胎盘的印记SLC22A3在IGF2R印迹结构域在哺乳动物中是保守的

背景

的真兽亚纲动物IGF2R印迹结构域由一种反义长非编码RNA调控，Airn这是从小鼠的差异甲基化区(DMR)表达的。Airn沉默两个相邻的基因，溶质载体家族22个成员（Slc22a2)而且Slc22a3，以建立Igf2r小鼠胎盘中的印迹畴。有袋类动物也有反义非编码RNA，【宗教】(伊斯兰教内专指拥护阿里的)“什叶派”( =Shiite)的确切功能【宗教】(伊斯兰教内专指拥护阿里的)“什叶派”( =Shiite)目前未知。的真兽亚纲动物IGF2RDMR位于内含子2，而有袋类IGF2RDMR位于内含子12，但还不知道是否邻近基因SLC22A2和/或SLC22A3都是有袋类动物的后代。在本研究中，有袋类动物的印记状态SLC22A2而且SLC22A3在IGF2R对有袋目袋鼠的绒毛膜-卵黄胎盘中的印迹区域进行了检测。

结果

在胎盘中，SLC22A3但不是SLC22A2是印。TammarSLC22A3印迹在胎盘组织中很明显，但在本研究检查的其他组织中不明显。的假定的促进者SLC22A3缺乏DNA甲基化，这表明该基因并没有像在小鼠中看到的那样，被其启动子上的DMR直接沉默。基于免疫荧光，我们确认了tamar SLC22A3位于tamar胎盘的内皮细胞层，在那里发生营养运输。

结论

自SLC22A3是印在tammar胎盘上，我们得出结论，这种胎盘印在哪里SLC22A3在有袋动物和真兽类分裂后，由于DMR位置的差异，被积极选择。由于已知SLC22A3在真兽类胎盘中作为营养转移的转运分子，我们认为它被强烈选择来控制有袋类动物的营养供需平衡，就像在真兽类胎盘中一样。

基因组印记是一种复杂的表观遗传过程，它导致基因子集以一种特定的亲代方式表达[1，2］．在脊椎动物中，这种现象已在兽类哺乳动物(真兽类和有袋类)中发现，但到目前为止，还没有证据表明在单目哺乳动物或非哺乳类脊椎动物中存在印记[3.，4，5，6］．由于许多印迹基因在哺乳动物胎盘中起作用，基因组印迹被认为是与哺乳动物胎盘发育同步进化的[7，8，9，10，11，12］．在此背景下，“供需”理论认为，胎盘中的印迹基因进化为通过控制营养物质的供应来调节母亲和携带父亲基因的胎儿之间营养相互作用的平衡[13］．然而，有袋动物和真兽类都有出生后印记的特征[14，15，16，17]，所以印迹不仅涉及胎盘，还涉及出生后的生长发育。目前的问题是，基因组印记是如何以及为什么只在脊椎动物中进化的。由于印记一定是在兽类哺乳动物的共同祖先中进化而来的，通过比较有袋类和真兽类之间的印记特征，我们可能能够确定印记的祖先特征，并了解它是如何进化的。

真兽类的印记基因往往聚集在基因组中[18，19］．在集群内的印迹基因分组允许共享公共调控元素，如非编码rna和差异甲基化区域(DMRs)。当这些调控元件控制聚类基因的印迹状态时，它们被称为印迹控制区域(ICRs)。在真兽类中，最具特征的印记群之一是胰岛素样生长因子2受体(IGF2R)基因位点(20.，21，22，23，24，25，26］．在小鼠,Igf2r基因是父系印迹(母系表达)基因，其印迹受固有的CpG岛(DMR)和反义长非编码(lnc) RNA调控，Airn［23，25，26，27，28］．DMR是在配子发生过程中建立的，在配子之间有不同的表观遗传修饰[29，30.］．它作为lncRNA的启动子，Airn［27］．Airn是母亲烙印(父亲表达)的基因和沉默吗Igf2r转录重叠在父系基因组上的表达[23］．这一lncRNA还调节一个10 + Mb区域的印迹，该区域包括胎盘中的两个相邻基因溶质载体家族22个成员2和3（Slc22a2和Slc22a3)［22，28，31]以及7个远于Igf2r轨迹(32］．Airn建立表观遗传沉默Slc22a3通过招募一种组蛋白修饰酶，常染色质组蛋白甲基转移酶2 (EHMT2，也称为G9a) [31］．虽然确切的机制Airn使父亲的失去活性Slc22a2目前未知,Airn可将组蛋白3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)和多梳抑制复合体2 (PRC2)引入基因位点[22］．因此，DMR在固有的CpG岛上进行控制Airn表达式的ICRIgf2r小鼠的印迹结构域[20.，25，26］．虽然基于lncrna的机制建立Igf2r印迹畴在小鼠中有很好的文献记载IGF2R它在其他真兽类哺乳动物中的邻近基因与老鼠的不同。在牛,IGF2R，AIRN，SLC22A2而且SLC22A3都印在他们的胎盘上[33］．虽然没有关于印痕的资料SLC22A2而且SLC22A3，IGF2R在羊和狗身上留下印记[34，35］．在人类中，基因IGF2R印迹结构域显示印迹指示物，但在胎盘的一个子集中是多态印迹[36］．相反，在猪中，证据是混乱的，因为在一项研究中，有父亲IGF2R表达式[37，在第二项研究中发现了母性因素IGF2R表达式[38在第三个研究中有双等位基因表达[39］．SLC22A3不是印在胎盘上的[40］．因此,虽然IGF2R印迹结构域可能存在于真兽类哺乳动物的共同祖先中，但在某些物种(如猪)中可能没有强烈选择。是否IGF2R印迹域在有袋类祖先中进化或在有袋类谱系中通过趋同进化而发展，目前尚不清楚。比较IGF2R有袋动物和真兽类之间的基因位点可以解释其进化过程。

的有袋类动物IGF2R基因也是烙印的[41，42，43］．然而，直到最近，人们都认为IGF2R有袋类动物缺乏关键的调节功能，如Airn和一个DMR [41，43]因为在老鼠所在的内含子2上没有DMRIgf2rDMR / ICR。然而，我们在内含子12中描述了一个新的DMR，它有一个687 bp的反义lncRNA，反义LncRNA在IGF2RDMR (【宗教】(伊斯兰教内专指拥护阿里的)“什叶派”( =Shiite))[43］．真兽类动物的DMR位置完全不同(内含子2)[26，30.和有袋动物(内含子12)[43］．【宗教】(伊斯兰教内专指拥护阿里的)“什叶派”( =Shiite)比老鼠矮很多吗Airn［43]，所以印痕机理IGF2R有袋类动物可能不同于老鼠Igf2r．然而，仍然有可能【宗教】(伊斯兰教内专指拥护阿里的)“什叶派”( =Shiite)是否有类似的作用方式来抑制侧翼基因SLC22A2 / SLC22A3在胎盘。如果SLC22A2和/或SLC22A3是有袋类动物的印记，这将提供强有力的证据，表明胎盘特异性印记在哺乳动物中被强烈选择，尽管DMR位置不同。

在本研究中，印痕状态SLC22A2而且SLC22A3在有袋类动物的胎盘中，研究人员使用了一种有袋类动物——袋鼠(捕食eugenii)．tamar有一个上皮-包膜性胎盘，由两个区域组成，无血管双侧脐包膜(BOM)和有血管的三侧脐包膜(TOM)，被末端血管，终窦分隔[44］．有袋类动物的orthologuesSLC22A2而且SLC22A3结合分子实验和转录组数据集分析进行研究。随后在胎盘和其他组织中进行印迹分析，以确认其印迹。我们进一步评估了蛋白质定位，以确定保守转运蛋白的功能。在这里，我们对此进行报道SLC22A3但不是SLC22A2是印在胎盘上的。通过确认SLC22A3印痕，这项研究揭示了IGF2R在有袋类哺乳动物中，无论是转位还是独立习得，印迹域都被强烈选择IGF2RDMR。

识别的有袋类动物SLC22A2

目的:研究有袋类动物的印记群IGF2R基因座，有袋类动物的同源SLC22A2使用小袋鼠基因组数据库(Wallabase:https://wallabase.science.unimelb.edu.au/)与小鼠SLC22A2比较(登录号:NM_013667.3)。1693 bp的推定tamarSLC22A2被确定。在假定的tammarSLC22A2是在塔玛尔附近发现的吗IGF2R基因。此外，另一个SLC22A家族基因SLC22A1基因候选，被发现之间推定SLC22A2而且IGF2R，就像在真兽类动物身上看到的那样。基于这种守恒共时性，我们考虑了假定SLC22A2作为我们下游分析的候选基因。小鼠和人类SLC22A2有11个外显子，包括5个ʹ和3个ʹUTR，而推测的鼠型SLC22A2有9个外显子，但没有3个ʹUTR(图1)。1A).描述潜在的异构体SLC22A2胎盘中，全长胎毛SLC22A2抄本由5'和3'检查。利用BOM cDNA快速扩增cDNA末端(RACE)反应(图4)。1B). 5ʹRACE反应产生了一个明显的单一条带，而3’RACE反应根据所使用的引物产生了多个条带(图1)。1B).通过比较三种不同的3' RACE反应，我们确认只有最大的RACE产物含有部分SLC22A2具有多聚a尾和上游多聚腺苷酸化信号(图。1B).已识别的全长tamarSLC22A2包含11个外显子，编码554 a.a。1B).所鉴定的tamar SLC22A2与小鼠SLC22A2(相似度90%，同一性79%)和人类SLC22A2(相似度88%，同一性78%)具有较高的一致性。tamer SLC22A2与小鼠SLC22A2和人类SLC22A2共享主要促进超家族(MFS)结构域(图1)。1C)。

的tammarSLC22A2不存在于胎盘组织中吗

为了识别潜在的单核苷酸多态性(SNP)位点，我们分析了公开的tamar转录组数据集(SRA登录号:DRP001145)。在分析了几个成人组织(睾丸、肝脏、肺、心脏、脾脏和大脑)后，来自肝脏的转录组数据被证实具有映射读取SLC22A2外显子被RACE实验证实。幸运的是，肝脏转录组数据在基因的最后外显子处有一个信息性的SNPSLC22A2(无花果。2A).利用胎儿gDNA进行PCR，然后对PCR产物进行直接测序，进一步证实C/G SNP。在确定胎儿gDNA中杂合子C/G SNP后，进行等位基因表达分析SLC22A2成绩单。在BOM和TOM组织中，SLC22A2明显显示双等位基因表达(图。2B)。

识别的有袋类动物SLC22A3

目的:研究有袋类动物的印记群IGF2R基因位点，有袋动物的同源SLC22A3使用小袋鼠基因组数据库(Wallabase:https://wallabase.science.unimelb.edu.au/)和鼠标SLC22A3(登录号:NM_011395.2)。1692 bp的推定tamarSLC22A3被确定。在假定的tammarSLC22A3是在塔玛尔旁边发现的吗SLC22A2基因，就像在真兽类中看到的那样。基于这种守恒共时性，我们考虑了假定SLC22A3作为我们下游分析的候选基因。而老鼠和人类SLC22A3有11个外显子，包括5个ʹ和3个ʹUTR，推测的SLC22A3有11个外显子，但没有3个ʹUTR(图1)。3.A).描述潜在的异构体SLC22A3胎盘中，全长胎毛SLC22A3利用BOM cDNA进行5'和3' RACE反应检测转录本(图1)。3.B).当5'RACE反应产生一个明显的单一带时，3' RACE反应产生两种不同的RACE产物(图2)。3.B).每个RACE产品克隆和测序后，确认了两个不同的异构体。两种亚型都有聚a尾和上游聚腺苷酸化信号(图。3.B).尽管根据外显子结构的不同，至少有两种异构体，但所有异构体编码相同的563个氨基酸。该蛋白与小鼠SLC22A3和人类SLC22A3具有较高的同源性(相似度89%，同源性81%)，同源性91%，同源性84%。tamammar SLC22A3与小鼠和人SLC22A3共享MFS结构域(图。3.B和C)。

的tammarSLC22A3是否在双侧胎盘组织中有印迹

为了识别潜在的SNP位点，我们对发表的tamar转录组数据集进行了分析。在分析了几个成人组织(睾丸、肝脏、肺、心脏、脾脏和大脑)后，来自心脏和脾脏的转录组数据集被证实具有与SLC22A3基于RACE实验的外显子。幸运的是，心脏和脾脏的转录组数据在的第一个外显子都有一个信息性的SNPSLC22A3(无花果。4A). PCR反应确定T/G SNP后，进行等位基因表达分析SLC22A3使用SNP信息执行转录。在本研究检测的20个生物重复中，有3个样本具有明显的杂合SNP。在BOM组织中(n= 3),SLC22A3显示出强烈的等位基因表达倾斜，两个等位基因之间的信号强度差异超过5倍，3只动物中有2只表现出明显的母系表达，因为母系具有纯合子SNP(图5)。4B).另一种动物也表现出强烈偏斜的等位基因表达(图。4B).但是，由于该动物的母体是杂合子的，我们无法得出其亲本特异性表达的结论。同样动物的三叶虫胎盘组织没有表现出与BOM组织中相同的强烈偏倚等位基因表达(图。4C)。

SLC22A3在育儿袋幼心和脾有变异表达吗

因为老鼠Slc22a3印迹只在胎盘中观察到[20.), tammarSLC22A3可能有类似的组织特异性印迹图案。证实组织特异性的印记SLC22A3在tamar中，等位基因的表达SLC22A3以tammar pouch young (PYs)为研究对象。根据转录组数据显示，来自PYs的心脏和脾脏组织被用于这项分析SLC22A3这些组织中的表达。经检测12只动物，6只动物具有杂合子的T/G SNP。在这6种动物中，SLC22A3显示双等位基因在心脏的表达(图。5)．在脾脏中，虽然有2只雄鼠的信号强度偏表达，两种等位基因之间的差异超过两倍，但其他雄鼠和3只雌鼠显示双等位基因表达(图。5)．

SLC22A3印迹并不依赖于启动子DNA甲基化

鉴于tamar的印记SLC22A3在tamar胎盘中，我们接下来分析了其启动子的DNA甲基化，以询问tamar是否SLC22A3印迹是否依赖于DMR。基于MethPrimer项目，我们确定了位于tamar假定启动子区域的两个CpG岛SLC22A3(无花果。6)．对CpG岛的亚硫酸氢盐测序表明，在整个推定区域内，大多数CpG位点未甲基化SLC22A3在BOM和TOM组织中都有启动子的存在。6)．

SLC22A3存在于BOM和TOM的内皮细胞中

为了确定其在胎盘组织中的保守作用，我们检测了SLC22A3在BOM和TOM中的蛋白定位(图。7)．SLC22A3位于子宫内膜组织腔表面(图。7B).在BOM和TOM胎盘组织的内皮细胞中检测到SLC22A3蛋白(图1)。7C)。

在tamar胎盘中，SLC22A3但不是SLC22A2是印。就像老鼠，tamarSLC22A3印迹在BOM胎盘组织中很明显，但在本研究检查的其他组织中不明显。我们的结论是SLC22A3哺乳动物胎盘的印记是在IGF2R有袋类和真兽类哺乳动物的印迹域。

SLC22A3是一种多特异性有机阳离子转运体，可在细胞膜上转运多种底物和毒素[45，46，47］．在Slc22a3敲除小鼠，虽然没有明显的胎盘和胎儿生长缺陷，但对胎盘转移功能有影响[48］．与它的转运蛋白活性一致的是，老鼠Slc22a3定位于其绒毛膜尿囊性胎盘的迷宫层[49，50，51从母体血液中转移养分[52］．鼠标Slc22a3也存在于卵黄囊的内脏内胚层[51]，在那里营养吸收进入胚胎[53］．在tamema绒毛膜-卵磷脂胎盘中，BOM似乎比TOM负责从子宫分泌物中吸收更多的营养物质[54，55，56，57］．SLC22A3在BOM组织中印迹明显，提示SLC22A3印迹与无血管性BOM从子宫分泌物中摄取营养有关。基于免疫荧光，我们确认了tamar SLC22A3位于tamar卵黄囊(绒毛膜-卵黄)胎盘的BOM侧和TOM侧的内胚层细胞层。胎盘内膜细胞也来源于滋养层，在本研究和小鼠研究中[51小鼠和tamar之间，卵黄囊内胚层细胞中SLC22A3的表达是保守的。此外，由于迷宫层标记物GCM1也存在于胎盘内膜细胞层[56，58]，我们的数据表明SLC22A3在动物胎盘中是一种保守的营养转运蛋白，支持了之前的建议[56，59]内胚层细胞层是胎盘中营养物质运输的中心。

在胎盘中SLC22A3印迹仅在BOM组织中明显。然而，目前还不清楚为什么只有BOM组织而没有TOM组织显示印迹SLC22A3胎盘的表达。与它们在营养运输(BOM)或呼吸(TOM)中的功能作用相一致[44，57， BOM和TOM具有不同的转录谱[56］．这表明BOM组织是不同的转录调控，导致印迹表达SLC22A3．另外，TOM组织中的其他细胞如中胚层细胞和有核红细胞也可表达SLC22A3基因。在小鼠中,Slc22a3在内脏内胚层中高度表达，在内脏卵黄囊的中胚层细胞中存在，尽管表达量低[51]，因此，有可能是中胚层细胞被掩盖了SLC22A3印在tamar TOM上的表情。

鼠标Igf2r印迹结构域受lncRNA调控，Airn［20.，28，31］．的Airn转录本招募组蛋白修饰酶EHMT2，并在Slc22a3基因位点(31］．此外,Airn新兵H3K27me3来Slc22a2而且Slc22a3建立小鼠宽印迹结构域[22]，两者都没有启动子DNA甲基化Slc22a2或Slc22a3在老鼠20.，51]，表明两者都受组蛋白修饰印迹的调控。同样,人类SLC22A2而且SLC22A3胎盘中也缺乏启动子DMR [36］．和tamar一样，牛也有绒毛膜上皮性胎盘SLC22A3但不是SLC22A2在其胎盘的启动子区有DMR [33］．自AIRN在真兽类动物中是保守的[33，60，牛的研究表明SLC22A3即使在真兽类哺乳动物中，印迹机制也会有所不同。在我们的分析中，CpG岛在tamar的假定启动子上SLC22A3缺乏DNA甲基化。这表明tamarSLC22A3印迹并不像在小鼠和人类中那样，通过DMR在其启动子上直接沉默。在这种情况下，tamar lncRNA，【宗教】(伊斯兰教内专指拥护阿里的)“什叶派”( =Shiite)，很可能具有类似的功能Airn因为这个lncRNA也是由DMR表达的，DMR可能是ICR [43］．进一步分析EHMT2、PRC2和【宗教】(伊斯兰教内专指拥护阿里的)“什叶派”( =Shiite)在后续的研究中确定潜在的功能会很有趣吗【宗教】(伊斯兰教内专指拥护阿里的)“什叶派”( =Shiite)在沉默SLC22A3在胎盘中。

有袋动物的IGF2RDMR位于内含子12，而真兽类IGF2RDMR位于内含子2 [26，43，61(图。8A).基于这种基因组位置的差异，有袋动物和真兽类IGF2Rdmr可能是在有袋动物和真兽类的分化后转移的(图。8B和C)，或者它们可能是在有袋类和真兽类分裂后在每个哺乳动物谱系中独立获得的(图。8D) (43］．无论哪种情况，我们的研究都表明SLC22A3在哺乳动物的进化过程中，胎盘上的印记被强烈选择。8)．由于SLC22A3是胎盘组织中调节胎盘转移的多特异性转运蛋白，这种选择可能是为了控制营养物质供需平衡。

通过确认印痕SLC22A3有袋类动物胎盘中的基因，我们的数据表明SLC22A3有袋类动物和真兽类动物都强烈选择了印迹，这是DMR位置的差异。我们的数据进一步表明，在有袋动物和真兽类胎盘中，控制胎盘中的营养物质运输是基因组印迹的一个重要进化功能。

动物

Tammar小袋鼠(捕食eugenii)，它们来自袋鼠岛，被饲养在墨尔本大学繁殖基地的开阔草地上。如前所述，以人道方式杀害成虫和育儿袋幼虫[14，55，57］．妊娠后期三分之一胎儿的胎盘[妊娠26.5天的第19-25天(n= 20)]从成年雌性尸体中采集，并速冻或固定在4% (w/v)多聚甲醛(PFA)在磷酸盐缓冲盐水(PBS) (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na中₂HPO₄， 1.8 mM KH₂阿宝₄， pH7.4)，在组织分析前清洗并储存在100%甲醇中。出生后33 ~ 81天PY (n= 12)的尸体被解剖，心脏和脾脏立即被冷冻。所有动物实验都得到了墨尔本大学动物实验伦理委员会的批准，并遵循澳大利亚国家卫生和医学研究委员会(2013年)的准则。

RNA提取和cDNA合成

速冻胎盘组织由分离的无血管性双侧脐包膜(BOM)和血管性三侧脐包膜(TOM)组成(见图。7A)， PY脾脏和PY心脏使用GenElute哺乳动物总RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, Missouri, USA)按照制造商说明进行RNA提取。提取的RNA用无DNA DNA酶处理和去除试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)处理，以去除残留的基因组DNA (gDNA)。在确认用Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)去除gDNA和用RNA作为模板的PCR后，使用200 ng胎盘RNA或至多800 ng PY脾脏RNA或至多400 ng PY心脏RNA作为模板，使用SuperScript IV第一链合成系统(Invitrogen, Carlsbad, USA)进行cDNA合成。

cDNA末端5'和3'快速扩增(RACE)

确定有袋类动物的完整序列SLC22A2而且SLC22A3， 5'和3'，cDNA末端快速扩增(RACE)实验使用SMARTer RACE 5'/3'试剂盒(Clontech, California, USA)进行。使用SeqAmp DNA聚合酶(Clontech, California, USA)和基因特异性引物对BOM cDNA进行第一个RACE反应(附加文件)1)．用GoTaq DNA聚合酶(Promega, Wisconsin, USA)进行嵌套的5'和3' RACE反应，并用pGEM-T Easy Vector (Promega, Wisconsin, USA)克隆RACE产物大肠杆菌JM109感受态细胞(Promega, Wisconsin, USA)。使用Wizard Plus SV Minipreps DNA纯化系统(Promega, Wisconsin, USA)提取质粒，并直接用M13引物测序(附加文件)1)．

比较分析SLC22A2而且SLC22A3

DNA人类的序列SLC22A2,人类SLC22A3、鼠标Slc22a2和鼠标Slc22a3资料来源于NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)．从DDBJ/EMBL/GenBank/RefSeq数据库中检索的氨基酸序列用于使用CLC序列查看器8 (https://resources.qiagenbioinformatics.com/manuals/clcsequenceviewer/current/index.php?manual=CLC_Sequence_Viewer_vs_Workbenches.html)．加入数量:智人SLC22A2NM_003058.4;亩骶Slc22a2NM_013667.3;智人SLC22A3NM_021977.4;m .骶Slc22a3, NM_011395.2。用Prosite服务器(http://prosite.expasy.org/)．

转录组分析

来描述IGF2R印迹结构域以及识别信息性单核苷酸多态性(SNPs)、来自各种组织(睾丸、肝脏、肺、心脏、脾脏和大脑)的tammer转录组数据集被分析。公开的tamar raw RNA-seq数据集(DRP001145)从NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)．所有rna seq读取都使用TrimGalore!(v0.6.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore)和默认设置。修剪后的读数与小袋鼠基因组一致。v3 (https://wallabase.science.unimelb.edu.au)使用HISAT2 (v2.1.0) [62]，用参数RNA链度FR来反映测序后RNA的链度。Samtools (v1.9)将映射的读分配给每个链[63］．使用BCFtools (v1.9)调用SNP位点，并将输出文件与综合基因组查看器(IGV)上的映射读数进行比较[64，65］．

基因组DNA提取

采用速冻的BOM、TOM、PY尾和子宫内膜组织进行基因组DNA (gDNA)提取。BOM和TOM为胎儿gDNA来源，子宫内膜为母体gDNA来源。PY尾用于基因分型。按照制造商的说明，使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega, Wisconsin, USA)进行DNA提取。

等位基因的表达分析

提取的gDNA作为模板进行PCR扩增。用基因特异性引物进行PCR反应1)与Go-Taq聚合酶(Promega, Wisconsin, USA)在以下循环条件下:95°C 30 s, 65°C 30 s, 72°C 1 minSLC22A2而且SLC22A3成绩单，利用每个基因特异性的反向引物进行链特异性cDNA合成(附加文件1)．合成的cDNA作为模板，用Go-Taq聚合酶(Promega, Wisconsin, USA)在以下循环条件下进行PCR扩增:95°C 30 s, 65°C 30 s, 72°C 1 min。进行凝胶电泳后，提取gDNA和cDNA的PCR产物，直接用Sanger测序确定SNP位点和等位基因特异性表达。当两个等位基因之间的信号强度差异超过5倍时，我们认为偏倚表达为强偏倚表达。

亚硫酸氢盐测序

来自胎儿的纯化基因组DNA用于等位基因表达分析，用亚硫酸氢钠溶液处理，使用EpiMark亚硫酸氢钠转换试剂盒(New England Biolabs, Massachusetts, USA)。在亚硫酸氢盐处理基因组DNA后，使用EpiTaq聚合酶(Takara Bio, Shiga, Japan)和引物进行40次PCR循环(附加文件)1)由MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/)［66］．PCR产物使用pGEM T-easy载体(Promega, Wisconsin, USA)克隆大肠杆菌JM109感受态细胞(Promega, Wisconsin, USA)。使用Wizard Plus SV Minipreps DNA纯化系统(Promega, Wisconsin, USA)纯化质粒，并使用M13引物直接测序(附加文件)1)．用甲基化分析量化工具(QUMA)程序(http://quma.cdb.riken.jp)[67］．

免疫荧光染色(如果)

pfa固定的胎盘样本(妊娠第22天的BOM和TOM)在1 × PBS中洗涤，并在石蜡包埋前通过乙醇系列再水化。嵌入样品在5 μm处连续切片，并安装在聚赖氨酸涂层的载玻片上(ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA)。切片脱蜡，通过降低乙醇浓度再水，然后在0.1% (v/v) Triton X-100在1 × PBS (PBST)中室温培养15分钟，使组织通透。切片在Tris-EDTA (pH 8.0)中煮沸20分钟。切片用0.3% (w/v)苏丹黑在70% (v/v)乙醇溶液中处理15分钟，以减少自动荧光背景。苏丹黑处理切片用70% (v/v) EtOH和1 × PBS冲洗后封闭。然后，用1 × PBS稀释10% (w/v)山羊血清孵育切片1 h。阻断后，切片用一抗溶液孵育(附加文件2次日，切片用PBS冲洗三次，然后与荧光二抗体孵育(附加文件21 h。切片再次用1 × PBS洗涤3次，然后用4'，6-二胺基-2-苯林多(DAPI) (Sigma-Aldrich, Missouri, USA)孵育10分钟。dapi处理的切片用荧光安装液进行安装。所有治疗的对照均为无一抗和IgG同型对照抗体。图像收集在尼康A1R共聚焦激光显微镜系统(尼康，东京，日本)。

在当前研究中分析的数据集可在NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)作为DRP001145。

DMR:

差异甲基化区域

SLC22A2:

溶质载体家族22个成员

SLC22A3:

溶质载体家族22个成员3

拥有:

印迹控制区域

IGF2R:

胰岛素样生长因子2受体

信号:

长非编码

H3K27me3:

组蛋白3赖氨酸27三甲基化

PRC2:

Polycomb抑制性复合体

有效期:

IGF2R DMR中的反义lncRNA

物料清单:

Bilaminar omphalopleure

汤姆:

三层的omphalopleure

种族:

cDNA末端的快速扩增

一位:

氨基酸

我们感谢小袋鼠研究小组的所有成员在动物和解剖方面的帮助。作者感谢墨尔本大学生物光学显微镜平台(BOMP)对共聚焦显微镜的帮助。

这项研究得到了TI的墨尔本研究奖学金和澳大利亚研究委员会对MBR和Geoff Shaw教授的资助。

作者和联系

1. 墨尔本大学生物科学学院，墨尔本，维多利亚州，3010

   石原照仁，奥利弗·w·格里菲斯，玛丽莲·b·伦弗里

2. 麦考瑞大学生物科学系，悉尼，NSW, 2109，澳大利亚

   奥利弗·w·格里菲思

3. 新州大学农学院农业与生命科学系，日本长野399-4598

   Shunsuke铃木

贡献

TI、OWG、SS和MBR设计了研究;德州仪器进行实验;TI和MBR采集样品;TI, OWG, SS和MBR讨论了数据，TI和MBR撰写了论文。所有作者阅读并批准了该手稿。

相应的作者

对应到玛丽莲·b·Renfree．

伦理批准和同意参与

实验程序符合澳大利亚国家卫生和医学研究委员会(2013年)的准则，并得到墨尔本大学动物实验伦理委员会的批准。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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