多奈哌齐对Aβ的神经保护作用gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}全身的神经毒性gydF4y2Ba

目的gydF4y2Ba

本研究的目的是研究多奈哌齐对β-淀粉样蛋白的神经保护作用gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}(βgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba})诱发的神经毒性及其可能机制。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

PC12细胞常规培养。Aβ序列浓度gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}分别向PC12细胞中添加多奈哌齐(0、0.5、1、5、10、20、50 μmol/L)，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基- 2h -四溴唑(MTT)染色法检测各处理对PC12细胞活力的影响。在Aβ 20 μmol/L前2小时，分别用1、5、10、20、50 μmol/L多奈哌齐预处理pc12细胞gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}在预处理A、B、C、D、e组中添加20 μmol/L AβgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}选择-治疗组。采用MTT法检测PC12细胞活力，测定乳酸脱氢酶(LDH)水平。PC12细胞先用10 μmol/L GF109203X(一种蛋白激酶C [PKC]拮抗剂)预处理30 min，然后在预处理F组中加入10 μmol/L多奈哌齐，并选择正常对照组II、10 μmol/L GF109203X处理组和10 μmol/L多奈哌齐处理组。Western blotting检测磷酸化- pkc (P-PKC)及其主要底物磷酸化肉豆蔻酰化富丙氨酸蛋白C激酶底物(P-MARCKS)的表达。采用免疫荧光染色法检测多奈哌齐对PKCα和PKCε亚型亚细胞分布的影响。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

Aβ治疗gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}(5、10、20、50 μmol/L)作用24 h，显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)降低pc12细胞活力，呈剂量依赖性。与对照组PC12细胞相比，Aβ含量为20 μmol/L的细胞凋亡率最高gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}-处理组存活率较低，但LDH释放较高。与20 μmol/L Aβ相比gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}-处理组，前处理B、C、D、E组表现显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)可提高细胞活力，但显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)降低LDH释放。Western blotting结果显示，与对照组相比，10 μmol/L多奈哌齐促进PKC和MARCKS的磷酸化，预处理F组P-PKC和P-MARCKS的表达显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)低于多奈哌齐治疗组。免疫荧光染色显示PKCα和PKCε异构体主要位于PC12对照细胞的细胞质中，而多奈哌齐可增加PKCα和PKCε异构体在膜部分的表达。Western blot结果表明，多奈哌齐通过降低PKCα和PKCε亚型在胞质部分的表达，而增加PKCε亚型在膜部分的表达，改变了PKCα和PKCε亚型的亚细胞分布。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

多奈哌齐可拮抗AβgydF4y2Ba_{25 - 350gydF4y2Ba}PKC的激活可能解释了多奈哌齐的神经保护作用。gydF4y2Ba

阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，其特点是逐渐丧失记忆和认知功能，是老年人最常见的痴呆症[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．AD有两个病理特征:淀粉样β (Aβ)蛋白的细胞外沉积和细胞内磷酸化tau蛋白[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．Aβ肽的细胞外异常沉积导致海马老年斑的形成，这是AD与神经退行性变相关的病理特征[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．Aβ蛋白可能触发tau蛋白的过度磷酸化，引起轴突运输的损伤和微管的不稳定，导致神经元凋亡。Aβ蛋白的这种神经毒性是AD最重要的机制之一，因此抑制该蛋白的神经毒性是治疗AD的一种方法。目前，治疗AD的主要药物是乙酰胆碱酯酶抑制剂，它可以通过抑制乙酰胆碱变性来增强突触间隙中的胆碱能神经传递[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．作为FDA批准的经典乙酰胆碱酯酶抑制剂，多奈哌齐可在细胞和动物模型中提供症状缓解和对a β毒性的神经保护[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]，并阻止阿尔茨海默病患者大脑的进行性萎缩[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．然而，多奈哌齐的具体作用机制尚不清楚，特别是其对外源性Aβ的神经保护作用;然而，一些研究表明多奈哌齐可能会改变淀粉样前体蛋白的代谢，导致Aβ分泌减少[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．研究了多奈哌齐对Aβ暴露的大鼠嗜铬细胞瘤细胞(pc12)的影响gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}以及可能的机理。gydF4y2Ba

试剂gydF4y2Ba

多奈哌齐由卫材中国有限公司(苏州，中国)提供。一个βgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}，二甲基亚砜(DMSO)，小鼠单克隆抗-β-肌动蛋白抗体和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基- 2h -四唑溴化铵(MTT)由Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)提供。蛋白激酶C (PKC)抑制剂GF109203X由Calbiochem (San Diego, CA, USA)提供。Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)提供了一种兔多克隆抗磷酸化pkc (P-PKC)抗体和一种兔多克隆抗磷酸化肉肉蔻酰化富丙氨酸C激酶(MARCKS)抗体。小鼠单克隆抗pkc α和PKCε抗体由Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)提供。由Gibco (Carlsbad, CA, USA)提供Dulbecco 's改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素和胰酶- edta(乙二胺四乙酸)混合物。RIPA细胞裂解缓冲液由深能博材(上海，中国)提供。BCA蛋白检测试剂盒由Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)提供。ECL Western Blotting检测试剂盒由Amersham-Pharmacia生物技术公司(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)提供。gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

PC12细胞常规镀入含有10%胎牛血清、1%链霉素和1%青霉素的DMEM 100mm培养皿中。细胞在100%湿度和5% CO条件下培养gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37°C。当细胞融合达到80%时，丢弃培养基，用胰酶裂解细胞传代。取对数生长的细胞进行实验。gydF4y2Ba

MTT试验gydF4y2Ba

MTT法测定细胞活力。细胞以1 × 10的密度镀于96孔板中gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba每孔细胞。24小时后，多奈哌齐或AβgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}分别在0、0.5、1、5、10、20、50 μmol时，每个浓度设6个孔。同时，以无细胞培养基为空白对照。处理24小时后更换培养基，每孔加入180 μL培养基和20 μL 5 g/L MTT继续孵育4 h，弃用培养基，每孔加入200 μL DMSO, 37℃孵育30 min。评估细胞在570 nm处的吸收，并与对照组细胞的吸收进行比较，以确定细胞的相对活力。gydF4y2Ba

多奈哌齐预处理对细胞活力的影响gydF4y2Ba

细胞以1 × 10的密度镀gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba在96孔板中每孔培养细胞，24 h后分成正常对照组a βgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}-处理组，AβgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}加1、5、10、20、50 μmol多奈哌齐处理组。对于AβgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}加多奈哌齐组，加不同浓度的多奈哌齐，再加20 μmol/L AβgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}2小时后加入，进一步孵育24小时。然后用MTT法评估细胞活力(如上所述)。gydF4y2Ba

乳酸脱氢酶释放gydF4y2Ba

使用制造商的方案来检测受损细胞释放的乳酸脱氢酶。各组的处理和分类与上述相同。从各组中收集上清液，并在冰上添加蛋白抑制剂。将120 μL上清液转入酶标板。反应结束后，加入工质，室温孵育30min，在500 nm处测定吸光度。gydF4y2Ba

Western blot检测P-PKC和P-MARCKS的表达gydF4y2Ba

细胞以10的密度接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/mL在10cm培养皿中。将细胞分为正常对照组、多奈哌齐处理组、GF109203X +多奈哌齐处理组和GF109203X处理组。在GF109203X +多奈哌齐处理组和GF109203X +多奈哌齐处理组中加入10 μmol/L GF109203X后30分钟，在多奈哌齐处理组和GF109203X +多奈哌齐处理组中加入10 μmol/L多奈哌齐，并在正常对照组中加入等量溶剂。测定各组蛋白浓度后，取20 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳。电泳在100 v下进行20分钟，然后在150 v下进行60分钟。然后，将蛋白质电泳转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)上，用5%的脱脂牛奶饱和，并与β-actin(1:1000)、磷酸化pkc(1:1000)和P-MARCKS(1:1000)一抗在4℃孵育过夜。用tris缓冲生理盐水(TBS)洗涤30 min后，用辣根过氧化物酶偶联抗兔/鼠IgG二抗(1:1000)室温孵育1小时。使用TBS清洗膜，并在室温下加入ABC化合物30分钟。使用ECL Western Blotting检测试剂盒显示信号。gydF4y2Ba

PKCα和PKCε的免疫荧光表达gydF4y2Ba

细胞以10的密度接种gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba6孔板，细胞分为对照组和多奈哌齐处理组。多奈哌齐处理组细胞接种后加10 μmol/L多奈哌齐，正常组细胞接种后不加多奈哌齐。两小时后，将培养基丢弃，用PBS清洗细胞两次。40 g/L多聚甲醛固定30分钟后，用PBS冲洗细胞3次，每次5 min。然后，用含3% H的PBS处理细胞gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba0.1% Triton X-100室温孵育20 min, PBS清洗细胞。将细胞与含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温下孵育30分钟，并在4℃下添加小鼠单克隆抗pkc α(1:100)或抗pkc ε(1:100)抗体过夜。PBS洗涤后，加入fitc偶联抗小鼠IgG二抗，孵育90 min。PBS洗涤3次后，用荧光甘油挂载，显微镜下观察细胞。gydF4y2Ba

PKC易位gydF4y2Ba

根据Etcheberrigaray等人描述的程序进行PKC易位检测，并进行了一些修改[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．简言之，在裂解缓冲液(20 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 5 mM DTT, 0.32 M蔗糖和2 mM PMSF)中裂解细胞后，以12000 ×离心提取gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置20分钟。由此产生的上清液被认为是细胞质组分。用同样的裂解缓冲液孵育微球，在冰上加入1% Triton X-100，在12000 ×下离心45分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C下20 min，收集上清液作为膜组分。BCA (bicinchoninic acid)定量后，将20 mg蛋白与5 ×负载缓冲液和20 ×还原剂混合煮沸5 min，加载到7.5%的SDS-PAGE凝胶上。以下步骤与上述步骤相同，不同之处是一次抗体为小鼠单克隆抗pkc α和抗pkc ε抗体(在BSA中为1:1000)。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

采用SPSS 19.0软件(IBM, Chicago, IL, USA)进行统计分析。数据以均数±标准差(SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSDgydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05为有统计学意义。gydF4y2Ba

Aβ的作用gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}多奈哌齐对细胞活力的影响gydF4y2Ba

Aβ治疗gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}5、10、20、50 μmol/L作用24 h时，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)可使细胞活力由85.26±8.03降低至40.84±4.28，而多奈哌齐在0.5 μmol/L ~ 50 μmol/L浓度下对细胞活力无显著影响(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

多奈哌齐对Aβ的影响gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}-诱导细胞活力和LDH释放gydF4y2Ba

与正常对照组相比，Aβ含量为20 μmol/LgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}显著(P < 0.05)降低细胞活力，增加LDH释放。与Aβ相比较gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba},βgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}+ 5、10、20、50 μmol多奈哌齐显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)可使细胞活力由57.35±3.95提高至87.35±7.42，而使LDH释放由164.57±14.52降低至138.25±5.93，说明5-20 μmol多奈哌嗪拮抗了20 μmol Aβ诱导的细胞活力下降gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

P-PKC和P-MARCKS表达gydF4y2Ba

与正常对照组比较，P-PKC、P-MARCKS表达明显降低(gydF4y2BaPgydF4y2Ba10 μmol多奈哌齐处理组(158.86±11.62)和147.56±12.05)均高于对照组(< 0.05)。与多奈哌齐治疗组相比，P-PKC和P-MARCKS的表达显著降低(gydF4y2BaPgydF4y2BaGF109203X +多奈哌齐治疗组(分别为99.67±10.36和99.64±8.86)< 0.05。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

多奈哌齐对PKC亚型分布的影响gydF4y2Ba

免疫细胞化学荧光染色显示PKCα和PKCε蛋白在正常对照组胞质中基本均匀分布，而10 μmol多奈哌齐处理组胞膜中表达较高(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．Western blot检测PKCα和PKCε异构体在多奈哌齐处理后细胞质和膜部分的表达，进一步确认其亚细胞分布。结果表明，多奈哌齐可降低PKCα的表达(由100降低至74.83±9.41;gydF4y2BaPgydF4y2BaPKCε(100 ~ 79.75±8.16，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)， PKCα表达量增加(PKCα: 100 ~ 130.89±12.45;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01;PKCε: 100 ~ 148.39±15.58;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．这表明多奈哌齐可诱导PKCα和PKCε异构体从细胞质转位到细胞膜，表明多奈哌齐可激活PKC信号通路。gydF4y2Ba

我们的研究表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐拮抗Aβ的能力gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}降低细胞活力。多奈哌齐的这种保护作用被PKC抑制剂GF109203X部分抵消，这表明PKC通路参与了多奈哌齐的细胞保护作用。多奈哌齐增加了P-PKC和P-MARCKS的表达，改变了PKCα和PKCε的分布，表明多奈哌齐对PKC具有激活作用，这可能是多奈哌齐对Aβ的保护机制gydF4y2Ba_{25 - 35。gydF4y2Ba}

用5 ~ 50 μmol/L Aβ处理24小时后gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}， pc12细胞活力呈剂量依赖性降低;相同浓度的多奈哌齐对细胞活力无显著影响。1 ~ 50 μmol/L多奈哌齐可拮抗20 μmol Aβ的神经毒性gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}在。与对照组相比，Aβ处理gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}导致pc12细胞发生显著变化，包括细胞收缩、细胞体减少、突起减少和粘附能力下降。这些细胞变化是外源有毒物质暴露后的保护性反应，多奈哌齐预处理可明显拮抗毒性作用。然而，参与细胞形态变化的具体蛋白质及其具体机制仍有待探索。gydF4y2Ba

PKC在AD的发生发展中起着非常重要的调控作用，PKCα和PKCε被认为与AD的发病密切相关。正常情况下，PKC位于细胞质中，当它被激活时，它被运送到膜浆膜[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba通过一种叫做蛋白质转运的过程。PKCε也被发现通过参与M受体介导的sAPPα分泌来调节α分泌酶的活性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在AD患者的成纤维细胞中，发现PKC功能缺失，导致神经元对各种生长因子和神经递质的反应降低;此外，PKC活性降低以及PKC亚型转运能力下降与记忆和认知功能下降密切相关[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．PKC的下游底物MARCKS在小鼠大脑中表达，与动物的空间学习能力有关。在AD的老年斑中，MARCKS与PKC和a β共存，MARCKS的磷酸化被认为是PKC激活的标志，与神经保护有关[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．PKCε通常与预处理神经保护有关，并通过激活脑切片中的ERK介导缺血耐受[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．PKCα也与细胞存活和细胞死亡信号通路有关，并在缺血预处理时在大鼠大脑中被激活[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．PKC的激活具有神经保护作用，可通过磷酸化HSP27增加神经元抗凋亡强度，维持细胞稳态[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．PKCε通过调节包括线粒体K + ATP通道磷酸化在内的多种途径诱导对抗缺血的神经保护[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，突触体线粒体呼吸增加[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]和激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，通过n -甲基-d-天冬氨酸(NMDA)受体[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，并通过调节γ -氨基丁酸(GABA)突触[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．我们的研究表明多奈哌齐能够通过增加PKC和MARCKS的磷酸化来激活它们，这可能是多奈哌齐对细胞活力和神经保护作用的分子基础。gydF4y2Ba

MARCKS磷酸化被认为是PKC激活的一个标志。在灭活状态下，PKC亚型定位于细胞质部分，但激活后它们转移到膜部分。为了确定多奈哌齐是否能影响PKC亚型的亚细胞分布，我们在多奈哌齐治疗后评估了参与AD发病的两种主要亚型PKCa和PKCε。由于我们实验室没有STED分析技术，我们进行了进一步的实验来支持我们的观点。为了检测PKC亚型的亚细胞分布，我们进行了免疫细胞化学染色，并通过Western blotting测量PKCα和PKCε蛋白在细胞质和膜部分的亚细胞分布，与我们之前的研究一样[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．结果表明，多奈哌齐降低了PKCα和PKCε在细胞质部分的表达，但增加了这两种异构体在膜部分的表达(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．这意味着多奈哌齐可以诱导PKCα和PKCε异构体从细胞质部分转移到膜部分。在多奈哌齐处理组的膜部分中发现PKCα和PKCε亚型水平高于载体处理组，这支持了我们的结论，即多奈哌齐可以激活PKC信号通路。因此，PKC信号通路的激活可能成为开发治疗阿尔茨海默病痴呆新药的关键，这可能表明我们研究的临床意义。gydF4y2Ba

神经退行性疾病中常见的病理改变可能是各种病理生理因素引起的神经元凋亡及随后的神经元功能丧失，保护剩余神经元的功能是治疗的途径之一。多奈哌齐作为一种特异性强效乙酰胆碱酯酶抑制剂，可通过增加胆碱能神经功能和激活PKC拮抗细胞凋亡来改善轻、中度AD患者的认知功能。多奈哌齐还可增加淀粉样前体蛋白α的分泌以支持神经元，从而发挥其神经保护作用[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在我们之前的研究中，一个实验使用了两个细胞系。当我们研究蛋白激酶C激活剂TPPB对淀粉样前体蛋白(APP)加工的影响时，我们使用了PC12细胞和SH-SY5YgydF4y2Ba^{APP695gydF4y2Ba}稳定转染人野生型APP695 cDNA的人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．同样的细胞被用于研究PMS777，一种具有抗血小板活化因子活性的新型胆碱酯酶抑制剂[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．我们利用人成神经细胞瘤SK-N-SH细胞和PC12细胞研究了二烯基对APP加工的影响[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．这三个实验结果相似，包括这些药物对两种细胞系中APP表达、sAPPα分泌和Aβ分泌的影响[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在神经保护研究中，我们研究了促红细胞生成素对SH-SY5Y细胞和PC 12细胞中a β诱导的神经毒性的影响，结果显示了相同的趋势[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．虽然这两种细胞系来自两个不同的物种，但实验结果相似。因此，在本研究中，我们将PC12细胞暴露于Aβ作为体外模型，以研究多奈哌齐的神经保护作用。gydF4y2Ba

我们的研究具有临床意义，因为Aβ蛋白的细胞外沉积能够导致海马老年斑的形成，这是AD与神经退行性变相关的病理特征。在目前研究的片段中，AβgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}代表Aβ在体内由脑蛋白酶加工的最短片段。一个βgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}是Aβ的功能域，它在临床痴呆中具有神经毒性作用，并且它保留了全长肽[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．它对神经元细胞具有高度的细胞毒性，在神经科学研究中广泛应用于体外和体内[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]，包括我们自己以前的研究[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．因此,βgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}被选为实验对象。Aβ的剂量gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}在我们的研究中根据相关研究使用[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．首先应用5、10、20、50 μmol/L的Aβ处理gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}测试Aβ的神经毒性gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}pc12细胞中。通过本实验，我们选择Aβ的浓度为20 μmol/LgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}多奈哌齐的保护性实验。Aβ浓度为20 μmol/LgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}为了测试多奈哌齐的保护作用，细胞存活率为56%(由MTT法测定)。如果在Aβ给药后加入多奈哌齐，可能没有足够的细胞被多奈哌齐拯救，因此多奈哌齐的神经保护作用将难以显示。若a β浓度较低gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}(如5 μmol/L或10 μmol/L)时，可能不需要多奈哌齐的神经保护作用，因此其潜在的神经保护能力也难以显示。因此，我们使用AβgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}以20 μmol/L的浓度给药(对部分细胞有损伤作用)，并在a β给药前添加多奈哌齐，显示其对a β的神经保护作用。gydF4y2Ba

在添加a β之前用多奈哌齐预处理细胞是一种预防性方法，可能不会模拟体内情况。Aβ治疗前gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}本研究以多奈哌齐浓度为0.5、1、5、10、20和50 μmol/L对pc12细胞活性的影响为实验条件，均无明显的抑制作用。然后以多奈哌齐(5、10、20、50 μmol/L)对Aβ作用后pc12细胞的神经保护作用进行试验gydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}．多奈哌齐在5、10、20、50 μmol/L剂量范围内对pc12细胞的保护作用呈剂量依赖性。在细胞处理中，我们采用多奈哌齐浓度μmol/L。多奈哌齐用于人体治疗AD时，剂量为mg/d，最高剂量为10mg /d，这可能是为了防止大剂量多奈哌齐可能产生的副作用。gydF4y2Ba

综上所述，多奈哌齐可拮抗AβgydF4y2Ba_{25 - 35gydF4y2Ba}PKC的激活可能解释了多奈哌齐的神经保护作用。PKC的激活可能成为开发阿尔茨海默病痴呆治疗新方法的关键。gydF4y2Ba

所有数据和资料均可从通讯作者处获得。gydF4y2Ba

一个也没有。gydF4y2Ba

一个也没有。gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

1. 石家庄市人民医院医学研究科，河北省石家庄市方北路9号，050011gydF4y2Ba

   Bu-Lang高gydF4y2Ba

2. 河南大学临床医学院，河南省人民医院神经内科，郑州450003gydF4y2Ba

   车宁宁，李雪gydF4y2Ba

3. 郑州大学第一附属医院检验科，河南郑州450003gydF4y2Ba

   chun - feng表示任gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

BLG对研究设计做出了贡献。BLG和NNC进行实验。BLG, NNC, XL和CFR收集数据。CFR监督了这项研究。BLG参与了论文的撰写和修改。所有的作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaBu-Lang高gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

本研究获石家庄市人民医院伦理委员会批准。本实验为细胞实验，未入组患者。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

作者同意发表所有数据和资料。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

一个也没有。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

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