小胶质细胞来源的CCL2在新皮层神经炎症中起主要作用gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

在髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中，在小鼠大脑皮层可检测到几个脱髓鞘区域，其中神经炎症事件与罕见的炎症浸润和血脑屏障(BBB)损伤相关。在这种情况下，间充质干细胞(MSCs)的管理可以控制神经炎症，减轻星形胶质细胞形成并促进星形胶质细胞获得干细胞特征。为了进一步了解灰质EAE的发病机制和MSC治疗的逆转作用，我们通过分析趋化因子CCL2(一种参与免疫细胞募集和血脑屏障微血管渗漏的分子)的细胞来源，研究了EAE影响小鼠的新皮层。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

该研究采用免疫组织化学(IHC)和双RNAscope IHC/原位杂交方法，使用星形胶质细胞、ng2胶质细胞、巨噬细胞/小胶质细胞和小胶质细胞选择性标记物联合CCL2进行。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

结果表明，在eae感染小鼠中，肥厚性小胶质细胞是CCL2的主要来源，围绕皮层神经元和受损的血脑屏障微血管。在接受MSCs治疗的eae感染小鼠中，小胶质瘤在治疗后很快(6小时)出现减少，这一观察持续时间很长(10天后测试)。这与CCL2表达减少和血脑屏障特征明显保留/恢复有关。总之，小鼠新皮层EAE的标志是一种以CCL2高水平表达为特征的小胶质细胞增生。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这一发现支持了人类疾病的相关病理和临床方面，而MSCs治疗对神经炎症和血脑屏障通透性的早期控制可能具有重要的治疗意义。gydF4y2Ba

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是一种广泛用于多发性硬化症(MS)的动物模型，以中枢神经系统(CNS)炎症、脱髓鞘和轴突损伤为特征。EAE为研究人类疾病提供了良好的视角[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，这不仅涉及白质，因为脊髓确实是广泛脱髓鞘的EAE中免疫攻击的主要焦点，而且涉及灰质[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。扩散到灰质的炎症状况有助于疾病的临床进展，并导致许多观察到的神经系统症状，包括认知缺陷、精神分裂症和情绪障碍、癫痫发作的风险和运动障碍[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。值得注意的是，最近的皮层活检研究表明，灰质脱髓鞘和伴随的脑膜炎症并不是疾病进展的唯一标志，甚至可能是疾病早期的一个主要特征[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。在趋化因子中，其编码基因和途径已被证明支持炎症反应的(etio)发病机制[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，最广泛评估的是趋化因子(C-C基序)配体2 (CCL2)，最初命名为单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。已知CCL2参与单核细胞和t细胞募集、星形胶质细胞激活、小胶质细胞迁移/增殖和血脑屏障(BBB)功能障碍[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。CCL2配体及其受体CCR2已经在MS患者的死后和活组织脊髓/脑组织样本、eae感染动物的离体样本以及特定细胞系的体外研究中得到了充分的研究。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。因此，星形胶质细胞和内皮细胞现在被广泛认为是CCL2在中枢神经系统中的主要常驻细胞来源。炎症浸润的缺乏是灰质致病性特征gydF4y2Bavs。gydF4y2Ba我们研究了mog诱导的EAE小鼠少突胶质细胞前体对炎症的反应以及大脑皮层血脑屏障微血管的结构和功能状态[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。此外，我们和其他人最近研究了脑星形胶质细胞在EAE中的反应，也监测了骨髓源间充质干细胞(MSCs)治疗后神经炎症和星形胶质细胞形成的状态[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]。以msc为基础的治疗已被证明可以改善自身免疫/神经退行性疾病的临床病程，减少神经炎症并促进髓鞘再生[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。这可能是通过免疫调节和神经保护旁分泌作用发生的[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]，或通过间充质干细胞分泌因子和外泌体[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，以及通过驻留细胞效应器的活动，如大胶质细胞和小胶质细胞[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。在本研究中，eae感染小鼠的新皮层，由于缺乏单核细胞/巨噬细胞浸润，被用作鉴定实质和血脑屏障-微血管界面中CCL2细胞来源的有利环境。对eae感染小鼠进行静脉注射MSCs的平行比较研究，并在发病后的不同时间间隔进行分析。该研究采用免疫组织化学(IHC)和双IHC/RNAscope原位杂交(ISH)方法，使用大胶质细胞和小胶质细胞选择性标记结合CCL2免疫定位和mRNA表达进行。通过免疫组化分析紧密连接(TJ)蛋白、claudin-5和occludin，以及fitc -葡聚糖作为屏障渗透示踪剂，研究bbb微血管的连接结构和屏障功能。总的来说，研究表明，在eae影响小鼠的新皮层中，神经炎症反应包括CCL2的存在，其主要细胞来源已被确定为活化的增生性小胶质细胞。小胶质细胞增生状态也涉及皮质微血管的屏障功能，似乎可以通过基于msc的治疗有效抵消，从而导致小胶质细胞肥大和CCL2表达减少，这种效果持续从疾病发作后最早(6小时)到最近(10天)的实验时间点。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

所有涉及动物的程序均按照动物伦理委员会的指导方针进行，并遵守2014年3月4日第26号法令，即欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/EU的立法转换。所有的努力都是为了尽量减少使用动物的数量。研究方案得到了圣马蒂诺医院动物实验伦理委员会和意大利卫生部的批准(批准号398和444)。gydF4y2Ba

MSCs诱导和治疗EAEgydF4y2Ba

运算单元感应gydF4y2Ba

雌性C579BL/6J小鼠购自意大利乌迪内的哈伦实验室，饲养在无病原体的环境中，随意进食和饮水。在6-8周龄(小鼠平均体重18.5±1.5 g)时，皮下注射含有200 μg髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽- 35-55 (MOG)的乳剂(总300 μl)，分别在小鼠左右两侧和尾基部的两个不同部位诱导慢性EAEgydF4y2Ba_{- 55gydF4y2Ba}) (Espikem)在不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)中添加300 μg结核分枝杆菌(H37RA菌株);Difco)。免疫后即刻及48 h，在100 μl磷酸缓冲盐水溶液(PBS, pH 7.6)中注射400 ng百日咳毒素(Sigma-Aldrich)于小鼠尾静脉。对照，naïve C57BL/6雌性小鼠，除接种物不含MOG外，采用相同方法处理gydF4y2Ba_{- 55gydF4y2Ba}．EAE临床症状出现在免疫后12天(dpi)。每天称重并对小鼠进行EAE临床表现评分(cs)，评分范围为0-5。gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

MSC培养和治疗gydF4y2Ba

从6 - 8周龄雌性C579BL/6J小鼠(Harlan Laboratories, Udine, Italy)中分离出骨髓来源的间充质干细胞，如先前所述[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。MSCs在添加间充质干细胞刺激补充剂(StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada)的Mesencult基础培养基中扩增和维持，温度为37°C，湿度为5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵化器。成熟的MSCs由稳定的CD45定义gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD34gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD9gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba本来就gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD44gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba表型(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。用胰蛋白酶分离MSCs，用不含Ca的PBS洗涤3次gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}(西格玛-奥尔德里奇)，并计算。在EAE诱导小鼠的尾静脉注射10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaMSCs/小鼠发病时用250 μl PBS (Sigma-Aldrich)稀释，即以12 dpi或等量PBS稀释。gydF4y2Ba

动物组和研究设计gydF4y2Ba

将免疫小鼠33只分为以下实验组:(A) eae感染小鼠(pbs处理，无MSCs) (n = 16)， 6 h处死(n = 10);Cs 1.5-2.5)， 24 h (n = 4;Cs 1.5-3.5)， 10天(n = 2;cs 2-2.5)发病后/PBS治疗后;(b)用MSCs处理EAE-影响小鼠(EAE - MSCs -treated) (n = 14)，在相同时间线6小时后处死(n = 8);Cs 1-2)， 24 h (n = 4;Cs 1-3)， 10天(n = 2;cs 2-2.25)发病后/MSC治疗后;(a)和(b)组小鼠尾静脉注射外源性通透性标志物fitc -葡聚糖，分别于6 h和24 h处死(n = 2)gydF4y2Ba每gydF4y2Ba组)(见下文);(c)另一组eae感染小鼠(n = 3)，注射绿色荧光蛋白(GFP)-MSCs(见下文)，24 h后处死;(d) naïve对照组，在与eae感染小鼠相应的时间点处死(n = 4, n = 3, n = 2)。gydF4y2Ba

给药后间充质干细胞的生物分布和命运gydF4y2Ba

通过分析MSC在组织中的分布和持久性来研究MSC治疗的治疗潜力[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。因此，根据以下转染和免疫定位方案，在脑和肺组织中寻找GFP标记的活MSCs。gydF4y2Ba

骨髓间充质干细胞转染及免疫荧光共聚焦分析gydF4y2Ba

在磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下，用转染GFP的绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒转染MSCs，方法如下:以3 × 10的浓度接种3代MSCsgydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞置于T-75厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在37°C, 5% CO下生长的烧瓶gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba24 h后用9 × 10转染gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba病毒颗粒的感染倍数为20。72h后，采用FACS法检测MSCs表达gfp的细胞百分比和平均荧光强度，并按上述方法注射于尾静脉。用共聚焦显微镜对脑和肺切片进行GFP-MSC的免疫荧光分析。简单地说，从经GFP-MSC处理的eae感染小鼠中收集脑和肺，并进行组织学和免疫染色程序(见免疫组织化学段落)。直接检测GFP信号，或者用多克隆兔(pRb)抗GFP抗体(Ab)染色扩增GFP信号，并用合适的二级抗体显示(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba） ［gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。结果显示外源性给药的GFP-MSC被“困”在肺部[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba[附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(图S1)，而在脑实质中没有检测到它们，既没有直接检测到，也没有通过GFP免疫染色检测到。gydF4y2Ba

免疫组织化学gydF4y2Ba

在深度麻醉(氯胺酮/噻嗪混合物，分别为90 mg和4.5 mg/kg)的情况下，经心脏灌注2%多聚甲醛(PFA)和0.2%戊二醛PBS溶液给eae感染小鼠和naïve对照组。取出全脑，将其切成两半，在4°C的固定液中浸泡4小时后固定，然后在4°C的PBS中洗涤过夜。使用振动切片机(徕卡显微系统)，连续矢状切片。(30-35 μm厚)，平均间隔200 μm，从每个半球切割成自由浮动的连续切片，在4°C的PBS中以0.02% PFA保存在多孔档案中。用一抗(Abs)对共聚焦显微镜进行单、双免疫染色，一抗包括occludin、claudin-5、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶C (CD45)、离子钙结合适配器分子1 (IBA1)、C - C基序列趋化因子2 (CCL2)、IV型胶原(COL IV)、CD31(或血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元-胶质抗原2 (NG2)，也称为硫酸软骨素蛋白多糖4 (CSP4)、跨膜蛋白119 (TMEM119)，盐样蛋白1 (SALL1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在室温(RT)下干燥10分钟后，在聚赖氨酸载玻片(Menzel-Glaser, GmbH, Braunschweig, Germany)上粘附后，切片进行以下处理:在室温下用PBS复水5分钟;任一蛋白酶在37°C的PBS中预处理0.1 mg/ml 2分钟(蛋白酶K，代码号03115879001;Roche, Indianapolis, USA)或热诱导表位检索(HIER)，在0.01 M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中以750 W(必要时)微波预处理15分钟;0.5% Triton X-100(默克)在PBS中RT孵育30分钟，使用Vector M.O.M™免疫检测试剂盒(稀释35 ml/ml PBS);载体)RT下1小时和/或Protein Block Serum Free (Dako) RT下15分钟;用单一或联合一抗抗体孵育，用阻断缓冲液(BB)稀释;PBS, 1%牛血清白蛋白，2% FCS;Dako)在4°C下过夜(ON)，用适当的荧光基团偶联的二级抗体或生物素化的二级抗体显示，然后用荧光基团偶联的链亲和素(表1)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，在BB中稀释45分钟。免疫标记后，切片在4% PFA中固定10分钟，并用1:10 K稀释的TO-PRO3在PBS中反染色(633;英杰公司)。每个孵育步骤后，用PBS洗涤3次，每次5分钟。最后，切片用vectasshield (Vector)覆盖，并用指甲油密封。通过省略一抗和错配二抗制备阴性对照。切片在Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems, Mannheim, Germany)下使用顺序扫描程序进行检查。用40 ×和63 ×油透镜在250 ~ 500 nm的间隔内通过切片的z轴进行共聚焦成像。利用徕卡共聚焦软件(multicolepackpackage;徕卡微系统)。gydF4y2Ba

微血管渗透性测定gydF4y2Ba

含有异硫氰酸荧光素-葡聚糖70 kda (5 mg/ml)的肝素溶液(100单位/kg);将fitc -葡聚糖70 (Sigma-Aldrich)作为评价bbb内皮细胞通透性的荧光探针，注射到naïve、eae感染和eae感染的msc处理小鼠的尾静脉。注射结束4分钟后，将小鼠麻醉，用一氧化碳处死gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba吸入，收集脑，用固定液(2% PFA + 0.2%戊二醛，PBS pH 7.4)在4℃下浸泡固定。然后将组织在4°C的PBS中洗涤6小时，并在4°C的PFA 0.02%中保存。切片(30-35 μm厚)用pRb Ab抗gfap免疫标记，显示相应的次级Ab(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，并用TO-PRO3反染，采用相同的免疫组化方法和上述共聚焦激光显微镜设置。gydF4y2Ba

双rnascope -免疫组化/原位杂交(IHC/ISH)gydF4y2Ba

从多孔切片档案中收集naïve、EAE影响小鼠和EAE msc处理小鼠的脑切片(见免疫组织化学段落)，并使用“双IHC/ISH RNAscope技术”(Advanced Cell Diagnostic, ACD, Inc.;海沃德，加州，美国)。我们将所描述的方法应用于振动器切割的脑切片。(46)，适合先检测GFAP蛋白，然后gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba信使rna。在RT下干燥10分钟后，在聚赖氨酸载玻片上粘附后，根据所描述的免疫组化方法，用pRb Ab抗gfap对切片进行免疫染色(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，在4°C下ON，并在rt下用Alexa氟488结合的二抗显示45分钟。然后，使用RNAscope对相同的载玻片进行RNA ISH处理gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba2.5 HD试剂盒- red [ACD, 322360]。切片(1)在预处理1 (HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)，在RT下播放60分钟;(2) PBS冲洗(4 × 1 min);(3)室温干燥1h;(4)在预处理2目标检索试剂(ACD, 322330)中于99-104℃孵育7 min;(5)在HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (2 × 1 min);(6)室温干燥10min;(7)用100%乙醇浸渍风干;(8)用ImmEdge疏水屏障笔(ACD, 310018)划出疏水围栏;(9)预处理3(蛋白酶，预处理试剂盒);ACD, 322330)在湿度控制托盘/载玻片架(ACD, 310014)的EZ杂交烘箱(ACD, 310012)中40°C下保温15分钟;(10) H洗涤(4 × 1 min)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO为1分钟;(11)小鼠探针孵育gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba(4滴/部分;ACD, 311791)在40°C下保温2小时;(12)在1 ×洗涤缓冲液(ACD, 310,091)中洗涤(2 × 1 min)。放大(Amp)和检测进行了使用RNAscope 2.5高清试剂Kit-RED (ACD 322350)湿度控制托盘/滑架按照下列孵化步骤:Amp1 30分钟在40°C, Amp2 15分钟40°C,手臂在40°C, 30分钟Amp4 15分钟40°C,在RT Amp5 30分钟,Amp6 15分钟在RT,每一步孵化后,部分在洗冲洗缓冲(2×2分钟)。在Fast-Red-A和Fast-Red-B溶液中以1:60的比例孵育10分钟，在室温下检测ISH信号gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO (2 × 2分钟)，用Sytox Green反染(在PBS中稀释1:5 k, 10分钟;赛默飞世尔科学公司)，最后盖上延长钻石防褪色支架(赛默飞世尔科学公司，P36961)。切片在Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems)下使用顺序扫描程序检测Alexa 488和Fast-Red的荧光信号。gydF4y2Ba

的形态学分析gydF4y2Ba

ccl2染色小胶质细胞的形态计量学分析gydF4y2Ba

在发病24小时，对EAE感染小鼠(n = 4,3片)和EAE msc治疗小鼠(n = 4,3片)的ccl2染色脑切片进行形态计量学分析。两名独立观察员(GL和FG)，盲法分组，使用计算机辅助形态测量和ImageJ软件(NIH, Bethesda, USA)在63倍放大镜下对随机选择的视场进行评估。用FracLac插件(gydF4y2Bahttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/flhelp/introduction.htm.1999 - 2013gydF4y2Ba)作为“凸壳区域”，后者由连接细胞过程最末端点的直线创建的多边形确定。“圆度”(单元面积与具有相同周长的圆面积之间的比率)和“端点数量”(过程终端/刺的数量)gydF4y2Ba每gydF4y2Ba分别使用FracLac插件和Analyze Skeleton (2D/3D)插件(Arganda-Carreras, Fernández-González, Muñoz-Barrutia， & ortizs - de - solorzano, 2010)对单个二进制表达ccl2的小胶质细胞轮廓进行评估。校正后的CCL2总免疫荧光密度也计算为积分密度−[图像面积×背景读数的平均荧光]，用任意单位(AU)表示(gydF4y2Bahttps://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.htmlgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

形态学分析采用SALL1/IBA1-和GFAP/ ccl2染色gydF4y2Ba

对naïve的脑切片进行形态计量学分析(n = 3;各3节)，eae影响(n = 4;EAE MSC-treated (n = 4;发病24 h后，每组3个切片。SALL1/IBA1-和GFAP/ ccl2染色切片上的细胞计数由两名独立观察者(GL和TA)使用Aperio ImageScope (Leica Biosystems)进行，并计算SALL1的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ IBA1¯SALL1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, SALL1¯/ IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaGFAP¯/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, GFAPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, GFAPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba在3个随机选择的字段中计数的总单元格上¯gydF4y2Ba每gydF4y2Ba切片，在40倍放大下获得。数据以百分比值报告。SALL1和gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba随机选取3个场进行荧光强度测定gydF4y2Ba每gydF4y2Ba使用Cell^F (Olympus Italia, Rozzano, Italy)以40倍倍率获得的切片。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有定量数据均以平均值±SD表示。ccl2染色的小胶质细胞形态计量学分析采用非配对t检验。IBA/SALL1或GFAP/单双阳性细胞百分比gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba采用常规双因素方差分析进行统计学分析，而SALL1或gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba采用单因素方差分析进行统计学分析。对于这两种方法，Bonferroni交换方向后测被应用于修正多重比较(GraphPad Prism, GraphPad Software, Inc.)。alpha为0.05作为显著性的截止值。gydF4y2Ba

通过免疫组化分析naïve, EAE和EAE msc处理小鼠的新皮质选择性细胞标记物和CCL2gydF4y2Ba

作为初步方法，我们在发病24 h后处死实验组，观察eae感染小鼠新皮层炎症的一般程度。对巨噬细胞/小胶质细胞标志物CD45和IBA1以及CCL2抗体进行单次和双次免疫染色(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在eae感染小鼠的新皮层中，观察到的少量细胞浸润主要由变形虫CD45组成gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba单核细胞/巨噬细胞分散在皮层，而分枝，CD45gydF4y2Ba^低gydF4y2Ba激活的小胶质细胞几乎检测不到[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa). IBA1免疫染色能更好地显示小胶质样细胞，在皮质层中显示大量分支细胞(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).皮层下白质CD45/CCL2双免疫染色显示变形虫、CD45浸润gydF4y2Ba^高gydF4y2Ba/ CCL2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba单核/巨噬细胞，连同血管周围和血管旁分支，CD45gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CCL2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质样细胞(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Bac);在皮层最深处的边缘，有大量的IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CCL2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba血管实质和血管周围/血管旁小胶质样细胞主要分布于毛细血管和毛细血管后小静脉血管场(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).应该牢记gydF4y2BaIba1gydF4y2Ba已知由侵入脑的单核细胞表达，但只有在这些单核细胞进入脑实质并成熟后才表达[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

根据这些初步结果，通过IBA1/CCL2双染色对eae影响的msc处理和未处理的小鼠以及naïve对照组的新皮层小胶质细胞激活进行分析(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。在后者中，IBA1的微弱染色是监视性小胶质细胞的特征，而除了新皮层微血管壁外，任何CCL2免疫信号都可以在整个实质中检测到，其内皮细胞显示出趋化因子的组成性和普遍表达(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Baa).在eae感染小鼠中，大量的IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CCL2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba观察到细胞肥大体和多个短而多刺的突起(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)，而在EAE msc处理小鼠中，IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CCL2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞的活性形态减弱(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac;另见形态计量学分析段落)。有人强调，实质或血管周围巨噬细胞与“真正的”常驻小胶质细胞之间的形态和表型分化仍然是一个主要挑战[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。然而，当观察超微结构细节时，活化的小胶质细胞与骨髓细胞和组织巨噬细胞不同，其突起表面有尖刺[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]，这一特征可以通过共聚焦显微镜很好地识别，并支持将这些细胞识别为小胶质细胞(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab, c)。gydF4y2Ba

为了研究CCL2在星形胶质细胞和NG2-胶质细胞中的表达，分别对特异性细胞标记物GFAP和NG2进行了双重免疫染色。NG2是一种主要的中枢神经系统硫酸软骨素蛋白聚糖，由少突胶质前体细胞(OPCs)和NG2胶质细胞(成体OPCs)以及未成熟/再活化的周细胞表达[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。现在已知NG2-胶质细胞对中枢神经系统损伤的反应可能以NG2的过度表达为特征的激活/去分化状态[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。双免疫标记实验表明，CCL2从未与NG2在NG2胶质细胞上共定位(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa - c)。在EAE过程中，NG2-胶质细胞表现出一种活化的表型，其特征是肥大、广泛突起数量增加和强烈的NG2染色(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab, c)。此外，在eae影响小鼠的新皮层中，可识别的NG2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ CCL2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba巨噬细胞/小胶质样细胞也被检测到，与NG2紧密混合gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞体和突起(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab, c)。gydF4y2Ba

GFAP是星形胶质细胞的经典标志物，在星形胶质细胞形成状态下增加，这是星形胶质细胞对神经损伤的反应的特征[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]。GFAP/CCL2双免疫染色在naïve或eae影响小鼠的星形细胞中均未检测到趋化因子(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa - c)。有趣的是，可检测的连续CCL2染色显示naïve小鼠的新皮层微血管(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一个;也见Figs。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一个和gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).通过CCL2和IV型胶原(COL IV)(血管基板的主要分子成分)或CD31(内皮细胞特异性标记物)的双重染色，在所有实验组中进一步研究了这方面。分析表明，在naïve小鼠的新皮层中，存在CCL2的构成性内皮表达(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2a、d、g;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3a)，在两个受eae影响的国家(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2b、e、h;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba图S3b)和受eae影响的MSC-treated(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2c, f, i;额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3c)小鼠。不出所料，在eae影响小鼠新皮层的GFAP/CCL2双染色切片上，星形胶质细胞表现出星形胶质增生的形态学特征，细胞肥大，GFAP过表达(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).肥大星形胶质细胞表现出粗壮的突起，并与CCL2的压倒性存在共享其血管周围位置gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从未与GFAP共定位的细胞过程(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab).受eae影响的msc处理小鼠的星形胶质细胞形成水平下降，微血管壁上再次出现更精细的星形胶质细胞突起和终足(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).在这些治疗小鼠的新皮层中，神经元周围的CCL2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与eae影响的未治疗小鼠相比，这些过程也减少了(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab, c;另见形态计量学分析段落)。gydF4y2Ba

证实活化的小胶质细胞是CCL2的来源gydF4y2Ba

考虑到CCL2的形态特征gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在eae感染小鼠的新皮层中观察到分叉/刺状细胞，并且CCL2从未与ng2胶质细胞或GFAP共定位gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba我们使用了小胶质细胞特异性标记物，如TMEM119和SALL1 [gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba来证明和监测“真正的”小胶质细胞。在naïve小鼠的新皮层中，CCL2/TMEM119双染色显示了CCL2的精细分支gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ TMEM119gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba监视小胶质细胞(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, d, g)，而在eae影响的小鼠中，在所有考虑的时间点，这两种标记物都在活化的小胶质细胞上共定位，其特征是存在突出的、短的细胞过程和CCL2的强表达(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bab, e, h)。早在静脉注射eae感染小鼠MSCs后6 h，小胶质细胞增生减少，小胶质细胞上CCL2染色强度微弱(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac, f, i)。在一些小胶质细胞中，CCL2表达强烈下调，尽管没有完全消除，TMEM119染色盛行，从而证实了MSCs处理减弱了活化的小胶质细胞的表型(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac, f, i)。总之，双重CCL2/TMEM119免疫染色明确证实，在eae影响小鼠的新皮质层中出现激活和分散的分支细胞群，以及集中在血管周围区域的细胞群，是“真正的”常驻小胶质细胞。gydF4y2Ba

小胶质细胞也通过小胶质细胞特异性标记物SALL1进行鉴定(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，一种锌指转录抑制因子，属于sall样转录因子家族，参与大脑皮层神经发生。与其他巨噬细胞群体相比，SALL1在人和小鼠小胶质细胞中特异性表达，其在小胶质细胞中的缺失与促炎和吞噬表型的出现有关[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。此外，利用SALL1在细胞核中的不同位置gydF4y2BavsgydF4y2Ba．我们能够对不同的小胶质细胞和单核细胞/巨噬细胞群体进行比较、形态计量学分析(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa-d)，即SALL1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ IBA1gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba, SALL1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba，和SALL1gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba，分别对应静息小胶质细胞、活化小胶质细胞和单核/巨噬细胞(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).形态计量学分析显示，如预期的那样，SALL1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ IBA1gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba观察性小胶质细胞是naïve对照小鼠皮层中的主要群体(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa, d)，这一特征反映在eae影响的msc处理小鼠中(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac, d)，这与未治疗的eae影响小鼠中检测到的静息小胶质细胞的百分比形成鲜明对比(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab, d).在后者中，SALL1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba激活的小胶质细胞占主导地位，而这种群体在MSC治疗后强烈减少，甚至低于naïve小鼠中观察到的水平(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad). SALL1gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞/巨噬细胞数量在EAE中升高，但MSC治疗不受影响(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).检测到的SALL1的荧光强度值表明，在eae影响的小鼠中，SALL1的表达减少，而在eae影响的msc处理的小鼠中，SALL1的表达增加，甚至高于naïve小鼠(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

双IHC/ISH RNAscope技术在GFAP蛋白中的应用gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba信使rna分析gydF4y2Ba

双RNAscope方法使我们能够通过GFAP免疫染色在蛋白水平上鉴定星形胶质细胞，同时评估它们的表达gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba在mRNA水平(图2)gydF4y2Ba7gydF4y2Baa - c)。GFAP的个数gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, GFAPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和GFAPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在随机选择naïve、eae影响和eae影响的msc处理小鼠的新皮质场上计算细胞数量(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad).结果表明，MSC治疗可有效抵消GFAP和GFAP的升高gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质细胞/单核细胞/巨噬细胞与GFAPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^+gydF4y2Baeae影响小鼠的星形胶质细胞(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad). GFAP个数gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba受eae影响的msc处理小鼠的新皮层星形胶质细胞增加，达到naïve小鼠的水平(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad).这些数据支持我们最近在体外的观察，即MSCs产生的可溶性因子能够减少gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba在反应性星形胶质细胞和体内的表达，表明MSCs治疗可以抵消A1型神经毒性反应性星形胶质细胞在eae影响小鼠大脑中的有害流行[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。的值与形态测量结果一致gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba以mRNA探针的荧光强度计算，在naïve和受eae影响的msc处理小鼠中表达相似，而在受eae影响的未处理小鼠中表达明显更高(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

活性CCL2的形态计量学分析gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小神经胶质细胞gydF4y2Ba

术语小胶质细胞增生描述了监视小胶质细胞的形态/功能和区域依赖的动态反应，这些小胶质细胞能够将其形态改变为超分支/超复杂(中间活化，肥大，浓密)形式和/或完全缺乏过程的细胞(未分支，变形虫)[]gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。小胶质细胞的形态功能激活可能是区域依赖的，并且在大脑皮层区域之间也存在差异，在大脑皮层区域，反应性、肥厚的小胶质细胞可能导致功能失调的神经元[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

研究了新皮质小胶质细胞形态学，根据选择的形态学参数，如小胶质细胞凸壳面积、圆度、终点数和免疫荧光综合强度，在发病24小时内，对接受或未接受MSC治疗的eae感染小鼠的新皮质ccl2染色切片进行研究，寻找MSC治疗和未接受eae感染小鼠之间细微的形态学变化。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。结果显示，小胶质细胞的激活以细胞肥大和多种形态特征为特征，CCL2的弥漫和强表达揭示了这一点(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bab, d)。在eae影响的小鼠中，小胶质细胞反映了新皮层神经炎症的状态，获得了相对较大的体和复杂的分支形式，具有弯曲、较厚的初级突起，末端呈细丝状，二级和三级分支呈多刺状(图3)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bad). MSC给药似乎减少了小胶质细胞的激活，使细胞形态向肥厚程度较低的方向恢复，并下调了CCL2的表达(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac).形态计量学分析显示，MSC EAE的平均小胶质细胞凸壳面积(即包含单个小胶质细胞的多边形面积)显著减少(1149.02±150.49 μm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(3357.1±569.28 μm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba；gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0003;n = 4)只小鼠，表明MSC治疗对小胶质细胞肥大的有益作用。第二个选择的形态计量参数，即细胞圆度(即细胞面积与具有相同周长的圆面积之比)，与EAE影响的(0.77±0.07)相比，EAE msc处理的(0.66±0.02)也显著降低;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.031)，在后者中，表现出以粗壮，多刺的过程为特征的形态。端点的数量(流程终端/荆棘的数量)也证实了这一特征gydF4y2Ba每gydF4y2Baeae影响组(61.78±26.08)显著高于eae影响组(29.08±1.62);gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.046)小鼠。这些差异突出了eae影响小鼠的新皮质小胶质瘤状态，这种状态在MSC治疗后减弱。除形态学值外，CCL2染色的程度，以校正的总免疫荧光密度计算，显示eae影响小鼠的CCL2高值(5500,079±198,773 AU)， eae影响的mscs处理小鼠的CCL2稳定下降(146,950±44,333 AU;gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0075);它们与表达水平相关，通过评估得到gydF4y2BaCcl2gydF4y2BamRNA荧光强度见图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bad).正如在eae影响小鼠中获得的显着降低的值所表明的那样，基于msc的治疗减弱了新皮质小胶质细胞的反应谱，减少了超分支/超复杂的形态方面和CCL2的表达。gydF4y2Ba

活化CCL2的深入分析gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质细胞与新皮层微血管的相互作用gydF4y2Ba

小胶质细胞作为定义中枢神经系统神经血管单元(NVU)的细胞群之一，在生理和病理条件下与所有其他NVU细胞组分相互作用，主要是星形胶质细胞，它们与星形胶质细胞共享血管周围/血管旁的位置，靠近基底层的实质层。gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。在CCL2/GFAP双染色皮层场上显示相互作用和互易位置，在共聚焦投影图像上进行分析，并在更高分辨率下，在z轴图像堆栈的单个光学平面上进行分析。(无花果。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。在eae感染小鼠的新皮层中，神经元周围和血管周围的星形胶质细胞-小胶质细胞的关系反映了新皮层星形胶质细胞/小胶质细胞的严重状况。皮质神经元被小胶质细胞包裹(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Baa)和绝大多数血管周围CCL2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质突侵入NVU内，使血管周围星形胶质细胞包膜加倍。gydF4y2Ba9gydF4y2Baa-c)，或直接接触血管壁的广泛束(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Bad-f)。小胶质细胞血管周围鞘的主要特征是“多刺”过程，使微血管轮廓呈现出尖尖的外观(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Baa, f). CCL2广泛传播的炎症情景gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质细胞受到MSC治疗的影响，这似乎减少了皮层实质和微血管界面中反应性小胶质细胞的存在，这已经在最早的检查阶段(发病/注射MSC后6小时)。gydF4y2Ba9gydF4y2Bag-i)和随后的时间间隔(MSC治疗后24小时和10天)(数据未显示)。对这些小鼠新皮层微血管的深入分析表明，外层CCL2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba小胶质细胞过程几乎完全消失，而星形胶质细胞重建了它们的血管域，覆盖了广泛的血管束，并显示出减少的肥厚形态(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Bah, i)。根据这些数据，正常情况下NVU典型的血管周围星形胶质细胞与血管壁的紧密结合在MS患者中被描述为改变，其中大部分血管周围终足与血管壁分离，血管基板缺乏星形胶质细胞终足[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

评估mscs治疗和未治疗的eae影响小鼠的血脑屏障结构和功能特性gydF4y2Ba

血脑屏障破坏和功能障碍是众所周知的多发性硬化症的标志;它们的发生已被证明先于脱髓鞘病变的形成，并涉及白质和邻近的灰质以及正常的白质[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]。根据我们之前对同种mog诱导的EAE小鼠模型的研究，新皮层bbb微血管出现紧密连接拆除和通透性增加[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]。最近的研究表明，在eae影响的小鼠脊髓中，MSC治疗可以改善神经炎症，减少脱髓鞘，保护血脑屏障功能，增加TJ蛋白的表达(31)。此外，CCL2已被认为通过其受体CCR2存在于脑血脑屏障内皮细胞上，作为一种通透性诱导分子发挥作用[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba]，可能在eae感染小鼠的新皮层中观察到的血脑屏障破坏中起作用。在后者中，claudin-5和occludin均显示不连续的染色模式(图2)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。在最早的检查时间点，即发病后6小时，观察到结拆除的各个方面，并且在10天内仍然可以检测到(图2)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和gydF4y2Ba11gydF4y2Baa, c, e)。MSC治疗可能有助于维持claudin-5和occludin链的线性和连续连接排列(图2)。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和gydF4y2Ba11gydF4y2Bab、d、f)。因此，eae影响小鼠的fitc -葡聚糖和GFAP免疫染色的渗透性实验显示，新皮层微血管缺乏血管周围星形细胞终足，并因示踪剂外渗而呈现晕状(图2)。gydF4y2Ba12gydF4y2Baa, c)。在EAE msc处理的小鼠中，fitc -葡聚糖似乎仅限于血管管腔，典型而强健的星形胶质细胞包裹在血管壁上(图2)。gydF4y2Ba12gydF4y2Bab, d)。gydF4y2Ba

小胶质细胞是新皮层神经炎症中CCL2的常驻来源gydF4y2Ba

一些研究集中在揭示炎症条件下CCL2的细胞来源，包括多发性硬化症和EAE。在完整的中枢神经系统中，原位杂交显示，在EAE中，CCL2由神经元和星形胶质细胞表达[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]，从而对腹腔微血管侧产生的趋化因子的内皮胞吞机制打开了视野[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。使用双细胞(星形细胞和内皮细胞)条件CCL2敲除小鼠进行的高级细胞源研究后来证实，这两种细胞类型都表达趋化因子[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]。此外，根据CCL2的内皮细胞或星形细胞起源，CCL2在炎症不同阶段的细胞外溢中已被证明具有特定作用[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]。然而，如何调节和平衡细胞特异性来源的CCL2池的差异活性仍不清楚[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]。eae感染小鼠条件性基因缺失gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba与野生型eae感染对照相比，星形胶质细胞中巨噬细胞和t细胞炎症较少，星形胶质细胞和小胶质细胞弥漫性活化较少，晚期病情较轻，发病时发病率和病情严重程度相似[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]。然而，其他常驻细胞和非实质细胞类型的贡献不能排除，作为全球敲除小鼠gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba用抗ccl2抗体治疗的野生型小鼠表现出较轻的实验性神经炎性疾病[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

目前尚不清楚多发性硬化症的大脑皮层病变是否涉及CCL2的表达，因为在描述CCL2表达的研究中没有描述皮层病变的特征(17)，并且在评估包括大脑皮层在内的不同脑区在全身性神经炎症实验条件下的促炎细胞因子水平的研究中，也没有研究CCL2表达与小胶质细胞激活的关系[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba]。在本研究中，我们已经证明，在eae影响小鼠的新皮层中，尽管白细胞迁移很少，但神经炎症的特征是CCL2的显著表达，并在整个新皮层中扩散。基于一系列免疫组织化学和原位杂交分析，我们发现CCL2的主要来源是“真正的”常驻小胶质细胞，它们表现出活化和反应性，非变形虫表型，并表达高水平的趋化因子。小胶质细胞作为常驻中枢神经系统巨噬细胞，在新皮层神经炎症中发挥关键作用，通过迅速激活来响应病理损伤。然而，尽管在个体发育上与单核细胞来源的巨噬细胞不同，但由于缺乏特异性标记物，无论其静止状态还是激活状态，驻留小胶质细胞的鉴定总是失败的。事实上，激活的小胶质细胞和分支的脑巨噬细胞在形态学和细胞表面标记上几乎无法区分，即使是最常用的小胶质细胞标记之一，离子钙结合适配器分子1 (IBA1)，也不能区分驻留的小胶质细胞和浸润的血源性巨噬细胞[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba]。最近，佐藤和同事[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]，研究小鼠小胶质细胞转录组数据集，确定gydF4y2BaTmem119gydF4y2Ba作为一种可靠的小胶质细胞特异性标记物，不被其他免疫细胞表达，在所有小胶质细胞群(静止、激活、变形虫)中均可检测到。同年，butgereit和同事[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba发现了一种小胶质细胞特征基因，gydF4y2BaSall1gydF4y2Ba在单核细胞/巨噬细胞系统中不表达，仅限于造血室和中枢神经系统中的小胶质细胞，在成人静息小胶质细胞表型的控制中起关键作用。我们利用这两种可靠的小胶质细胞标记物，证明在eae影响小鼠的新皮层中，CCL2免疫染色细胞共同表达这两种标记物，证实这些新皮层细胞是“真正的”常驻小胶质细胞。有趣的是，msc处理对CCL2表达的“关闭”效应，使TMEM119中的反应性小胶质细胞恢复gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ CCL2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba转到TMEM119gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/CCL2¯表型，轻度炎症，尽管有细胞肥大的迹象。用SALL1获得的结果与这些数据一致，SALL1的表达可以对新皮层的神经炎症状态进行评分。SALL1的表达已经在EAE神经炎症中进行了研究:在这种情况下，小胶质细胞维持了gydF4y2BaSall1gydF4y2Ba转录特征，似乎不是由中枢神经系统微环境诱导的，不同于中枢神经系统入侵的髓细胞，包括募集的中性粒细胞和单核细胞来源的细胞，也不同于小胶质细胞剥夺后的小胶质样细胞[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。我们分析了SALL1和IBA1细胞群，发现eae感染小鼠的新皮层中主要存在SALL1细胞群gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/ IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在同一种群中，msc处理有效地降低了SALL1的百分比gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba/ IBA1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞/巨噬细胞在msc处理和未处理的小鼠中没有变化。根据荧光强度测量结果，发现eae感染小鼠的SALL1免疫染色降低，而eae感染的msc处理小鼠的SALL1免疫染色甚至明显高于naïve小鼠。有趣的是，脑切片的免疫组织化学gydF4y2BaSall1gydF4y2Ba^{GFP / +gydF4y2Ba}小鼠研究表明，在胚胎发生过程中，神经元和神经胶质祖细胞表现出高表达gydF4y2BaSall1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba83gydF4y2Ba]。这些数据，连同报道的SALL1作为小胶质细胞非反应状态的转录调节剂的作用，能够沉默中枢神经系统的炎症程序[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]，表明间质干细胞治疗在从活化小胶质细胞向稳态小胶质细胞转变，进而向保护性发育小胶质细胞亚群转变的过程中至关重要[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在本研究中，在确定小胶质细胞为CCL2来源的同时，共定位实验和IHC/ISH分析表明，其他细胞也表达CCL2，尽管水平很低。正如预期的那样，CCL2与静脉、血管周围浸润的单核细胞/巨噬细胞/小胶质细胞标记共定位，在eae影响的小鼠和未治疗的小鼠中，在最深皮层层和皮层下白质之间的边界观察到CCL2，在naïve小鼠的新皮层微血管上与内皮细胞CD31共定位。此外，对蛋白质(GFAP)和mRNA (gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba)水平，显示GFAP亚群gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在eae影响的小鼠和未治疗的小鼠中，两个实验组之间没有差异，而在eae影响的msc治疗的小鼠中，GFAP的种群gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba在受eae影响的小鼠中最低，上升到与naïve对照组相同的水平。可以想象，MSCs可能会影响神经毒性A1星形胶质细胞和保护性A2星形胶质细胞之间的关键平衡。这两种相反的表型可能包含在检测到的GFAP中gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(A1)和GFAPgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba/gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba(A2)星形胶质细胞亚群，后者在eae影响的msc治疗小鼠中增加，因此可能参与降低新皮层炎症水平。gydF4y2Ba

新皮质小胶质细胞增生中的小胶质细胞激活，中间和反应状态gydF4y2Ba

小胶质细胞是巨噬细胞样的常驻免疫细胞，不仅作为抗原呈递细胞，而且在神经系统疾病中也是效应细胞。活化的小胶质细胞(小胶质细胞增多症)的积累是神经退行性疾病的主要病理标志[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba]。高动态监视小胶质细胞在稳态状态下不断探索其周围环境的概念，激活(反应性)小胶质细胞在几乎任何一种中枢神经系统病理反应中呈现多种形式。在体内，小胶质细胞激活导致细胞超分枝(中间阶段)和/或反应性肥大表型，伴有细胞体肿胀、近端突起增厚、远端分枝减少、双极/三极小胶质棒细胞形成和细胞聚集[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。最终，小胶质细胞可能在形态上转变为像脑巨噬细胞一样的大变形虫形式。后一种“经典活化”的小胶质细胞类型被认为对髓磷脂的吞噬、抗原向T细胞的呈递以及活性病变中促炎细胞因子的释放至关重要[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba，gydF4y2Ba89gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba，gydF4y2Ba92gydF4y2Ba，gydF4y2Ba93gydF4y2Ba]。关于小胶质细胞在中间/肥大激活状态下的更微妙的形态特征，这些已经被量化，应用多重分形分析来评估这些细胞通过扩展和收缩精细和粗大过程所能采用的形式，以及它们在生理和病理条件下的各种作用。gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。因此，“蜘蛛状”、分枝状监视细胞和“无定形斑点”、去分枝反应性/变形虫小胶质细胞只是各种复杂形态的对立面，在任何一点都是动态可逆的，这取决于病理状况/位置的变化。gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。在其反应性增生性和非阿米巴样形态下，小胶质细胞释放细胞因子/趋化因子，包括CCL2、CCL5、核酸、兴奋性氨基酸、活性氧、TNF-α、转化生长因子β (TGF-β)、干扰素γ、IL-1α、-5、-6、-10、-12、-18、巨噬细胞炎症蛋白1α、金属蛋白酶、一氧化氮和过氧亚硝酸盐[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba]。研究表明，在这些分泌因子中，IL-1α、TNF-α和补体成分1、子成分q (C1q)都是体内诱导神经毒性A1星形胶质细胞所必需的启动因子gydF4y2Ba，gydF4y2Ba且A1星形胶质细胞仅在抗炎TGF-β或成纤维细胞生长因子(FGF)作用下数量显著减少[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba]。根据这一证据，可以假设间充质干细胞的作用是由一种可能仍然未知的保护性A2表型诱导剂介导的(参见[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

新皮质小胶质瘤，神经元和血脑屏障功能障碍gydF4y2Ba

在mog诱导的EAE中，表达ccl2的小胶质细胞围绕皮层神经元，这是谷氨酸能神经元功能失调的潜在信号[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba]。事实上，正如多种神经系统疾病(包括神经退行性疾病)所证明的那样，这些疾病以一种称为“兴奋性神经毒性”的神经毒性为特征，激活的增生性小胶质细胞在神经元周围积聚，并通过释放谷氨酸损害皮层谷氨酸能通路，从而导致认知缺陷、精神分裂症和双相情感障碍的发病机制[gydF4y2Ba94gydF4y2Ba]。值得一提的是，在精神分裂症的“小胶质细胞假说”中，该疾病发生在多发性硬化症患者中，伴有相关额颞叶病变(> 60%)[gydF4y2Ba97gydF4y2Ba，gydF4y2Ba98gydF4y2Ba]，在eae感染小鼠的新皮层中观察到ccl2驱动的小胶质细胞增生，支持了这一发病机制。gydF4y2Ba

微血管小胶质细胞增生似乎表现出与皮层神经元中扩散的小胶质细胞相同的“侵袭性”。因此，在受eae影响的小鼠中，在微血管水平上，通过CCL2高表达可识别的增厚性小胶质细胞围绕微血管壁形成几乎连续的包膜，与胶质细胞上的血管周围星形胶质细胞竞争gydF4y2BalimitansgydF4y2Ba前面。新皮层血管周围和血管旁释放的CCL2[获得细长构象的血管周围小胶质细胞的中间形式，区别于血管周围分枝小胶质细胞]gydF4y2Ba62gydF4y2Ba[]小胶质细胞亚群可能以自分泌和旁分泌的方式起作用，可能通过CCR2受体涉及NVU的所有细胞成分，包括内皮细胞和周细胞、血管周围星形胶质细胞、OPCs和巨噬细胞。在人类血脑屏障和HIV感染的体外模型中已经证明，内皮通透性的增加不仅仅是通过添加CCL2，而是通过CCL2梯度的存在，CCL2梯度与血脑屏障的破坏相关，如修饰的紧密连接蛋白和增强的血管通透性[gydF4y2Ba99gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在观察到的微血管小胶质瘤中，小胶质细胞CCL2梯度的流行可能与内皮细胞CCL2的表达水平有关。与我们的观察结果一致，在正常条件下，内皮细胞组成性地表达可检测到的CCL2水平[gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba];然而，在神经炎症期间，内皮细胞CCL2的表达似乎下调，而血管周围微环境中存在大量小胶质细胞来源的CCL2。利用体外培养的脑微血管内皮细胞，观察到外源性添加CCL2抑制内源性CCL2的释放，并进一步引起CCL2的降低gydF4y2Ba这有点难度gydF4y2Ba内皮细胞mRNA水平[gydF4y2Ba101gydF4y2Ba]。很难解释在生理条件下内皮细胞中观察到的CCL2基线水平的原因，尽管它可以中和免疫细胞上存在的CCR2受体，从而阻止它们进入中枢神经系统。在EAE过程中，由于CCL2在新皮层微血管周围的大量存在，以及内皮细胞从管腔到管腔血管侧对CCL2的摄取增强，可能会产生类似的“矛盾”效应[gydF4y2Ba101gydF4y2Ba，gydF4y2Ba102gydF4y2Ba]。小胶质细胞对CCL2的血管周围释放和趋化因子的光腔内皮运输的共同作用可能在新皮层实质和血流之间产生浓度梯度;这将增加CCL2在管腔内皮表面的外排和血液中趋化因子的水平，因为组成型CCL2是通过内皮细胞以ccr2依赖的方式摄取从血液中清除的[gydF4y2Ba103gydF4y2Ba]。尽管CCL2分泌被表达ccr2的细胞不断摄取和内化所抵消，但在疾病环境中，CCL2清除的有效性取决于这种临界平衡(内皮细胞在清除血液中多余的CCL2时效率低下，其速度与CCL2外排的速度相等)，这很容易被过剩的CCL2损害。这可能决定了CCL2的分泌和ccr2介导的摄取之间的不平衡，因此CCL2血液水平的增加和促炎趋化因子在中枢神经系统所有区域的扩散[gydF4y2Ba103gydF4y2Ba]。此外，在没有炎症浸润的情况下产生CCL2的区域，这种解离可能是由于经转胞切的CCR2使内皮细胞CCR2内化和脱敏，这种情况被认为会损害跨内皮细胞的迁移[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在eae影响小鼠的新皮层中观察到的血脑屏障破坏，以及在eae影响的msc治疗小鼠中记录的屏障迅速恢复，也可以分别由小胶质细胞来源的CCL2和治疗相关的小胶质细胞增生控制介导。众所周知，CCL2可以在多种病理条件下介导血脑屏障破坏[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba104gydF4y2Ba]，包括通过紧密连接蛋白和紧密连接相关蛋白的亚细胞重分布以及RhoA/蛋白激酶C-α通路的参与[gydF4y2Ba105gydF4y2Ba]。正如已经证明的，在脑内皮细胞的多次培养中，周细胞和星形细胞衍生的CCL2主要是管腔的[gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba]，小胶质细胞衍生的CCL2可能在管腔室中高水平存在，遵循与星形胶质细胞-周细胞串导和内皮细胞运输相同的机制。一个有趣的推测是，MSCs的旁分泌作用是否以及在多大程度上可以通过分泌神经保护分子来保持血脑屏障的完整性，减少神经炎症和ccl2驱动的小胶质细胞增生[gydF4y2Ba106gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

小胶质细胞对MSCs治疗EAE的反应gydF4y2Ba

在多发性硬化症的临床前模型中，骨髓来源的间充质干细胞已被证实具有治疗效果[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba107gydF4y2Ba，gydF4y2Ba108gydF4y2Ba]，是一种治疗影响器官(如大脑)的疾病的非侵入性方法。描绘区域依赖性小胶质细胞亚型对于进一步了解细胞亚群对疾病的异质反应和差异贡献尤为重要。我们在mog诱导的EAE中的结果支持了这一概念，其中小胶质细胞而不是星形胶质细胞在维持神经炎症和可能的神经元损伤和血脑屏障损伤中起主要作用。经MSCs治疗后，eae感染小鼠新皮层中观察到的大量小胶质细胞增生似乎得到了有效抵消，细胞肥大减少，IBA1和gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba/CCL2表达增加，神经保护性SALL1增加，NVU相邻突减少。因此，小胶质细胞直接对间充质干细胞治疗作出反应，或通过最近被证明对间充质干细胞治疗有反应的星形胶质细胞等驻留细胞效应物间接作出反应，重新获得干细胞特性并发挥保护和修复作用[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。在体外的小胶质细胞和间充质干细胞共培养中，MSCs对小胶质细胞表型的直接调节已被证明[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。在这种情况下，直接的msc -小胶质细胞旁分泌串扰会损害小胶质细胞的激活并抑制炎症分子的表达和释放，将小胶质细胞从有害表型转变为神经保护表型。gydF4y2Ba

本研究中最重要的发现之一是，在EAE过程中，作为对神经炎症信号的反应，新皮层小胶质细胞增生的状况与中间/肥大和表达ccl2的小胶质细胞在影响神经元和微血管成分中的作用之间存在明确的关联。Nimmerjahn和他的同事[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba研究表明，即使在假定的静息状态下，小胶质细胞也会迅速激活，不断改变其过程的位置、数量和形状，血脑卒中破坏会立即激活小胶质细胞，而不一定是变形虫形态的改变。也有人认为，趋化因子的存在并不一定意味着它对任何部位的受体都可用，以促进淋巴细胞的募集;Th2细胞通过其群体选择性趋化因子CCL2、CCL7和CCL8不被同样地招募到中枢神经系统[gydF4y2Ba109gydF4y2Ba]。为了充分了解小胶质细胞和小胶质细胞衍生的CCL2在EAE和MS中的作用，有必要将免疫细胞募集功能与其他对神经元和血管新皮层成分的关键作用区分开来。更好地了解这些复杂的活动，可能会对影响新皮层内稳态、连通性和功能的神经退行性疾病的广泛治疗应用提出建议。gydF4y2Ba

在我们的研究中，我们使用了一种强大的方法，即基于RNAscope技术的双IHC/ISH方法，适用于厚的自由浮动脑切片。(46)，我们对其进行了部分修改(参见方法一章)。然而，特定细胞标记(即TMEM119和SALL1)的使用受到其表位对RNAscope协议的敏感性的影响。这导致细胞特异性染色消失，从而降低了伴随检测的有效性gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba．因此，CCL2表达的论证主要集中在GFAP检测的星形胶质细胞上gydF4y2BaCcl2gydF4y2Ba小胶质细胞mRNA表达是间接的。gydF4y2Ba

本研究中使用和/或分析的数据集可应通讯作者的合理要求提供。gydF4y2Ba

BBB:gydF4y2Ba

血脑屏障gydF4y2Ba

CCL2:gydF4y2Ba

C-C基序趋化因子gydF4y2Ba

CCR2:gydF4y2Ba

C-C基序趋化因子受体2型gydF4y2Ba

中枢神经系统:gydF4y2Ba

中枢神经系统gydF4y2Ba

运算单元:gydF4y2Ba

实验性自身免疫性脑脊髓炎gydF4y2Ba

GFAP:gydF4y2Ba

胶质纤维酸性蛋白gydF4y2Ba

IBA1:gydF4y2Ba

离子钙结合适配器分子gydF4y2Ba

包含IHC:gydF4y2Ba

免疫组织化学gydF4y2Ba

伊什:gydF4y2Ba

原位杂交gydF4y2Ba

MOG:gydF4y2Ba

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白gydF4y2Ba

女士:gydF4y2Ba

多发性硬化症gydF4y2Ba

msc:gydF4y2Ba

间充质干细胞gydF4y2Ba

NG-2:gydF4y2Ba

神经元-胶质抗原gydF4y2Ba

NVU:gydF4y2Ba

神经与血管的单位gydF4y2Ba

信息公开化:gydF4y2Ba

少突胶质前体细胞gydF4y2Ba

SALL-1:gydF4y2Ba

盐样蛋白1gydF4y2Ba

TMEM119:gydF4y2Ba

跨膜蛋白119gydF4y2Ba

套:gydF4y2Ba

紧密连接gydF4y2Ba

作者感谢文学士M.V.C. Pragnell提供的语言帮助;Antonella Bizzoca、Michelina de Giorgis和Francesco Fumai提供技术援助。gydF4y2Ba

意大利多发性硬化症基金会向非洲大学提供资助，巴里大学向DV提供校内资助，阿普利亚基金会向DV提供资助。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. Mariella Errede和Tiziana Annese两位作者对这项工作做出了同样的贡献gydF4y2Ba

2. 最后两位作者Nicole Kerlero de Rosbo和Daniela Virgintino对这项工作做出了同样的贡献gydF4y2Ba

作者及单位gydF4y2Ba

1. 巴里大学医学院基础医学、神经科学和感觉器官系，意大利巴里市Giulio Cesare广场，警察局，70124gydF4y2Ba

   Mariella Errede, Tiziana Annese, Giovanna Longo, Francesco Girolamo, Ignazio de Trizio, Antonio d 'Amati和Daniela virgininogydF4y2Ba

2. 卢姆大学医学与外科学系，意大利卡萨马西马巴里gydF4y2Ba

   iziana AnnesegydF4y2Ba

3. 意大利热那亚热那亚大学神经科学、康复、眼科、遗传学、妇幼保健系gydF4y2Ba

   Valentina Petrosino和Antonio UccelligydF4y2Ba

4. 意大利巴里巴里大学医学院病理科急诊与器官移植科gydF4y2Ba

   安东尼奥维'AmatigydF4y2Ba

5. IRCCS Ospedale Policlinico圣马蒂诺，热那亚，意大利gydF4y2Ba

   Antonio Uccelli和Nicole Kerlero de RosbogydF4y2Ba

6. TomaLab，意大利罗马国立科学院纳米技术研究所gydF4y2Ba

   Nicole Kerlero de RosbogydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

ME、TA、NKdR和DV对这项工作贡献相同。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba丹妮拉VirgintinogydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

所有涉及动物的程序均按照动物伦理委员会的指导方针进行，并遵守2014年3月4日第26号法令，即欧洲议会和理事会2010年9月22日关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/EU的立法转换。所有的努力都是为了尽量减少使用动物的数量。研究方案得到了圣马蒂诺医院动物实验伦理委员会和意大利卫生部的批准(批准号398和444)。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

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