自闭症样行为由5-羟色胺受体5-HT2B调节在背侧扇形体神经元黑腹果蝇

背景

自闭症谱系障碍(ASD)是一种神经发育障碍，其特征是社交障碍和重复的刻板行为。先前的研究已经报道了血清素或5-羟色胺(5-HT)与自闭症谱系障碍的关系，但血清素调节自闭症行为的特定受体和神经元尚未完全阐明。

方法

通过rna介导的敲除来破坏色氨酸羟化酶(Trh)和所有5种血清素受体的功能。考虑到无处不在的击倒5-HT2B显示出明显的社会行为缺陷，我们应用CRISPR/Cas9系统敲除5-HT2B受体基因。社会空间试验和梳理试验是了解5 -羟色胺及其相关特异性受体在自闭症患儿类行为中的作用的主要方法黑腹果蝇。

结果

5 -羟色胺与自闭症样行为之间存在密切关系，这些行为反映在社会空间距离的增加和儿童的高频重复行为果蝇。我们进一步利用二元表达系统敲除5个5-HT受体，观察到5-HT2B受体是小鼠正常社会空间和重复行为的主要受体果蝇特定的血清素受体调节这两种行为。我们的数据还显示，在背侧扇形体(dFB)的神经元表达5-HT2B，在功能上对社会行为至关重要果蝇．

结论

总的来说，我们的数据表明5-羟色胺水平和5-HT2B受体与儿童的社会互动和重复行为密切相关果蝇．在所有5种血清素受体中，dFB神经元中的5- ht2b受体主要负责血清素介导的自闭症样行为的调节。

在人类中，自闭症谱系障碍(ASD)是一种神经发育障碍，其特征是一系列关键的行为异常，包括重复行为[1]、异常的言语交流[2]，多动[3.]、感官异常[4]，以及社会互动受损[5］．自闭症患者的全血血清素水平(wb5 - ht)在28.3%的全血(WB)和22.5%的富血小板血浆(PRP)样本中升高[6]，研究发现血清素在模拟儿童早期大脑发育过程中的细胞增殖方面起着至关重要的作用[6］．尽管血液中血清素水平升高，但自闭症儿童大脑中的血清素水平相对较低[7，8，9］．值得注意的是，母体病毒暴露或免疫激活也可能导致低水平的脑5-HT或异常的5-HT神经元[10，11］．尽管5-HT在大脑中起着至关重要的作用，但人们对其调节自闭症行为的机制知之甚少，尤其是5-HT受体的作用。

果蝇是群居动物[12］．它们与其他动物交流以争夺各种资源，例如食物。13]或生殖伴侣[14]，并通过化学物质使彼此的日常活动同步[15]，以及听觉的[16]和触觉线索[17］．社会经验可以影响个体及其邻居的行为模式，如社会学习和记忆[18]，社会同步(活动和休息)[19]、攻击性和交配[20.］．重复和刻板的行为在自闭症患者中很常见，患者会在眼前反复拍手和抖动手指[21］．因此，重复和刻板的行为特征也被认为是自闭症的诊断标准[22］．梳理行为果蝇是一种有序的重复动作，类似于自闭症中的重复和刻板行为。因此，我们使用梳理试验来评估重复行为果蝇在这项研究中。大脑中只有大约90个5-HT神经元果蝇中央大脑[23]，这使得果蝇一个研究5-HT如何调节社会行为的易于处理的模型。

这里，来考察一下是否果蝇5-HT神经元有助于它们的社会行为，我们采用社会空间实验来检测社会互动，并采用梳理实验来反映重复行为果蝇．参与自闭症样行为的受体基因通过与rnai介导的敲低相结合来鉴定。我们的研究表明血清素水平影响社会交往和重复行为果蝇通过5-HT2B受体我们进一步报道，血清素可以通过dFB中表达5- ht2b的一小部分神经元来调节这两种社会行为果蝇通过特异性敲除5-HT2B。总之，我们的工作揭示了血清素调节社会互动和重复行为果蝇通过dFB神经元中的5-HT2B受体。

苍蝇种群和饲养条件

作为对照的蝇系为野生型Canton-S而且w¹¹¹⁸，这取决于测试群体的不同基因背景。采用标准酵母-玉米粉-琼脂培养基，25°C, 60%湿度，12 h/12 h光照/黑暗循环培养。韦⁰¹，5-HT2B-Gal4，23 e10-gal4(以下dFB-Gal4，因为它在背部扇形体中特异性表达Gal4 [24]),per-Gal4，or83b-Gal4,Pdf-Gal4线条是饶毅实验室(北京大学，中国北京)赠送的礼物。其他Gal4转基因RNAi系来自Bloomington的清华果蝇中心(THFC, Beijing, China)果蝇库存中心(美国印第安纳大学BDSC)和维也纳果蝇资源中心(VDRC，维也纳，奥地利)，包括Tub-Gal4 / TM6B(THFC # TB00129),Ubi-Gal4(THFC # TB00152),23 e10-gal4(BDSC # 49032),or83b-Gal4 (BDSC # 26818),UAS-Trh-RNAi / TM3(THFC#THU2052或bdsc# 25842)，UAS-5-HT1A-RNAi(THFC#THU1216或bdsc# 33885)，UAS-5-HT1B-RNAi(THFC#THU0772或bdsc# 33418)，UAS-5-HT2A-RNAi(THFC # TH01471。N),UAS-5-HT2B-RNAi(VDRC # 102356),UAS-5-HT7-RNAi(THFC#THU0916或bdsc# 32471)。

敲除线的建设果蝇

用于发电的飞线5-HT2B转基因苍蝇被敲除w¹¹¹⁸；{nos-Cas9} attP40/CyO生成的{nos-Cas9} attP40系由倪建全博士(清华大学，北京，中国)慷慨提供，其X染色体被替换为w¹¹¹⁸．cas9介导的基因组编辑如前所述[25］．简单地说，grna是在CRISPR优化目标查找器网站(http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu/)．选择无脱靶的sgrna并亚克隆到pU6b-sgRNA-short载体(也由Ni博士提供)[25］．将两个针对5-HT2B起始密码子上游和下游序列的sgRNA质粒注入{nos-Cas9} attP40胚胎。通过PCR分析和随后的DNA测序筛选敲除系。用于构建系的sgrna序列和筛选引物记录在附加文件中4:表S1。然后将剔除线反交叉成w¹¹¹⁸至少有五代人的背景。

5-羟色氨酸(5-HTP)对苍蝇的药理作用

5-HTP (Cat# H9772, Sigma)在ddH中溶解₂将O与新鲜煮熟并冷却的标准蝇食混合，制成含5- htp的食物2 mg/ml。对于行为分析，野生型或韦⁰¹在成虫阶段之前，果蝇以正常食物为食。合拢后，将成蝇置于冰上麻醉，按性别分开，然后转入5-HTP食物或标准食物中饲养3-5天。为了进行免疫染色分析，果蝇在喂食含有5-羟色胺的食物3天后被解剖。

定量rt - pcr

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat# 15596026, Invitrogen, Carlsbad, USA)从10个整个蝇体中提取总RNA。使用HiScript III第一链cDNA合成试剂盒(+ gDNA wiper) (Cat# R312-01, Vazyme，南京，中国)按照制造商的说明进行反转录。实时PCR在实时热循环仪(QuantStudio 5, Thermo Fisher, MA, USA)上进行，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Low ROX预混)(Cat# Q331-02, Vazyme)，每个样品3个技术重复。PCR组合和qPCR程序按照生产厂家说明书制备。所有反应至少重复三次，相对表达量分析采用ΔΔCT方法进行。数据被验证使用RpL49基因作为一种内部控制。引物序列在附加文件中列出4:表S1。

5 -羟色胺检测

将大约50只5- 7天大的苍蝇整具尸体放在0.5 mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲溶液中，在冰上均质5- 10分钟，然后以3000转/分的速度离心20分钟以去除组织碎片。5-羟色胺检测试剂盒(Cat# H104，南京建城，中国)ELISA检测上清液5-HT浓度。5-HT的最终用量归一化为每个样本的苍蝇总重量。

社会空间分析

通过Simon和同事之前开发的协议，对分组果蝇进行了社会空间分析[26］．简单地说，在实验前一天，苍蝇(30 <n≤40)，在冷麻醉下按性别分开。实验前，果蝇被转移到新的食物瓶中，并被放置在专用的行为室内(湿度50%，25°C)，以适应环境2小时。所有实验都在最大的三角形垂直室中进行(内部尺寸:16.5 cm × 16.5 cm × 14.5 cm)。当苍蝇经过大约30分钟的探索后定居在房间里时，用相机拍摄了房间的数字图像。然后，利用斐济(ImageJ)软件(NIH)计算蝇类与最近相邻蝇类的距离，并使用GraphPad Prism 7.00软件对数据进行分析。对于没有攀爬缺陷的蝇群，我们使用垂直方向的室进行社会空间分析。然而，对于有攀爬障碍的苍蝇，一种潜在的补救方法是使用水平室，或者在拍照前让苍蝇有更多的时间安顿下来。

负地向性测定

如前所述，苍蝇的运动通过负地向性试验进行测试[27略作修改。简单地说，在实验前1天，将封闭5-7天的成年雄性苍蝇分离，并以每瓶25-30只苍蝇的密度放置在小瓶中。实验过程中，将果蝇在不麻醉的情况下转移到内径2 cm、高20 cm的玻璃管中。然后，用同样的力敲击管子，把苍蝇收集到底部，然后给苍蝇10秒钟爬墙。取数字图像，计算10 s内越过8 cm线的苍蝇百分比。该试验在同一组重复3次，两次试验之间休息时间为1分钟。类似的程序总共重复了三次。实验在下午3点到6点之间进行，以尽量减少昼夜节律振荡的潜在影响。

重复的行为

重复行为由梳理试验确定，如前所述[28］．一般在羽化后5-7天，将雄性果蝇在实验前分离，然后将一只果蝇转移到观察室内，在行为室中放置2 h。在观察室内驯化1 min后，录制5 min的视频，收集个体梳理次数的数据。在某些情况下，还收集了苍蝇梳理毛发的时间和每次梳理毛发的持续时间。当一只苍蝇停止梳理并保持不动2秒或停止梳理并行走至少4步时，梳理回合被视为结束。在本实验中，我们在下午3点到6点之间进行梳理实验，并使用视频软件手动分析5分钟观察期的数据。

免疫组织化学和共聚焦成像

所有免疫染色均采用羽化后5-7天以5-HTP或正常食物喂养的成年雌蝇进行麻醉，将其大脑在冰冷的PBS中解剖，并在4%多聚甲醛的PBS中室温固定30分钟，然后在室温下用PAT3 (0.5% Triton X-100, 0.5%牛血清白蛋白)冲洗4次10分钟。将样品转移到5%正常驴血清(NDS)或正常山羊血清(NGS)中，在室温下阻断1小时，并与一抗(稀释于5% NDS或NGS)在室温下孵育4小时，然后在4℃过夜。在室温下用PAT3洗涤样品4次10分钟，然后用5% NDS或NGS二抗在室温下4小时和4℃过夜，然后用FocusClear安装样品^™(Cat# FC-10100, CelExplorer实验室，台湾，中国)，并在蔡司LSM800共聚焦显微镜上成像。采用以下抗体:兔抗5- ht (1:1000;Cat# 20080, RRID: AB_572263, ImmunoStar, Hudson, WI, USA)和小鼠抗nc82 (1:20;编号2314866,RRID: AB_2314866, DSHB，美国)。二抗按1:500稀释如下:山羊抗兔Alexa Fluor 488 (Cat# A11008, RRID: AB_143165，赛默飞世尔科学，福斯特城，CA, USA)和驴抗小鼠Alexa Fluor 568 (Cat# A10037, RRID: AB_2534013，赛默飞世尔科学)。

统计分析

采用GraphPad Prism 7.00进行统计学显著性分析。采用Kolmogorov-Smirnov检验分析社会空间行为，双尾学生的社会空间行为t-test 2列的数据。图中显示了样本量。P值用*表示P< 0.05， **P< 0.01， ***P< 0.001， ****P< 0.0001, NS (P≥0.05)。确切的P值在图例中指定。

血清素调节社会交往果蝇

5-羟色胺的生成需要两步合成:TRH将色氨酸转化为5-羟色胺，然后芳香族氨基酸脱羧酶催化5-羟色胺转化为5-羟色胺[29］．来确定血清素是否会影响社会交往果蝇，我们通过RNAi或使用突变系来删除血清素。为韦击倒，我们穿越处女苍蝇携带Tub-Gal4司机以雄蝇携带UAS-Trh-RNAi转基因无所不在的击倒韦并验证了下调韦qRT-PCR表达。qPCR分析表明，mRNA的表达韦在RNAi系中降低了55%(图;1A).然后，我们使用血清素检测试剂盒检测5-HT水平，发现Tub-Gal4>UAS-Trh-RNAi5-HT水平显著降低(图;1B)社会互动障碍是一种主要的行为特征，可以被检测到果蝇通过社会空间分析。因此，我们用这个实验来研究韦可拆卸的苍蝇。与最近邻居的平均距离有显著增加韦击倒雌雄果蝇(图;1C, E)。累积频率显示每只苍蝇的更详细的分布，其中更高比例的苍蝇表现出社交距离的增加(图。1D, F).在韦⁰¹苍蝇，一种indel变种韦无法合成血清素[30.(图。1G)，其体内几乎没有5-HT(图;1H)。韦⁰¹突变的果蝇表现出社会间距的增加，这可以从单个果蝇和它最近的邻居果蝇之间的距离得到证明。与以往的研究一致，大多数观察到至少有两个体长(~ 0.25 cm)Canton-S在社会环境中的野生型苍蝇[26］．然而,韦⁰¹突变果蝇在两性社会群体中表现出显著的距离(图。1I-L)，在雌性果蝇中检测到更明显的表型，如P值(P= 0.0006，用^＊＊＊)的差异更显著(图;1K)。累积频率图显示，50%的雌蝇定居在离邻近蝇0.4 cm的地方(图2)。1L)韦⁰¹突变型果蝇比野生型果蝇有更大的飞行距离。由于没有观察到严重的攀爬活动缺陷，因此可以排除运动缺陷的影响韦敲除和突变系(图;1M, N)。这些结果表明血清素的缺乏严重影响社会交往果蝇．

进一步验证血清素对社会交往的影响果蝇，我们都吃了韦⁰¹突变体和野生型果蝇服用2毫克/毫升的5-羟色胺，持续3天，恢复了大脑中的血清素韦⁰¹突变体，如免疫荧光观察(图;1Q, R)。我们发现5-HTP喂养可以挽救社会回避韦⁰¹雌雄突变体(图;1O)。此外，在Canton-S用5-HTP喂养野生型果蝇，而不是用正常食物喂养野生型果蝇(图2)。1因此，血清素在社会交往中起着重要的作用果蝇．

血清素调节重复的行为果蝇

鉴于重复行为也是ASD中典型的行为异常，我们打算确定血清素是否影响ASD的重复行为果蝇．我们检测到重复的行为韦可拆卸的,韦⁰¹突变体通过计算在5分钟内梳理毛发的次数来确定血清素是否在这一过程中起作用。的韦⁰¹与对照果蝇相比，突变雄性果蝇表现出明显增加的梳理次数。2A)，同样基因型的雌性果蝇也是如此(附加文件1:图S1A)。我们还分析了每次梳洗所花费的时间和用于梳洗的总时间，但没有显著差异(图2)。2B, C)，同样的结果是正确的数据韦击倒文件:梳理事件的次数显著高于双亲对照组(图2)。2D和附加文件1:图S1B)。为了检验这种由血清素损失引起的加重的重复行为是否可以通过5-HTP喂养来挽救，这将增加突变系的大脑血清素，我们比较了5-HTP喂养之间的梳理事件的数量韦⁰¹果蝇和正常食物喂养的果蝇之间的重复性行为韦⁰¹果蝇通过摄入5-羟色胺来缓解(图;2E和附加文件1:图S1C)。综上所述，血清素调节重复行为果蝇．

不同的血清素受体调节社会行为

5个受体被鉴定为5-HT受体果蝇：5-HT1A，5-HT1B，5-HT2A，5-HT2B而且5-HT7，均属于g蛋白偶联受体超家族[31］．的5-HT1A，5-HT1B,5-HT7受体偶联cAMP信号级联[32]，而5-HT2A而且5-HT2B受体导致钙^{2 +}肌醇-1,4,5-三磷酸依赖的信号通路[33］．目的:探讨哪些受体参与社会互动和重复行为的调节果蝇，我们通过交叉敲除了所有5个5-HT受体Ubi-Gal4苍蝇UAS-5-HT1A-RNAi，UAS-5-HT1B-RNAi，UAS-5-HT2A-RNAi，UAS-5-HT2B-RNAi,UAS-5-HT7-RNAi苍蝇。这些5-HT受体的mRNA表达水平在这些果蝇中显著降低(附加文件2:图S2A)。在这些受体敲除果蝇中未发现攀爬缺陷(附加文件)2:图S2B)。我们分析了这些苍蝇中一只苍蝇和它最近邻居之间的距离，发现只有5-HT2B与对照组相比，被击倒的果蝇在两性中都有异常的社交空间，社交距离显著增加(图2)。3.模拟)。不出所料，这些击倒果蝇发生了不规则的重复行为，正如雄性和雌性果蝇的梳理数量增加所示(图2)。3.E, D)，因此，在五种受体中，5-HT2B似乎是正常社会行为所必需的果蝇．

血清素通过5-HT2B受体调节社会行为

为了进一步确认5-HT2B在社会行为中的功能，我们利用CRISPR/Cas9方法生成5-HT2B迷人的线条。如图所示。4首先，我们设计了2个sgrna来靶向5-HT2B基因:一个在该基因的第一个外显子上游，另一个在该基因的第一个外显子内。将2个sgRNA质粒混合注入携带sgRNA的胚胎中nos-Cas9转基因得到223 bp缺失。在筛选9只从注射胚胎中闭合的苍蝇后，我们获得了两条缺失224 bp和247 bp的基因敲除系(附加文件)3.:图S3A, B)。对于两个基因敲除系，雄蝇和雌蝇都表现出社会异常表型，突变蝇的停留时间明显远于w¹¹¹⁸野生型蝇(图;4值得注意的是，在5min的观察期内，突变株的梳理数量也显著增加(图2)。4E, F)。这两个突变体均未发现严重的攀爬缺陷(图。4D).因此，5-HT2B可能是参与血清素介导的社会行为的主要受体。

大脑中参与调节社会互动的区域果蝇

在果蝇，超过500个5-HT2B-阳性神经元分布在大脑中，其轴突和树突位于中央复合体、嗅觉叶、视叶、食管下神经节和腹外侧原大脑(图2)。5A)相同的表达模式5-HT2B已被钱先生及其同事确认[31］．根据我们的观察5-HT2B受体缺陷可能会影响社会互动，我们询问哪些大脑区域或神经元子集特别参与正常的社会互动果蝇大脑。

因为一小部分5-HT2B-表达神经元在背侧扇形体(dFB)调节睡眠稳态果蝇［31，我们询问这些色氨酸能神经元是否也能调节果蝇的社会互动行为。运用社会空间法评价大学生的社会行为dFB-Gal4>UAS-5-HT2B-RNAi其中的苍蝇5-HT2B在dFB中被特异性敲除，并且这些基因型果蝇之间的距离明显更远(图。5B, C)。有趣的是，5 min期间的梳理次数在dFB-Gal4>UAS-5-HT2B-RNAi比双亲对照组的果蝇数量多(图;5D, E，考虑的作用5-HT2B在昼夜节律中，我们利用per-Gal4苍蝇专门击倒5-HT2B在时钟基因时期。令人惊讶的是，这些被击倒的苍蝇彼此之间的距离更近。5B, C, Asper-Gal4>UAS-5-HT2B-RNAi果蝇有明显的运动缺陷(图;5F, G)，在进行社会空间实验的同时，给予果蝇更多的时间来安顿下来。之前的一项研究表明，大的腹侧时钟神经元(lLNvs)对于维持与觉醒和睡眠相关的正常昼夜节律至关重要[34］．随着5-HT2B受体在lLNvs中也有表达(图;5一个),pdf-Gal4是专门用来击倒的吗5-HT2B在lLNvs。如图所示，与最近的苍蝇相比，苍蝇与最近的苍蝇的距离增加了Gal4而RNAi亲本对照组则有所下降(图2)。5B, C)。此外，未检测到重复行为缺陷pdf-Gal4>UAS-5-HT2B-RNAi飞(图。5因此，我们排除了这些神经元作为调节果蝇社会行为的候选神经元。在果蝇大脑中，血清素合成神经元和嗅觉受体神经元之间已经建立了突触连接，并有助于与嗅觉相关的行为，如学习和记忆[35］．此外，嗅觉感觉神经元被证明在社会回避中起介导作用果蝇［36]，以及5-HT2B受体分布于嗅觉神经元(图;5A).检查是否5-HT2B嗅觉神经元中调节果蝇社会互动的受体功能，被我们打倒了5-HT2B在嗅觉神经元中Or83b-Gal4．类似于pdf-Gal4可拆卸的苍蝇,r83b-Gal4>UAS-5-HT2B-RNAi与亲代对照组相比，果蝇表现出正常的梳理数量和中等的最近邻居距离(图2)。5B-E)表示5-HT2B嗅觉神经元中的感受器与动物的社会行为无关果蝇．

综上所述，血清素调节社会交往和重复行为果蝇通过5-HT2B受体在dFB神经元中的作用5-HT2B的社会互动中的受体果蝇都独立于昼夜节律或嗅觉神经元。

自闭症发病率的增加给家庭和社会带来了巨大的压力。自闭症的发病机制及相关药物靶点的研究对自闭症的治疗具有重要意义。文献中已经报道了血清素和自闭症之间的密切关系。1961年，在婴儿自闭症中发现血清素水平升高[37]，一项进一步的研究表明，超过25%的自闭症患者血液中的血清素水平较高[6］．因此，血清素水平一直是自闭症研究中的一个生物标志物。确定血清素和自闭症之间的关系是自闭症治疗的基础。据报道，全血中含有的5-羟色胺几乎完全包含在血小板中[38］．然而，在外周产生的绝大多数5-HT无法穿过成熟的血脑屏障并与神经组织相互作用[39］．相反，大脑中的5-羟色胺是由中脑和后脑的血清素神经元产生的。40］．尽管患有高血清素血症(或高血清素血症)，研究也显示自闭症儿童大脑中的血清素水平较低，因为在自闭症儿童大脑中观察到色氨酸(被称为5-羟色胺的前体)的摄取减少，5-羟色胺合成减少[7，8，9］．此外，McDougle和他的同事报告说，由色氨酸耗损引起的突触5-HT减少会加重自闭症患者的重复行为和易怒[41］．同样的现象也被观察到在小鼠TPH2，负责中枢5-HT的合成。这些小鼠的超声波发声和对社会气味的嗅探能力下降，社会记忆也有缺陷，认知能力也不灵活[42，43，44］．其他研究表明，母体病毒暴露或免疫激活导致大脑5-HT水平下降或5-HT神经元异常[10，11］．为了研究血清素和自闭症之间的关系，我们通过社会空间实验分析了苍蝇的社会互动，通过梳理实验分析了个体重复行为，发现韦⁰¹正常喂食时，果蝇的社交距离和梳理次数显著增加，喂食后这2种异常行为得以挽救韦⁰¹携带5-HTP的果蝇，表明血清素在社会行为调节中起着至关重要的作用。我们在野生型中注意到了这一点Canton-S饲喂血清素对血清素含量没有影响，但对社会行为有影响Canton-S．据推测，一些其他机制可能强调调节5-HTP喂食野生型果蝇的社会行为。

尸检研究显示ASD中5-HT2A和5-HT1A结合减少[45］．另一种5-HT受体5-HT1B显示其在突触后建立社会偏好的必要性[46］．然而，Veenstra-VanderWeele等人报道了5-HT转运体基因的Ala56变体的表达SLC6A4在小鼠中，其与强迫行为的关联已被检测出来，导致高血清素血症，更多的大脑5HT清除，以及更高的5-HT2A受体敏感性[47］．他们还在这些小鼠中发现了5-HT1B受体结合，并在眼窝前额皮层中发现了5-HT1B受体结合增加的平行现象[48］．关于5-HT7受体，尽管一项研究表明两者之间没有相关性5-HT7基因多态性与自闭症[49]，这种类型的受体已被证明可以调节行为灵活性[50]，探索行为[51]、情绪障碍[52]和癫痫[53]，包括ASD的核心和共病症状。这些发现证实了5-HT7受体参与ASD [54］．尽管如此，未来的工作似乎有必要研究每个5-HT受体在ASD中的作用。与此同时，自闭症儿童的社会行为和刻板行为的调节是由哪一种5-HT受体主导的仍是一个谜。在这项研究中，当我们敲掉5个血清素受体果蝇,5-HT2B击倒果蝇的社交空间显著增加，雄性和雌性的梳理次数也显著增加，证明5-HT2B在调节社交和重复行为方面具有显著功能。的作用5-HT2B类似自闭症的行为是由5-HT2B敲除果蝇，通过CRISPR/Cas9系统生成。而且，借助不同的Gal4行，我们发现了5-HT2BdFB神经元受体对正常社会交往具有重要意义果蝇．此外，这些神经元也影响了果蝇的重复行为，因为dFB神经元中5-HT2B的敲除导致5分钟内梳理数量的增加。

在人体内，5-HT有两种不同的来源。总的来说，我们体内95%的5-HT是由肠道产生的[55]，其中大多数5 -羟色胺是由肠染色质(EC)细胞中的TPH1产生的，一小部分是由胃肠道(GI)肌肠色氨酸能神经元中的TPH2产生的。至于神经元5-HT，在血清素能神经元中，几乎所有神经元5-HT的产生都依赖于TPH2。在果蝇，只有一个TRH存在。根据来自单细胞RNA-seq网站的果蝇肠道数据集，TRH除了在成人大脑中高度表达外，还在肠道中表达，特别是在肠上皮细胞(ECs)中。https://www.flyrnai.org/scRNA/gut/)．在本研究中，我们只关注了TRH的神经元功能，没有涉及GI TRH，这可能会导致相对不全面的观察。GI 5-HT调节多种肠道功能[55]并在ASD中作为肠道-大脑-微生物组轴之间的链接[56］．几种与肠道粘膜相关的梭状芽孢杆菌被认为与血清素水平有关[57］．因此，未来的研究可以评估是否韦肠道功能和肠道微生物。此外，微生物在ASD发展中的作用也需要进一步研究。

简而言之，我们的研究结果揭示了血清素水平和5-HT2B受体与社会行为的密切关系果蝇,包括社会互动和重复行为。血清素水平较低，果蝇表现出类似自闭症的行为，包括与邻居保持更远的距离和增加梳洗次数。此外，dFB神经元中的5-HT2B受体主导了5-羟色胺在调节两种自闭症样行为中的功能(图。6)．我们的研究进一步证实了果蝇作为检测具有强烈社会行为异常的疾病的模型。我们的结论是，5-HT2B有望成为治疗ASD的一个可能的治疗靶点。

不适用。

5:

5 -羟色胺

自闭症谱系障碍:

自闭症谱系障碍

白平衡:

全血

PRP:

富含血小板血浆

lLNvs:

大的腹侧时钟神经元

分布反馈:

背部扇形身体

5-HTP:

5-Hydroxytryptophan

电子商务:

肠嗜铬细胞的

GI:

胃肠

ECs:

肠上皮细胞

我们感谢饶毅提供的果蝇行韦⁰¹，5-HT2B-Gal4，dFB-Gal4，per-Gal4，or83b-Gal4,Pdf-Gal4．我们也非常感谢倪建全的好意{nos-Cas9} attP40直线和pU6b-sgRNA-short矢量。

本文由徐州医科大学科研基金(No. 53681921)、南京医科大学科技发展基金(NMUB2018016)和国家自然科学基金(No. 31900123)资助。

作者及隶属关系

1. 南京医科大学全球健康中心生殖医学国家重点实验室，江苏南京211166

   瑞许

2. 南京医科大学病原生物学教研室江苏省病原生物学重点实验室，南京211166

   刘启莎，徐睿

3. 徐州医科大学生物化学与分子生物学研究中心，江苏省脑疾病与生物信息重点实验室，江苏徐州221004

   Haowei曹

4. 首都医科大学基础医学院，北京100069

   胡安黄

5. 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100193

   Junbo唐

贡献

RX, JH和HC设计并进行了实验和分析。RX和HC准备了数据，HC起草了手稿。所有作者对结果进行了讨论和评论，RX完成了手稿。所有作者均已阅读并批准最终稿。

相应的作者

对应到胡安黄或瑞许．

相互竞争的利益

作者声明没有利益竞争。

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