通过全血表观基因组全关联研究，发现透明细胞肾细胞癌检测的潜在DNA甲基化生物标志物

背景

肾细胞癌(RCC)是世界上第14种最常见的癌症，约占所有癌症的4%。70%以上的RCC为透明细胞RCC (ccRCC)。到目前为止，还没有发现检测ccRCC的可靠生物标志物。本研究的目的是鉴定血液DNA甲基化(DNAm)标志物，用于早期发现和治疗ccRCC。

结果

为了识别ccRCC相关的DNAm标记，我们在发现阶段使用50名ccRCC患者和50名健康对照的全血DNA进行了靶向亚硫酸氢盐测序(TB-seq)和表观基因组全关联研究(EWAS)。EWAS采用线性回归模型进行。分析根据年龄、性别和估计的细胞类型组成进行了调整。在复制阶段，在48名独立的ccRCC患者和48名健康对照中验证了确定的ccRCC相关CpGs的准确性。我们鉴定了6种ccrcc相关的低甲基化cpgPCBD2 / MTND4P12在发现阶段(p< 1.75 × 10⁻⁸）;在复制阶段有四个是可重复的(p< 2.96 × 10⁻⁸)．在发现阶段(受试者工作特征曲线下面积[AUC-ROC] = 0.922)和复制阶段(AUC-ROC = 0.871)， 6个cpg的DNAm水平之和都是ccRCC的有效指标。而且，结果独联体-表达定量甲基化分析表明，ccrcc相关CpGs的DNAm水平影响基因表达转录因子7（TCF7),电压依赖性阴离子选择通道1（VDAC1)，它们与癌症的发展有关。

结论

在本研究中，我们鉴定了6种ccrcc相关的CpGsPCBD2 / MTND4P12EWAS使用基于血液的DNA我们发现六种cpg的DNAm水平PCBD2 / MTND4P12可能是早期ccRCC检测的潜在生物标志物，但作为生物标志物的价值需要在未来的研究中进行研究。

肾细胞癌(RCC)涉及肾实质恶性细胞的发展。RCC占所有癌症的4%和肾癌的80%，是全球第14种最常见的癌症[1］．大多数rcc是在健康检查和其他疾病(如高血压、糖尿病和肥胖症)检查时偶然发现的。RCC在男性和女性中的发病率之比为1.7-2.0:1 [2］．70%以上的RCC诊断为透明细胞RCC (ccRCC) [3.］．早期RCC的总体5年生存率约为93%，而转移性RCC患者的5年生存率仅为12% [4］．因此，早期诊断RCC对患者生存至关重要。然而，由于RCC早期没有主要症状，也没有有效的生物标志物，早期检测依赖于计算机断层扫描和超声检查。

11种生殖系突变(在BAP1，FLCN，跳频，见过，PTEN，SDHB，SDHC，SDHD，TSC1，TSC2,VHL)均可导致遗传性肾癌[5，6］．尽管在全基因组关联研究和荟萃分析中已经确定了18个rcc相关的单核苷酸多态性[7，8，9，10，11，12]，只有3-5%的RCC可以用遗传背景解释，具有遗传易感性的人在年轻时就会发生RCC。相比之下，大多数rcc在50岁后发病频率增加，通常可归因于吸烟、饮酒和肥胖等非遗传因素。近年来，不同组织学定义的RCC亚型(例如，ccRCC和CpG岛甲基化表型-RCC (cmp -RCC))表现出特征性突变、染色体拷贝数变化以及mRNA、miRNA和lncRNA表达模式[13，14］．

生物标记物检测必须简单且微创。从这个角度来看，那些使用在医学检查中收集的全血或血浆的人是最合适的。DNA甲基化(DNAm)是一种基因表达的调节因子，作为多种疾病(包括癌症)的潜在生物标志物而引起了人们的关注[15］．虽然使用肾组织来源DNA的微阵列DNAm分析已经鉴定出与肾细胞癌相关的几种DNAm生物标志物[16，17，18]，关于血液来源的DNAm生物标志物的报道很少。在全面的DNAm分析和表观基因组全关联研究(EWAS)中，微阵列因其高通量和低成本而得到广泛应用。癌症基因组图谱(TCGA)中总结的大部分DNAm数据[19]及EWAS数据中心[20.]来源于微阵列分析。然而，通过微阵列分析(如使用Infinium MethylationEPIC微阵列[21])在整个基因组中仅占CpGs的3-3.5%，这表明新的DNAm生物标志物可能隐藏在其他CpGs中，而没有在微阵列上检测到。因此，我们使用基于测序的方法探索了环境暴露和疾病相关的DNAm生物标志物[22，23，24，25，它们覆盖了大量的cpg。

在本研究中，为了识别基于全血的新型DNAm生物标志物用于检测ccRCC，作为RCC的主要类型，我们进行了靶向亚硫酸氢盐测序(TB-seq)，其成本低于全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)。我们使用来自ccRCC患者的全血DNA和匹配的健康对照，并对ccRCC进行EWAS。此外，为了验证确定的全血DNAm生物标志物用于ccRCC的准确性，在另一组独立的ccRCC患者和对照组中使用全血DNA进行DNAm分析和EWAS。

参与者特征

总体研究设计如图所示。1．本研究的个体特征如表所示1．在发现阶段，显著差异(pccRCC组与对照组糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、血脂异常或糖尿病患者数量均< 0.05)差异均有统计学意义(p < 0.05)。相比之下，复制阶段显示出显著差异(p在平均估计肾小球滤过率(eGFR)、糖化血红蛋白(HbA1c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和慢性肾脏疾病患者人数方面，ccRCC组与对照组的差异< 0.05)。在本研究的参与者中，处于发现阶段的ccRCC患者在国家癌症中心(NCC)医院接受了手术;因此，病理信息，如癌症分期和肿瘤大小是可用的。然而，25%的ccRCC患者在复制期因在其他医院接受手术而难以获得病理信息(表2)1)．发现组每个癌症阶段的肿瘤大小±SD平均值如下:I期，3.8±1.2 cm;II期，7.9±0.8 cm;III期，7.2±3.3 cm;IV期，7.7±3.7 cm。

表观全基因组关联研究

为了鉴定与ccRCC相关的差异甲基化CpGs，我们使用线性回归模型进行了表观基因组范围的关联分析。该模型对性别、年龄和细胞类型组成进行了很好的校正，膨胀因子(λ值)为1.030(95%置信区间(CI): 1.027-1.033)(图2)。2一个)。

在发现阶段，EWAS结果显示有11个cpg与p-低于建议阈值的值(p< 1.00 × 10⁻⁶)，其中6项低于显著性阈值(p< 1.59 × 10⁻⁸)．6个cpg位于两个pterin-4 -甲醇胺脱水酶2而且MTND4P12(线粒体编码的NADH:泛醌氧化还原酶核心亚基4假基因12)5号染色体上的基因(图;2b和附加文件1:表S1)。6个ccrcc相关DNAm标记周围的Chr5:134923256-134928594区域密集分布着DNase I超敏位点(DHS)、转录因子结合位点(TFBS)和cctc -结合因子(CTCF)结合位点(图5)。2c).与Tohoku Medical Megabank (TMM)组(健康对照组)相比，ccRCC组的6个CpGs的甲基化程度约低10%，这表明这些CpGs与ccRCC相关(图2)。3.a).参考区间(RI)，定义为个体间DNAm水平的变化[22]，在TMM组中，所有6个cpg均大于30%，这表明cpg在个体之间的DNAm水平存在差异(附加文件1:表S1)。此外，为了确定EWAS的结果是否受到参与者特征的显著差异的影响(p< 0.05;HbA1c、TC、血脂异常和糖尿病)，将这些特征添加到矫正期进行EWAS。结果表明，6种与ccrcc相关的CpGs在PCBD2 / MTNT4P12基因校正后仍与ccRCC相关(p< 0.05;额外的文件1:表S2)。

在复制阶段，p来自ccRCC EWAS的-值没有完全校正性别、年龄和细胞类型组成，λ值计算为1.109 (95% CI: 1.104-1.112)，表明有轻微膨胀(附加文件)2:图S1a)。EWAS结果显示相同的6个cpgPCBD2 / MTND4P12低于提示阈值;6个cpg中有4个低于显著性阈值(p< 3.42 × 10⁻⁸)(附加文件1:表S3和附加文件2:图S1b)。与发现阶段一样，与TMM组相比，ccRCC组中6个CpGs的甲基化减少了约10%(图2)。3.b)， RI大于30%(补充文件1:表S3)。此外，为了确定EWAS的结果是否受到参与者特征的显著差异的影响(p< 0.05;eGFR, HbA1c, HDL和慢性肾脏疾病)，进行EWAS，将这些特征添加到校正期。结果表明，6种与ccrcc相关的CpGs在PCBD2 / MTNT4P12基因校正后仍与ccRCC相关(p< 0.05;额外的文件1:表S4)。

为了研究ccrc相关DNAm标记物中DNAm水平与癌症分期之间的趋势，我们进行了Jonckheere-Terpstra趋势检验。在对照组和所有阶段的ccRCC中，DNAm水平有显著差异(附加文件)2:无花果。S2和S3)。但在发现期和复制期，肿瘤分期间均无变化趋势。

独联体-表达数量性状甲基化(独联体-eQTM)分析

在基于血液的多组学数据库iMETHYL中，我们发现有56个注释基因位于其上游或下游的100万个碱基对范围内PCBD2 / MTND4P12．表达水平与6种CpGs中DNAm水平相关的基因PCBD2 / MTND4P12由独联体-eQTM分析;T细胞特异性转录因子7 (TCF7)和电压依赖性阴离子选择通道蛋白1 (VDAC1)均显著相关(表2)．TCF7而且VDAC1分别位于上游80万和90万个碱基对PCBD2 / MTND4P12,分别。eQTM结果显示，5号染色体134927085位点CpG的高甲基化与基因表达增加显著相关TCF75号染色体134927106位点CpG的高甲基化与基因表达降低有关VDAC1(表2)．换句话说，ccRCC中CpGs的低甲基化与基因表达的降低有关TCF7基因表达增加VDAC1．与此同时,独联体-eQTM分析表明，6种CpGs的DNAm水平对基因表达水平影响不大PCBD2/MTND4P12(附加文件1:表S5)。

受试者工作曲线下面积(AUC-ROC)分析

为了研究确定的六种CpGs是否是ccRCC检测的有效DNAm生物标志物，我们使用六种CpGs中的每一种的DNAm水平及其DNAm水平之和进行了ROC曲线分析。在发现阶段，6个CpGs的DNAm水平均高到足以检测出ccRCC，但6个CpGs的DNAm水平之和显示出最好的ccRCC检测(AUC-ROC = 0.922)(表3.和无花果。4a).此外，当考虑6个cpg的DNAm水平之和时，复制阶段的ccRCC检测能力略低于发现阶段，但足以可靠(AUC-ROC = 0.871)(表3.和无花果。4b)。

使用微创筛查早期发现ccRCC对患者的治疗和生存非常重要。在本研究中，我们确定了6个cpg位于PCBD2 / MTND4P12首次使用TB-seq和EWAS作为与ccRCC相关的全血DNAm生物标志物。我们的研究结果不仅有助于早期发现和治疗ccRCC，而且还证明了基于测序的DNAm分析在寻找新型癌症相关DNAm生物标志物方面的有效性。

本研究中发现的含有ccrcc相关CpGs的DNA区域之前没有被确定为具有ccrcc相关CpGs，因为它没有用于常见的商业DNAm微阵列。此外，因为在人类基因组中有多个区域与PCBD2 / MTND4P12该区域的特异性PCR引物设计较为困难。然而，通过使用特定的探针可以杂交到PCBD2 / MTND4P12TB-seq分析能够避免传统PCR无法扩增该区域的问题。大多数先前报道的全基因组DNAm分析都是使用微阵列技术进行的。微阵列分析可以检测加载在微阵列上的cpg的DNAm水平，但不能检测未加载的cpg。换句话说，很难考虑DNAm分析的结果，包括位于微阵列加载的cpg周围但未加载在微阵列上的cpg的DNAm水平。在之前报道的癌症DNAm生物标志物中，只有0.8%得到了验证，而通过微阵列分析识别的DNAm生物标志物的大量假阳性是有问题的[15］．相比之下，基于测序的分析可以将DNAm标记作为“区域”检测，这与单个CpG位点相比，提高了生物标记的鉴别能力。未来基于测序的DNAm分析和EWAS在cccc以及各种其他疾病中的应用将允许识别新的DNAm标记，以早期发现这些疾病。

6个ccrcc相关CpGs所在区域的基因组结构包括TFBS和ctcf结合位点，提示该区域DNAm水平的变化会影响染色质结构，进而影响附近的基因表达。事实上，iMETHYL数据库的eQTM结果显示PCBD2 / MTND4P12影响基因表达VDAC1而且TCF7，它们位于上游的80 - 90万个碱基对。VDAC蛋白位于血浆和线粒体外膜上，与腺嘌呤核苷酸的转运有关[26]、钙离子[27]，以及若干代谢产物[28]进出线粒体和细胞。在正常凋亡刺激下，VDAC1与促凋亡蛋白Bax和其他VDAC分子相互作用，通过促进细胞色素c从线粒体释放到细胞质来寡聚和抑制凋亡。过度的VDAC1已在几种癌细胞系中观察到，并被认为是癌细胞线粒体异常的重要促成因素，包括ccRCC [29，30.，31］．目前的研究支持这些结果。然而，本研究并没有直接考察VDAC1基因在ccRCC患者血细胞中的表达，这应该在未来进行检查。

与此同时,TCF7本研究发现的另一个eQTM基因，编码转录因子T细胞因子-1 (TCF1)，该基因具有DNA结合和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性，在包括先天淋巴细胞和T细胞在内的多种淋巴系的发育中发挥重要作用。TCF1 (TCF7)与转录因子LEF1一起参与cd8阳性T细胞的命运[32，33］．尽管过度表达TCF1（TCF7)已在几种癌症类型的肿瘤组织中报道，包括ccRCC [34，35，36的表达式配置文件TCF1（TCF7)基因在癌症患者的血细胞中很少有报道，目前细节尚不清楚。虽然这是一项数据驱动的eQTM分析，但这项研究为TCF1 (TCF7)提供了新的见解，因为据我们所知，这是第一次显示6个CpGs的低甲基化在中国PCBD2 / MTND4P12与减少有关TCF1（TCF7基因表达(表2及其他资料1:表S5)。但是，由于我们没有分析表达式TCF1（TCF7)基因在本研究中对ccRCC患者血液细胞中的基因进行了分析，今后有必要进行这样的分析。

本研究的主要局限性在于其主要针对日本患者。目前尚不清楚ccrcc相关的CpGs是否在其他种族群体中也可检测到，有必要验证已识别的ccrcc相关DNAm标记在其他种族群体中的有效性。此外，本研究仅调查了ccRCC;因此，不可能区分识别出的与ccrcc相关的cpg是ccrcc特异性的还是其他癌症常见的。为了澄清这一点，应该对其他类型的癌症进行基于测序的DNAm分析和EWAS。虽然本研究发现了一种基于血液的DNAm标志物用于检测ccRCC，但血细胞DNAm水平的变化并不能解释ccRCC的病因。因此，需要进一步的研究来揭示为什么低甲基化PCBD2 / MTND4P12发生在ccRCC患者的血细胞DNA中。

我们鉴定出6个低甲基化cpgPCBD2 / MTND4P12作为ccRCC的DNAm生物标志物。此外，我们发现这6种cpg的DNAm水平之和可以更准确地检测ccRCC。鉴定出的CpGs是新的DNAm生物标志物，可能在ccRCC诊断中有用。本研究的结果为早期发现和治疗ccRCC以及ccRCC治疗方法的发展提供了新的选择。

道德

本研究由国立癌症中心(日本东京)、庆应义塾大学和岩手医科大学伦理委员会批准(批准ID: HG H25-19)。所有实验均按照批准指南进行。所有参与者提供书面知情同意书。

研究参与者和样本收集

这项研究分为两个阶段:发现和复制。在发现阶段，50名ccRCC患者的全血DNA由NCC(东京，日本)提供，50名性别和年龄匹配的健康对照者的全血DNA由Tohoku Medical Megabank社区队列研究(TMM CommCohort)提供[37］．在复制阶段，NCC和TMM CommCohort分别为ccRCC和对照样本提供了48个个体的全血DNA(与发现阶段无关)。所有血液样本均在EDTA采血管中采集，NCC样本使用Gentra Puregene blood Kit, TMM CommCohort样本使用QIAGEN Autopure LS纯化血源DNA。ccRCC通过影像学(MRI或CT)以及熟练的病理学家的显微和大体观察进行诊断。在两个阶段中，ccRCC组和TMM组样本在±2年内进行年龄匹配，并尽可能匹配身体质量指数(BMI)。使用个人健康检查和自我报告问卷来确定吸烟状况、饮酒状况和流行疾病(即慢性肾脏疾病、高血压、血脂异常和糖尿病)。使用配对t检验(如实验室值)和卡方检验(如疾病流行率)对参与者特征进行显著性检验。

测序文库和TB-seq的制备

基因组DNA等分(gDNA;1 μg)，在50 μL TE缓冲液中洗脱，使用Covaris LE220聚焦超声仪(thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA)剪切成150-200 bp片段。TB-seq测序文库使用Agilent SureSelect Human Methyl-Seq捕获文库和试剂盒在Agilent Bravo自动化文库制备系统(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)上按照制造商说明制备。在复制阶段，我们使用安捷伦SureSelect Human Methyl-Seq自定义捕获试剂盒和定制探针(即常见的DNA甲基化变异(CDMV) [22]探测集)。使用EZ DNA甲基化金试剂盒(Zymo Research, Irvine, CA, USA)对所有测序文库进行亚硫酸氢盐处理。将合并的17-pM文库加入20% PhiX Control v3 (Illumina Inc.， San Diego, CA, USA)，并在HiSeq 2500系统(Illumina)上进行配对端测序(2 × 125 bp)。

靶向CpGs的DNA甲基化分析

使用Illumina bcl2fastq2转换软件v2.20将原始测序数据转换为FASTQ格式。使用FastQC软件v0.11.5评估原始数据的测序质量，使用Trim Galore软件v0.4.2修剪适配器，删除短读(< 20 bp)。其余的读数与基因组参考联盟人类参考38 (GRCh38)构建一致，从UCSC基因组浏览器网站下载[38]，使用Novoalign软件v3.6.5。如先前报道的那样，使用生物信息学工具处理对齐的数据[25］．使用NovoMethyl软件v1.4检测甲基化CpGs，使用R软件v3.3.1计算目标CpGs的甲基化水平。

表观全基因组关联研究

使用线性回归模型进行EWAS，以确定与ccRCC相关的差异甲基化CpGs。分析根据年龄、性别和估计的细胞类型组成进行了调整。使用estimateCellCounts估算细胞类型组成。minfi Bioconductor封装中的R功能[39，40作了修改。具体来说，不是使用Illumina Infinium HumanMethylation450数据在flowsort . blood中实现的分类血细胞群。在Bioconductor的450 k包中，我们参考了来自6个分类的白细胞群体(B细胞，CD4细胞，CD4细胞)的DNAm数据⁺T淋巴细胞，CD8⁺T淋巴细胞，单核细胞，NK细胞和中性粒细胞)来自12个个体的全基因组亚硫酸氢盐测序[22，23]，并选择每种细胞类型中显示高甲基化和低甲基化CpGs的前50个CpGs进行进一步分析。所有分析均在相同的条件下进行，全基因组提示阈值定义为p< 1.00 × 10⁻⁶；但是，bonferroni校正显著性阈值设置为p< 1.59 × 10⁻⁸(0.05/3145479)在发现阶段和p< 3.42 × 10⁻⁸(0.05/1460699)。本研究中使用的统计分析脚本可在我们的GitHub网站(https://github.com/H-Ohmomo/ccRCC_EWASscript_20220323)．

通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线，评估识别的CpGs作为全血DNAm生物标志物对ccRCC的预测准确性。特异性、敏感性和曲线下面积(AUC)根据DNAm水平使用ROCR计算[41]和pROC [42)包。

为了检查ccRCC和ccRCC癌症阶段显著不同甲基化CpGs的DNAm水平之间的趋势，我们使用DescTools包进行了Jonckheere-Terpstra趋势测试[43有统计学意义的差异定义为P_趋势< 0.05。

定量性状甲基化分析

为了评估ccrcc相关的CpGs与基因表达之间的关系，我们进行了独联体-eQTM分析，采用简单线性回归模型，使用iMETHYL数据库[44］．表达式级别[log .₁₀(FPKM + 0.1)]为因变量，各ccrcc相关CpG位点的DNAm水平为自变量。邻近地区(独联体)定义为ccrcc相关cpg上游或下游100万碱基对内的区域。

为了保护参与者的隐私，每个人的DNA甲基化信息不能公开。不过，DNA甲基化信息的汇总统计数据将在iMETHYL数据库(http://imethyl.iwate-megabank.org)。

AUC-ROC:

接收机工作特性曲线下面积

ccRCC:

透明细胞肾细胞癌

CTCF:

CCCTC-binding因素

CDMV:

常见的DNA甲基化变异

装备:

染色体

CIMP-RCC:

CpG岛甲基化表型- rcc

论文认定:

胞嘧啶,鸟嘌呤,核苷酸

CT:

计算机断层扫描

DNAm:

DNA甲基化

表皮生长因子受体:

估计肾小球滤过率

eQTM:

表达数量性状甲基化

ewa:

表观全基因组关联研究

FPKM:

每百万外显子每千碱基的片段数

gDNA:

基因组DNA

GRCh38:

基因组参考联盟人类参考文献38

核磁共振成像:

磁共振成像

碾压混凝土:

肾细胞癌

国际扶轮:

参考区间

TB-Seq:

Targeted-bisulfite测序

TFBS:

转录因子结合位点

TMM CommCohort:

东北医疗megank社区队列

WGBS:

亚硫酸氢盐全基因组测序

作者感谢Kumi Furusawa和Miyuki Horie在本研究中对实验的帮助。我们要向东北医疗megank社区队列(TMM CommCohort)研究的所有参与者表示最深切的感谢。我们也要感谢岩手医科大学的岩手东北医学大银行组织成员和东北大学的东北医学大银行组织成员的支持和鼓励。

这项研究得到了日本医学研究开发机构(AMED;授予号JP17km0105003和JP17km0105004)。

作者及隶属关系

1. 岩手医科大学灾难重建中心，日本岩手市八叶町石wa郡Idaidori 1-1-1，邮编028-3694

   大模秀树，小木翔平，须藤洋一，八屋刚，小野加奈子，朝日光一，佐佐木诚和清水敦

2. 岩手医科大学生物医学科学研究所生物医学信息分析科，日本岩手市八叶町石和郡Idaidori 1-1-1, 028-3694

   Hideki Ohmomo, Tsuyoshi Hachiya & Atsushi Shimizu

3. 庆应义塾大学医学院病理科，东京新宿区Shinanomachi 35号，日本，160-8582

   新井Eri &金井Yae

4. 国立癌症中心医院泌尿科，东京中央区筑地5-1-1，日本，104-0045

   )藤本

5. 国立癌症中心研究所临床基因组学部，东京中央区筑地5-1-1,104-0045，日本

   Teruhiko吉田

6. 日本岩手市八叶町石和郡Idaidori 1-1-1，岩手市，028-3694，岩手市医科大学内科肾病和高血压科

   Koichi朝日

7. 岩手医科大学生物医学研究所超高场磁共振事业部，日本岩手市八叶町石和郡井田道里1-1-1，邮编028-3694

   Makoto佐佐木

贡献

概念和设计:HO, EA, YK, AS。数据获取:HO, SK, KO。数据分析与解释:HO, SK, YS, TH, KA, AS。稿件的撰写、评审和/或修改:所有作者。行政、技术或物质支持:EA、HF、TY和YK。研究指导:MS和AS。作者阅读并批准最终的手稿。

相应的作者

对应到Atsushi清水．

伦理批准并同意参与

本研究由国立癌症中心(日本东京)、庆应义塾大学和岩手医科大学伦理委员会批准(批准ID: HG H25-19)。所有参与者提供书面知情同意书。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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