声处理时，将脱脂样品混合在DW中，用2m NaOH调整溶液pH至12。在接下来的步骤中，悬浮样品被放置在超声波浴中(180 W, 40 kHz, 20分钟)以提取蛋白质。提取后的步骤与第2.3.1节相同。按照Bradford(1976)方法测定上清液中蛋白质含量。

凝胶电泳

采用Laemmli(1970) 5%堆叠凝胶和12%分离凝胶的方法，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定CPI/SPI蛋白谱。CPI和SPI样品分别与缓冲液(Tris-HCl, pH 8.8)混合。将20微升制备好的溶液加入1毫升缓冲液(蒸馏水、0.5 M Tri-HCl pH 6.8、甘油、10% SDS、1%溴酚蓝和β -巯基乙醇)，在沸水中孵卵5分钟，然后在12000 x g下离心30秒。10微升样品被应用到样品孔中。标准蛋白质标记物包含(250、130、100、70、55、35、25、15和10 kDa)，并用作分子量标准。在恒电流(100-200 V)下监测电泳迁移1.5-2小时。用寇马斯亮蓝R-250染色60分钟。通过频繁更换固定液对染色凝胶进行染色，直到多余的染色消失。

表面疏水性

根据Tontul等报道的溴酚蓝(BPB)结合法测定表面疏水性(2018)．BPB已被证明与极性敏感荧光探针结合在蛋白质上相同的疏水位点上。将冻干的CPI/SPI (5 mg/ml, w/v)分散在20 mM ph7磷酸盐缓冲液中。在蛋白质溶液(1 ml)中加入200 μ l BPB溶液(1 mg/ ml BPB在蒸馏水中)。对照由200 μ l BPB溶液和1ml磷酸盐缓冲液组成。测试样品和对照样品搅拌10分钟，然后在2000 x g下离心15分钟。用分光光度计在595 nm处读取上清液的吸光度。表面疏水性由结合BPB计算，计算公式如下。

一个_控制,一个_样本分别为对照和样品的吸光度。

功能性质

蛋白质溶解度

蛋白质溶解度的测量方法根据Ambigaipalan和Shahidi(2015)描述的方法进行了一些修改。将冻干的CPI/SPI (1 mg/ml, w/v)分散于蒸馏水中，加入(1 M或6 M) HCl或NaOH调整其pH值为2、3、4、5、6、7、9和12。搅拌60分钟，然后在7500 x g下离心15分钟。以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford(1976)法测定上清液中的蛋白质含量，0.5 M NaOH溶解样品测定样品中的总蛋白质含量。CPI/SPI溶解度用上清液中蛋白质含量与总蛋白质含量的百分比比值表示，用下式表示:

持水量(WHC)

持水量的测定参照Deng等的方法进行。2019)，稍作修改。CPI/SPI (0.2 g)与5ml蒸馏水混合在预先称重的离心管中。将混合物旋转2分钟，然后在室温下静置60分钟。将分散液以8000 x g离心20分钟后小心丢弃上清液。测量沉淀和离心管的总重量。WHC的计算公式如下:

地点:

W₀=分离蛋白的重量，

W₁=离心管和分离蛋白样品的重量，和

W₂=离心管和沉淀分离蛋白吸水后的重量。

吸油能力(OAC)

CPI/SPI吸油能力的测定，采用Deng et al. (2019)。将CPI/SPI (0.2 g)加入5 ml商业玉米油中，放入预称重的离心管中，然后混合2分钟，在室温下静置60分钟。混合物在8000 x g下离心20分钟，弃去上清。OAC的计算公式如下:

地点:

W₀=分离蛋白的重量，

W₁=离心管和分离蛋白样品的重量，和

W₂=离心管和沉淀分离蛋白吸油后的重量。

发泡性能

Shahidi等人(1995)和Elsohaimy等人描述的方法(2015)进行了一些修改。将CPI/SPI (1 g)分散在蒸馏水中，然后将混合物调节到不同的pH值(2、4、6、8、10)。分散体以16000 rpm的速度均匀化2分钟。分别在0和10分钟记录泡沫的体积。泡沫容量(FC)表示均质化后体积增加的百分比，泡沫稳定性(FS)表示静置10min后剩余的泡沫体积，由下式确定:

其中:V(ml)， V₀(毫升),V₁(ml)分别为初始、0 min、10 min时的泡沫体积。

乳化性能

乳化活性指数(EAI)根据Hang et al.(2014)和Tontul et al. (2018)，稍作修改。简单地说，CPI/SPI分散在蒸馏水(0.5% w/v)中，然后用NaOH或HCl(0.1或1 M)调整到pH 7。然后将15毫升分散体加入5毫升玉米油中，使用高速均质机以16000转/分钟的速度混合2分钟。均质后，立即取25µl乳液转移到管中，用5 ml SDS(0.1%)稀释。用分光光度计在500 nm处读取稀释乳液的吸光度。使用相同的程序测量10分钟的乳液稳定指数(ESI)。EAI和ESI计算公式如下:

一个₀,一个₁₀分别为乳化后0 min、10 min乳液的吸光度，DF为稀释系数，C为样品浓度(g/ml)， φ为乳化液中油的体积分数。

统计分析

所有实验均进行三次，数据以均数±标准差报告。采用单因素方差分析，均数比较采用Tukey 's HSD检验(p< 0.05)， SPSS 16.0 for Windows (SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。

蛋白提取物SDS-PAGE图谱

芸苔科油籽中含有丰富的两种种子贮藏蛋白:豆荚蛋白型球蛋白(12s或十字花科)和napin型白蛋白(2s或napin)。它们分别占成熟种子总蛋白质的60%和20% (Wanasundara2011)．数字1显示了从亚麻荠粕和索菲亚粕中获得的电泳蛋白谱。在亚麻和索菲亚分离蛋白(AE和UAE)中，存在15 ~ 25 kDa和25 ~ 35 kDa两个主要条带。这些条带分别指napin和cruciferin (Tan et al。2011；Wanasundara2011)．亚麻荠分离蛋白的特征与Boyle等人观察到的相似。波义耳等人(2018)．

碱法提取(AE)蛋白与超声辅助提取(UAE)蛋白条带结构相似。因此，这些凝胶表明超声辅助提取并未改变CPI和SPI中蛋白质的一级结构。最近在超声辅助提取鹰嘴豆、芸豆和大豆的蛋白质中也观察到了类似的结果(Byanju et al。2020)．

表面疏水性

表面疏水性(SH)是影响蛋白质功能的重要特性。较高的表面疏水性意味着分离蛋白具有较强的表面活性剂性质(Mune和Sogi2015；Tontul等人。2018)．结果表明，提取方法对亚麻籽粕分离蛋白疏水性表面有不同的影响。UAE提取的亚麻和索菲亚分离蛋白的SH均显著高于AE提取的(p< 0.05)。用UAE制备的索菲亚分离蛋白的SH最高(98.16µg BPB)，而作为参考的大豆分离蛋白的SH最低(84.38µg BPB)1)．据报道，从不同来源提取的蛋白质中SH存在显著差异(Mune和Sogi2015；Tontul等人。2018)．因此，提取的蛋白质表面疏水性的变化可能是由于超声波引起的蛋白质结构的变化。据报道，该蛋白的分子结构在超声下被展开，从而揭示了疏水基团(Wang et al。2020)．

功能性质

蛋白质溶解度

溶解度是食品配方中分离蛋白最关键的特性之一，因为它关系到其他功能特性，特别是在泡沫、乳剂和凝胶中。它还影响产品的颜色、质地和感官质量(邓等。2019；Tontul等人。2018)．根据Fig。2， CPI和SPI的蛋白质溶解度在控制pH值2 ~ 12范围内呈典型的u型曲线。样品的PS受pH值的影响较大，在pH值3 ~ 5附近溶解度最小，即这些产品的等电点区域。等电点附近的低PS是由于正负电荷平衡，减少了蛋白质分子之间的静电排斥，导致聚集和沉淀。此外，随着pH(5 ~ 12)的增加，样品的PS逐渐增加，CPI在pH 12时最易溶解。这些结果也与之前对不同样本类型的研究相一致，如菜籽蛋白(Dong et al。2011)，藜麦分离蛋白(Elsohaimy et al.;2015)、绿豆蛋白(Du et al.;2018)，鹰嘴豆分离蛋白(Tontul et al.;2018)和木瓜籽分离蛋白(Deng et al.;2019)．

数字2(a&b)也表明，大豆PI的PS高于CPI (AE)和SPI (AE)，但低于UAE。因此，在pH 6 ~ 12范围内，UAE分离蛋白的溶解度较AE显著提高。许多因素，包括蛋白质的分子大小和组成，都会影响蛋白质的溶解度。超声导致的颗粒尺寸减小可能是由于蛋白质与水之间更好的相互作用，从而增加了蛋白质的溶解度(Wang et al.)。2020；Yu等人。2019；Zhang等。2018)．

保水能力和吸油能力

持水能力是蛋白质将重力与水联系起来的能力的衡量，它与食品的质地、口感和粘度密切相关(邓等。2019)．CPI和SPI的WHC显著高于大豆PI(表2)2) (p< 0.05)。此外，CPI (UAE)的WHC较CPI (AE)提高了20.3%，而SPI制备UAE的WHC没有显著变化。这可以解释为UAE提取样品的粒径减小和蛋白质溶解度的改善(Wang et al.)。2020)．因此，CPI和SPI可以用来替代大豆分离蛋白在某些食品。

一般来说，蛋白质的吸油能力代表了它们与油的结合能力。它与风味保留、保质期和乳化性质密切相关。这一特性可能受到氨基酸组成、所用油的类型、疏水性以及提取蛋白质的方法等因素的影响(邓等。2019；董等。2011)．表中的结果2结果表明，CPI和SPI的吸油能力优于大豆PI。与AE相比，CPI (UAE)和SPI (UAE)的OAC分别提高了29.52%和16.95%。OAC的改善可能是由于使用UAE后疏水性基团的暴露。在本分析中，使用UAE的CPI和SPI的表面疏水性增加，这可能弥补了分离蛋白OAC的增加。

发泡性能

发泡性能与降低水-空气界面表面张力的能力相关，并与蛋白质结构密切相关。此外，泡沫容量和泡沫稳定性与蛋白质溶解度密切相关。较高的蛋白质溶解度改善了水-蛋白质的相互作用，并有助于展开蛋白质结构，因此增强了空气封装(Mundi和Aluko2012；Zhang等。2018)．如图所示。3.和4在pH值为4时，所有样品的FC和FS最低，pH值为蛋白质溶解度最低。这可能是因为蛋白质在水/空气界面扩散形成气泡的能力有限。然而，它倾向于从pH 2到pH 3下降，并在pH 5-10范围内增加。结果与报道的蛋白质溶解度在pH值2-10范围内相一致。在UAE中，SPI的FC和FS明显高于AE，而CPI相对不变。超声辅助碱萃取可增加泡沫形成，引起蛋白质结构变化，增加表面疏水性(Wang et al。2020)．

乳化性能

观察CPI在不同pH下的乳化能力指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)，如图所示。5和6，以大豆分离蛋白(大豆PI)为参考。所有样品的EAI在pH 2 ~ 10范围内呈U型曲线，这与蛋白质溶解度与pH的关系有关5结果表明，pH为4时EAI最低，接近等电点。此外，所有样品的EAI随着pH从2到4的增加而迅速下降，而在pH 6 ~ 10范围内，EAI依次增加，在pH 10时达到最高值。结果与油菜籽/油菜籽相似(Dong et al.;2011；Tan等人。2011)．CPI (UAE)的EAI显著高于CPI (AE)，而SPI(UAE)和SPI(AE)的EAI趋势相似且保持不变。超声辅助提取方法通过增强分子柔韧性和表面疏水性来影响分离蛋白的结构(Wang et al。2020)．数字6在pH值为4时ESI值最低，接近等电点，而在pH值为6时ESI值最高。ESI低可能是由于蛋白质分子溶解度差，水合作用不理想，静电斥力弱，不足以阻止油滴聚集。此外，除CPI (AE)在pH 6 ~ 10时外，其余大部分样品的EAI均高于大豆PI。这表明UAE制备的CPI和SPI具有良好的乳化能力，使其成为食品工业中很好的候选乳化剂。

超声辅助提取法比传统提取法提取亚麻籽粕中蛋白质的效果更好。超声辅助提取的所有样品蛋白亚基条带均无差异。CPI和SPI的表面疏水性高于大豆分离蛋白。超声辅助提取显著提高了CPI和SPI的持水能力、吸油能力、乳化能力和起泡能力，表明CPI和SPI在食品配方中替代大豆蛋白的潜力。对CPI和SPI的蛋白质价值和消化率进行进一步研究是其作为食品原料应用的必要条件。

请联系Fereidoon Shahidi博士查询数据。

消费者价格指数:

亚麻蛋白分离物

SPI:

索菲亚分离蛋白

大豆PI:

大豆分离蛋白

sds - page:

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

AE:

碱性萃取

阿联酋:

超声波协助提取

BPB:

溴酚蓝

承宪:

表面疏水性

PS:

蛋白质溶解度

通车:

持水量

OAC:

吸油能力

舰队指挥官:

发泡能力

FS:

泡沫稳定性

EAI:

乳化活性指数

应急服务国际公司:

乳液稳定性指数

我们感谢加拿大自然科学与工程研究理事会(NSERC)的财政支持。非政府组织感谢越南国际教育发展局提供奖学金。

作者及隶属关系

1. 纽芬兰纪念大学生物化学系，A1B 3X9，圣约翰，NL，加拿大

   Na Thi Ty Ngo和Fereidoon Shahidi

贡献

Shahidi F博士提出并监督该项目，Na T.T.N.进行实验并分析数据。作者Na T.T.N.起草了手稿，Shahidi F博士审阅、修改和编辑了手稿。最终文件由作者阅读并批准。

相应的作者

对应到Fereidoon Shahidi．

相互竞争的利益

Fereidoon Shahidi博士是食品生产、加工与营养“，他也没有参与杂志对这篇手稿的评审或相关决定。

出版商的注意

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