新鲜农产品作为一种潜在的传播媒介鲍曼不动杆菌

鲍曼不动杆菌是一种革兰氏阴性细菌，在医疗机构中占据了一席之地。由于能力答:baumannii为了容易获得抗生素耐药性，其在食品中的存在可能对公众健康构成重大威胁。因此，本研究的目的是调查答:baumannii并研究它们的遗传多样性。共采集蔬菜和水果样本234份。答:baumannii使用CHROMagar和两种不同的PCR方法鉴定分离株。此外，还测试了分离物的抗抗生素能力和形成生物膜的能力。采用多位点序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)方法对分离株的遗传多样性进行了鉴定。234个样本中，10个(6.5%)和7个(8.75%)答:baumannii分别从蔬菜和水果中分离得到。药敏试验显示其中4株具有广泛耐药(XDR)。所有分离株均能形成生物膜，MLST分析发现6株新菌株。这项研究表明，新鲜农产品构成了一个储存库答:baumannii，包括强生物膜形成者和XDR菌株。这是对公众健康的一个重大关切，因为蔬菜和水果可能成为传播霍乱的媒介答:baumannii以及抗生素耐药性进入社区和医疗环境。

鲍曼不动杆菌是一种革兰氏阴性细菌，由于其能够抵抗多种抗菌剂(Nasr2020)．这种病原体可引起广泛的疾病，包括尿路感染、皮肤和软组织感染、菌血症、肺炎、骨髓炎和脑膜炎(Williams等。2020)．的成功有几个因素答:baumannii作为一种医院病原体，包括其对不良环境条件的适应能力、抗旱性、抗生素耐药性和基因组可塑性。除此之外,答:baumannii可以在经常使用的消毒剂(如苯酚和洗必泰)中存活，并且可以耐受干燥环境数月(加乐高2016)．

虽然答:baumannii它通常被称为医院病原体，也从不同的来源如食物、水、土壤和动物中分离出来(Lupo等。2014；Rafei等人。2015；阿特罗尼等人。2016；Karumathil等人。2016；Carvalheira等人。2017年,一个；Carvalheira等人。2017 b)．存在答:baumannii食品中的致病菌被认为是一个严重的问题，因为这种细菌污染食物链可能会使其进入医疗保健机构，从而加剧由这种病原体引起的医院感染的负担(Lupo等。2014)．近年来，由于农业方法的现代化和产量的激增，新鲜农产品(水果和蔬菜)的消费量有所增加(Carvalheira et al。2017年,一个)．在社区和医院环境中，食用生的或最低限度加工的新鲜农产品可作为这种病原体传播的来源(Berlau et al。1999)．蔬菜和水果可以获得答:baumannii在土壤中生长时，在收获时，从有机肥料中，从受污染的灌溉水中，以及在运输和处理过程中(Machado-Moreira et al.)。2019)．此外，蔬菜和水果的水分活度高，有助于微生物的生长，包括不动杆菌物种。

很少有研究报告分离答:baumannii从新鲜的农产品。例如，这种病原体已从苹果、瓜、豆、胡萝卜、土豆和萝卜中分离出来(Berlau et al。1999)，而一个日本小组只从韭菜中分离出了它(Oie et al。2008)．此外，两项研究报告了生菜样品受到污染答:baumanniiKarumathil等。2016；Carvalheira等人。2017 b)．然而，这些研究都没有试图阐明这种病原体与临床背景的联系，因为答:baumannii所调查菌株的克隆性未确定。的克隆信息答:baumannii从新鲜农产品中分离出来将增加我们对任何潜在的交流的了解答:baumannii食品和医疗环境之间的克隆。因此，本研究旨在调查该菌的克隆性、耐药性及生物膜形成情况答:baumannii来自约旦伊尔比德市零售市场的新鲜农产品。

样品的采集和分离答:baumannii

2018年10月至2020年2月期间，从约旦不同的大型超市和零售市场共收集了234个样本(154种蔬菜和80种水果)1)．答:baumannii按照前面描述的程序从所有样品中分离出来(Rafei et al。2015)．简单地说，所有样品都在收集后24小时内在紫外线消毒的层流中处理。从每个样品中取10克，在无菌铝板上层流中称重，悬浮在90 mL无菌蒸馏水中(10% w/v)。悬浮液在轨道激振器水浴中均质15分钟，然后醒酒30分钟。将5毫升悬浮液添加到20毫升Dijkshoorn富集介质中，在轨道激振器水浴中以150转/分的速度在37°C下混合48小时(Carvalheira等。2017 b)．CHROMagar不动杆菌培养皿(CHROMagar, France)用于样品培养，在37℃下孵育24-48小时。带有白色光晕的红色菌落被认为是假定的答:baumannii并被选作进一步分析。

分子鉴定答:baumannii

答:baumannii在分子水平通过部分聚合酶链式反应(PCR)扩增忧郁(Hamouda2017),bla_OXA-51基因(Turton et al.;2006)．此外，采用多重PCR方法进行区分鲍曼氏弧菌，医院弧菌，而且答:pittiiChen et al.;2014)．按照制造商的说明，使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(Promega/USA)提取基因组DNA。所有PCR产物均使用GeneJet Gel Extraction Kit (ThermoFisher, USA)从琼脂糖凝胶中纯化，并进行DNA测序(Macrogen，韩国)。通过BLAST搜索对获得的DNA序列进行分析。从参考菌株中分离出来的DNA答:baumanniiATCC 19606作为所有PCR检测的阳性对照。

抗生素敏感性试验

采用纸片扩散法对多oripenem (10 μg)、亚胺培南(10 μg)、美罗培南(10 μg)、环丙沙星(5 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、头孢曲松(30 μg)、头孢吡肟(30 μg)、阿米卡星(30 μg)、妥布霉素(10 μg)、庆大霉素(10 μg)、氨苄西林-舒巴坦(10/10 μg)、四环素(30 μg)、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑(12.5 /23.75 μg)、哌拉西林(100 μg)、哌拉西林-他唑巴坦(100/10 μg)进行药敏试验。所有抗生素均购自英国Oxoid公司。黏菌素(Sigma，德国)、多粘菌素B (Duchefa Biochemie，荷兰)和提加环素(Cayman，美国)抗生素的最低抑菌浓度(MICs)是通过肉汤微量稀释法测定的(Wiegand et al.)。2008)．临床和实验室标准协会(CLSI)抗生素敏感性断点(CLSI2018)用于将分离株分为敏感、中间和耐药。参考应变答:baumannii所有抗生素敏感性试验均纳入ATCC19606作为对照。

生物膜的形成

如前所述，在无菌96孔微量滴度板中采用半定量方法测定生物膜的形成(Hu等。2016)．对于每个分离物，每96孔板进行3次生物膜检测，并将3个独立板的光密度(odd)与截止OD (ODc)进行比较，以确定生物膜表型如下:非生物膜生产者:OD≤ODc;弱生物膜产生器:ODc < OD≤2 × ODc;中度生物膜产生器:2 × ODc < OD≤4 × ODc;或强生物膜产生器:OD > 4 × ODc。

多位点序列分型

采用巴斯德方案对所有分离株进行MLST, PCR扩增7个管家基因(cpn60，fusA，gltA，pyrG，recA, rplB,rpoB),以及随后PCR扩增子的DNA测序(Macrogen，韩国)。MLST的PCR条件载于PubMLST网站(https://pubmlst.org/abaumannii/)．MLST PCR扩增反应为提取的DNA 20 ng/μl，每个引物0.4 μM, 1X PCR就绪混合物(iNtRON，韩国)。利用PubMLST数据库工具(Jolley et al.;2018)．goeBURST分析使用PHYLOViZ工具(2.0版)执行，如前所述(Francisco et al。2012)．

分离鉴定答:baumannii

本研究分析的新鲜农产品样品包括进口(42/234;18%)及本地(192/234;82%)的产品。所有芒果和大部分苹果样品(18/19)为进口。其他进口样品有:胡萝卜(6/10)、柠檬(1/10)、梨(3/10)、葡萄(1/11)、桃子(2/12)、辣椒青椒(1/10)。所有其他新鲜农产品都是在当地种植的。

使用CHROMagar来识别假定答:baumannii菌落，从150份(64.1%)样本中分离得到。大多数被检测的黄瓜、胡萝卜、生菜、芝麻菜、薄荷、欧芹、红萝卜样品中含有推定答:baumannii隔离。然而，并非所有的推测分离株都被PCR鉴定为答:baumannii相反，几个分离株被鉴定为答:pittii通过多重PCR法和DNA测序(表1）．答:pittii收集的54份样品(23%)检测到菌落。

大约64%的样本含有推定答:baumannii，但从234份样本中仅分离到17株(7.3%)。表格1总结了假定的菌落数目和确定的菌落数目答:baumannii每个样品的分离物。当测试的存在忧郁-基因经单段PCR，半数以上经多重PCR证实答:baumannii分离物检测呈阳性忧郁基因。但多重PCR均呈阳性答:baumannii隔离的港湾bla_OXA-51基因。多重PCR扩增4个基因;的recA存在于一切的基因不动杆菌物种,gyrB只存在于答:baumannii而且答:nosocomialis的内部转录间隔区(ITS)答:baumannii的ITS区域答:pittii．值得一提的是，多重PCR结果经DNA测序证实。关于样本来源，17个样本中有4个已确认答:baumannii分离株均来自进口产品，其余分离株均来自国内样品。分离株AP4和AP8分别从意大利红苹果和美国红苹果样品中分离得到。另外，我们分离出A。baummannii(GP1)来自埃及的青葡萄样本，以及一个来自西班牙梨的分离物(PR1)。

抗生素敏感性试验

除头孢曲松外，绝大多数菌株对其余抗生素均敏感，所有菌株均表现为耐药或中间表型。根据耐药谱，将分离株分为11种耐药模式(A至K)(表2)2)．6株菌株表现出相同的耐药模式A, 2株菌株表现出相同的耐药模式b，其余9株菌株均表现出不同的耐药模式。

从红萝卜、红苹果、青葡萄和番石榴中分离到的4株菌株被分类为XDR，但除番石榴中分离到的分离株外，其余分离株均对氨苄西林-舒巴坦抗生素敏感。该菌株对甲氧苄啶、妥布霉素、粘菌素和多粘菌素B敏感，对替加环素耐药。其余3株XDR菌株对粘菌素、多粘菌素B和替加环素敏感。

生物膜的形成

17株菌株中有13株(76.5%)在体外表现出较强的生物膜形成能力。在4株XDR分离株中，2株具有较强的生物被膜形成能力，而另外2株具有较弱和中等的生物被膜形成能力3.)．黄瓜、芝麻菜、红苹果、梨、草莓和甜椒的分离株均能形成较强的生物膜。从薄荷和绿葡萄中分离到的两个菌株被归类为中度生物膜，从芝麻菜和番石榴中分离到的菌株被归类为弱生物膜。

多位点序列分型(MLST)

MLST分析结果显示，11株分离株属于6种已知序列类型(STs)，其余6株分离株为新菌株(表2)3.)．ST40菌株5株，ST2菌株2株，ST481、ST602、ST724和ST897菌株4株。本研究获得的XDR分离株中AP8和GP1 2株属于ST2, 1株属于ST724，番石榴XDR分离株有一个新的st不动杆菌数据库和文献表明，此前已从动物源分离出属于ST481和ST897的菌株。ST40菌株已从临床和食物来源中分离出来，而属于ST602的菌株先前已从环境和上呼吸道样本中分离出来。PubMLST数据库仅包含从血液中分离出的一株ST724菌株的数据，而从临床、动物和环境来源中分离出了数百株ST2菌株(Brahmi et al.;2016；库尔希德等人。2020；舍伦科夫等人。2021)．

6个分离株具有新的等位基因谱，并被划分为新的序列类型ST1854-ST1857和ST1862-ST18634)．与这6株分离株相关的数据保存在PubMLST数据库中。分离株SKCUC1含有一个新的等位基因序列rpoB该基因的等位基因编号为318。的序列rpoB-318等位基因与5、48等位基因的同源性为99.78%。其他5个菌株携带新的等位基因组合。eBURST分析显示ST1854、ST1855、ST1856和ST1863分别为ST40、ST316、ST1036和ST610的单位点变异(SLV)。1)．此外，ST1862是ST764和ST1354的双位点变异(DLV)，而ST1857是ST1228的双位点变异(DLV)。

新鲜水果和蔬菜是健康和均衡饮食的组成部分;为我们提供碳水化合物，纤维，矿物质，维生素和许多其他微量营养素，以及保护我们免受许多疾病，如肥胖，癌症和心血管疾病(Iwu和Okoh)2019)．因此，近年来全球对新鲜农产品的需求一直在增加。与此同时，与新鲜农产品消费相关的食源性疾病和疾病暴发在全球范围内也有所增加(Machado-Moreira等。2019)．不同类型的食源性病原体对新鲜农产品的污染已得到广泛证实。虽然不被认为是食源性病原体，答:baumannii已从各种食物中分离出来，如鱼、乳制品、肉类和新鲜农产品．因此，食品受到污染答:baumannii可能是人类的潜在感染源，特别是如果相似的话答:baumannii从食品和临床样品中分离出菌株。目前，我们对该病的患病率还有很大的认识差距答:baumannii在新鲜农产品中，是否存在答:baumannii在这类食物中可能会导致人类感染。因此，本研究的目的是调查的患病率答:baumannii并确定病原体特征，包括遗传多样性、抗生素耐药性表型和生物膜形成能力。

与其他干燥和非新鲜食品相比，新鲜农产品被认为是导致食源性疾病的主要原因之一。疾病控制和预防中心(CDC)报告称，1998年至2008年期间，美国近46%的食源性疾病是由受污染的新鲜农产品引起的(Karumathil等。2016)．新鲜农产品可能被污染答:baumannii来自田间土壤由于使用天然肥料或灌溉用水受到污染。阿特罗尼等人(2016)隔离答:baumannii从农业区附近的土壤样本中提取，这些农业区可能是用废水或再生水灌溉的(Al Atrouni等。2016)．此外，农业土壤可能受到其他来源的污染，如在同一农业地区放牧的家养或野生动物的粪便。的确,答:baumannii是由几个研究小组(Beuchat1996；Brandl2006；Rafei等人。2015；阿特罗尼等人。2016；Carvalheira等人。2017年,一个)．此外，新鲜农产品在收获、处理或运输过程中或在零售市场中可能被污染(Brandl2006；Carvalheira等人。2017 b)．

在本次调查中，在243个新鲜农产品样本中，7.3%被发现受污染答:baumannii，如黄瓜、薄荷、芝麻菜、红萝卜和辣椒等。这些蔬菜常被用于制作生沙拉，因此会引起食物安全问题。此外，17人中有4人答:baumannii从进口产品中分离得到。这一发现需要进一步调查，以阐明这些菌株是来自出口国还是当地菌株。如今，国际进口允许全年持续供应新鲜农产品，并由于贸易全球化和需求的增加而显著增长(Carstens et al.)。2019)．与此同时，进口新鲜农产品牵涉到几次跨国暴发，并促成了向进口国引进新型抗微生物药物耐药决定因素和致病菌(Vital等。2017；Carstens等人。2019)．因此，持续监测进口和国产产品的微生物污染对于预防和减少由这些食品引起的疾病是至关重要的。

在调查的16种蔬菜中，有10种不含砷a . baumannii比如生菜和胡萝卜，这与Karumathil等人的研究结果一致(2016)．在这项研究中，只有一个答:baumannii从100个生菜样品中分离到分离株，而在调查的胡萝卜样品中没有发现分离株(Karumathil等。2016)．当地零售商的常见做法是清洗胡萝卜和生菜，以去除土壤痕迹，并保持这些蔬菜的新鲜外观。此外，零售商倾向于去掉生菜最外层的叶子，以使它们对消费者更具吸引力。这些做法或许可以解释为什么我们无法隔离答:baumannii从本研究调查的胡萝卜和生菜样本中提取。答:baumannii在一些研究中零星地从蔬菜和水果中分离出来，与许多其他研究报告分离出这种机会性病原体形成对比。例如，一些研究报告了检测答:baumannii在生蔬菜沙拉，蔬菜和水果中(Berlau et al。1999；Houang等。2001；Bezanson等人。2008；Oie等。2008；Dahiru和Enabulele2015；Karumathil等人。2016；Carvalheira等人。2017 b)．此外,答:baumannii很少从水果中分离出菌株，因为只有少数研究报告了这种病原体在水果中的低患病率。然而，在我们的研究中，8.75%的水果样本含有答:baumannii，从5种水果中分离出7株;苹果、梨、葡萄、番石榴和草莓。检测样本类型和检测方法的差异可以解释流行率的差异答:baumannii现在的研究和以前的研究之间。上述种类的水果都是手工采摘的，通常在出售给消费者之前都没有清洗，因此在种植、包装和零售的不同阶段，操作工的交叉污染可能导致了这种水果的存在答:baumannii在这类水果上。

除了答:baumannii, 52岁答:pittii从蔬菜中分离到2株，从水果中分离到2株。先前的研究报告从新鲜农产品中分离出该物种(Berlau et al。1999；Rafei等人。2015；Carvalheira等人。2017年,一个)．然而，较高的患病率答:pittii在本研究调查的新鲜农产品样品中观察到。此外,答:pittii从肉类、奶酪和牛奶等新鲜农产品以外的食物来源中回收(Rafei et al。2015；阿特罗尼等人。2016；Carvalheira等人。2017年,一个；Cho等人。2018)．近年来多药耐药答:pittii已在许多国家占主导地位，引起医院感染的比率很高，特别是在重症监护病房(Pailhoriès等。2018)．因此，存在答:pittii新鲜农产品中的致病菌是令人担忧的，并可能导致这种新出现的病原体传播到医疗保健机构。有必要使用分子流行病学技术进行持续监测，以减少病原体在医疗保健系统中的传播。

绝大多数分离株对临床相关抗生素敏感。然而，从红萝卜、红苹果、绿葡萄和番石榴中分离出的4个菌株对包括碳青霉烯类在内的16种抗生素表现出耐药性。许多抗生素仍然是治疗的首选药物答:baumannii人类感染。通过食物链引入这些XDR分离株是一个公共卫生问题，因为它不仅限制了可用于治疗此类菌株引起的感染的治疗方案，而且可能有助于将抗生素耐药性决定因素转移到人类肠道菌群。此外，新鲜农产品上耐抗生素病原体的存在可能会导致不同菌株、物种甚至属之间的耐药性分布。通过移动遗传元件(如质粒)的水平基因转移，可能会增强抗生素耐药性决定因素在致病菌之间的快速传播答:baumannii也不例外。因此，持续监测新鲜农产品中耐抗生素细菌的存在对于风险评估和实施食品安全干预措施非常重要。其他对药物敏感的分离株可能来自土壤，并在收获或处理过程中污染了产品。因此，它们没有与人类接触过，因此也没有接触过抗生素。

在新鲜农产品表面形成的生物膜可能会对新鲜产品质量和公众健康造成严重风险，因为细菌生物膜可能不容易通过简单的水洗去除(Bae等。2014)．此外，某些类型的生物膜对新鲜农产品零售市场和食品工业中常用的清洁和消毒程序具有抗性(Joseph et al。2001；Lapidot等人。2006)．许多食源性致病菌可形成生物膜，如单核增生李斯特菌，葡萄球菌spp。,梭状芽孢杆菌spp。，肠道沙门氏菌，芽孢杆菌spp。，大肠杆菌，沙雷菌spp。,弯曲杆菌spp。和假单胞菌Bai et al.;2021)．此外，生物膜的形成被认为是一个重要的毒力因素答:baumannii．就我们所知，这是第一个调查生物膜形成能力的研究答:baumannii与新鲜农产品隔离。本研究中研究的所有分离株都能形成生物膜，其中大多数被归类为强形成菌。这表明，如果这些分离菌扩散到食品制备设施中，它们可能会在这些设施的表面形成生物膜，从而成为食物链中的持续污染源。

据我们所知，这是第一个确定克隆性的研究答:baumannii与新鲜农产品隔离。从同一超市采集的2份水果样品(GP1和AP8)中分离得到2株属于ST2的XDR分离株。已知由碳青霉烯类引起的感染具有耐药性答:baumannii因此，水果或蔬菜中ST2菌株的存在表明了一种可能的传播途径，即感染了这种病原体的个人或携带者。此外，本研究中研究的一些分离株属于ST40、ST2和ST602。答:baumannii属于这些STs的菌株以前在约旦从临床样本中分离出来(Ababneh等。2021 b)和重症监护室环境表面(Ababneh等。2021年,一个)．这表明，这些分离菌可能通过灌溉水从医院污水传播到蔬菜和水果样品，或通过可能被感染或定植的处理人员的交叉污染传播答:baumannii．黄瓜(CUC6)和苹果(AP4)分离株分别属于ST481和ST897。我们在答:baumannii2株ST897的Pubmlst数据库;其中一种是从动物身上分离出来的。还从动物源分离出带有ST481的菌株(Pailhoriès等。2015)．从动物中分离出ST481和ST897株，提示CUC6和AP4株可能通过使用动物粪便作为天然肥料、野生动物或含有动物粪便的水径流传播到新鲜农产品。

本研究中研究的6株分离株是新菌株，因为它们不属于任何已知的序列类型答:baumannii．这些分离株中有5株不耐多药，在体外显示出很强的形成生物膜的能力，这表明这些是在临床环境中未检测到或暴露于抗生素的环境菌株。新的克隆答:baumannii经常被引入社区和临床环境。由于具有很高的可塑性答:baumannii基因组，这些新的克隆最终可以发展或获得抗生素耐药性，如果获得进入临床环境，这可能代表一个额外的担忧。无所不在的分布答:baumannii在自然界中，可能允许新的菌株通过多种途径引入各种新鲜农产品或生食品的食品加工环境。此外，如果这些菌株能够形成生物膜，它们将成为反复出现的污染源，耐消毒和潜在的人类感染源。因此，挖掘答:baumannii它们在食物链中的传播途径对于防止这种病原体的传播很重要。

综上所述，本研究表明，新鲜农产品构成了一个储存答:baumannii，包括强生物膜形成者和XDR菌株。存在答:baumannii新鲜农产品对公众健康的影响很大因为蔬菜和水果可以作为答:baumannii增加向社区和医疗保健机构的传播。因此，持续监测和克隆分型答:baumannii在临床环境之外检测到的菌株可能会增加我们对这种病原体种群进化的了解，并有助于预测进入临床环境的新的可能途径。与动物食品不同，食用新鲜农产品通常没有最后的微生物杀灭步骤，因此人类接触新鲜农产品相关病原体的潜在风险更大。新鲜农产品零售商、分销商和农民必须确保他们的产品符合所有食品安全要求，以防止答:baumannii以及其他病原体。另一方面，消费者也应尽自己的责任，确保新鲜农产品在食用前经过彻底清洗和煮熟。

不适用。

XDR:

广泛耐药

non-MDR:

Non-Multi-Drug耐

聚合酶链反应:

聚合酶链式反应

爆炸:

基本本地对齐搜索工具

CLSI:

临床和实验室标准研究所

OD:

光密度

MLST:

多位点序列分型

麦克风:

最低抑制浓度

其:

内部转录间隔

圣:

序列类型

SLV:

单位点变异

DLV:

双位点变异

金龟子:

Doripenem

IPM:

Imipenem

MEM:

Meropenem

国际马铃薯中心:

环丙沙星

列弗:

左氧氟沙星

阴极射线示波器:

头孢曲松钠

聚全氟乙丙烯:

头孢吡肟

CAZ:

头孢他啶

正义与发展党:

阿米卡星

钻头扭矩:

妥布霉素

CN:

庆大霉素

山姆:

Ampicillin-sulbactam

TE:

四环素

SXT:

功效

TZP:

Piperacillin-tazobactam

光杆载荷:

哌拉西林

CT:

粘菌素

波尔B:

多粘菌素B

TGC:

Tigecycline

史:

敏感的

接待员:

耐药

我:

中间

ND:

不确定

这项工作是由约旦科学技术大学的研究院长资助的(批准号为no。20190498)。

作者及隶属关系

1. 约旦科技大学科学与艺术学院生物技术与基因工程系，邮箱:3030,Irbid, 22110，约旦

   Qutaiba Ababneh, Ekhlas Al-Rousan和Ziad Jaradat

贡献

质量保证:概念化;资金收购;监督;写作-评论和编辑。EA:数据管理;正式的分析;方法;写作——初稿。ZJ:监督，形式分析;写作-评论和编辑。 The author(s) read and approved the final manuscript.

相应的作者

对应到Qutaiba Ababneh．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

作者确认手稿已被阅读并批准了最终文章，并且没有其他符合作者标准但未被列出的人。

相互竞争的利益

没有要申报的。

出版商的注意

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