长期服用阿司匹林和表观遗传有丝分裂时钟用于癌症风险预测:健康结肠黏膜的发现和对未来表观遗传衰老研究的建议

背景

尽管已知有丝分裂在结直肠癌中的作用，但以前长期服用阿司匹林与抑制癌症相关的表观遗传衰老的关系并不涉及表观遗传有丝分裂时钟。我们使用三种用于癌症风险预测的表观遗传有丝分裂时钟:EpiTOC, EpiTOC2和MiAge来研究这些关系。我们利用公开的HumanMethylationEPIC BeadChip数据，从28名波兰女性(11名非阿司匹林使用者和17名长期[≥2年]阿司匹林使用者)筛查队列中采集了112份健康结肠(近端和远端)粘膜样本，这些样本在基线(T1)和10年随访(T2)时采集。有丝分裂时钟值除以每个时间点的实际年龄，以获得内在率(IRs)。我们评估了经BMI、息肉状态和DNA甲基化批处理调整后的线性混合效应模型中有丝分裂时钟IRs残差的差异。

发现

EpiTOC、EpiTOC2和MiAge与实际年龄显著相关(P< 0.05)，相关系数为0.41 ~ 0.63。在近端和远端样本中，EpiTOC、EpiTOC2和MiAge时钟彼此之间有很强的相关性(r> 0.79,P< 0.0001)。我们观察到EpiTOC组内近端中位时钟IR减速(-0.0004 DNAm，P= 0.008)， EpiTOC2(−16个细胞分裂，P= 0.009)， MiAge(−3个细胞分裂，P= 0.002)用于T1至T2期间长期服用阿司匹林者，而非服用者则不适用。在远端样本中，只有长期使用MiAge IR的人明显加速(−3个细胞分裂，P= 0.009)。

结论

我们观察到的结果支持先前报道的阿司匹林使用与近端结肠其他表观遗传年龄减缓的纵向关联。我们的有丝分裂时钟结果表明，细胞增殖可能在阿司匹林与表观遗传衰老的某些关系中发挥作用。此外，这些发现为建立表观遗传衰老的金标准提供了额外的动力，并为未来表观遗传衰老癌症研究中更全面的报告提供了共识指南。

现有数据，包括来自人类随机对照试验的证据，表明阿司匹林可能对某些人群的结直肠癌有保护作用[1，2，3.］．根据这一证据，美国预防服务工作组(USPSTF)发布了指南，建议在50-59岁、10年心血管疾病风险≥10%的成年人中使用低剂量阿司匹林进行CRC的一级预防[4］．尽管人们对阿司匹林作为结直肠癌化学预防药物可能发挥的作用持乐观态度，但患者长期服药的问题、治疗禁忌症以及结直肠癌现有的巨大发病率——全球第三大最常见的癌症，估计每年有180万新病例[5] -确保继续需要进行疾病筛查和监测[1］．因此，确定阿司匹林的使用与CRC筛查和监测方式之间的关系非常重要。

表观遗传衰老的测量是CRC筛查和监测的潜在新模式之一[6，7］．这些基于DNA甲基化的指标，有时被称为“表观遗传时钟”，被认为代表生物衰老，而不是时间衰老，可以更好地了解个人目前和未来的发病率和死亡风险[8，9］．迄今为止，血液表观遗传年龄加速(Horvath的泛组织度量[10])与未来结肠癌的发展有关[11]，生存相关的表观遗传年龄加速(Horvath度量)也在结肠肿瘤中得到证实[12］．此外，最近一项对波兰女性健康结肠组织的10年研究报告了表观遗传年龄减速(表型年龄指标[13])在长期服用阿司匹林者与未服用阿司匹林者的近端结肠中[14］．虽然这些研究确实利用了最著名的表观遗传年龄测量，但它们不包括估计细胞分裂的表观遗传衰老测量，也就是所谓的“有丝分裂时钟”。了解阿司匹林和CRC与有丝分裂时钟的关系尤其重要，因为许多其他表观遗传时钟捕捉到的与实际年龄的偏差与细胞增殖无关[14］．这可能会导致阿司匹林与表观遗传衰老过程的关系完全与增殖无关的结论，但情况可能并非如此。研究这些关系也可能为进一步了解阿司匹林的化学预防潜力的机制提供见解。有丝分裂在结直肠癌中的已知作用为有丝分裂时钟分析提供了额外的动力[15］．

我们在文献中确定了三种有丝分裂时钟测量方法:表观遗传时间到癌症(EpiTOC)，表观遗传时间到癌症-2 (EpiTOC2)和有丝分裂年龄(MiAge) [16，17，18］．EpiTOC是其385个组成CpG位点上的平均DNA甲基化，并表示由于这些位点上假定的细胞复制错误而导致的DNA甲基化年龄累积增加[16］．此外，EpiTOC利用定位于Polycomb组靶基因的CpG位点，这些位点在许多胎儿组织中通常是未甲基化的，但在衰老和个体发育过程中会获得甲基化。它提供的值是每个干细胞分裂数量的相对估计值。EpiTOC2生物标志物比EpiTOC更可靠，因为它可以估计组织中干细胞分裂的累积数量，从而产生直接有丝分裂计数估计[17］．在各种癌症、侵袭前癌症病变(包括结直肠腺瘤)和暴露于香烟烟雾(一种已知的致癌物)的正常颊组织中，已经证实了EpiTOC和EpiTOC2的增加[16，17］．MiAge被设计用来表示一个组织的终生细胞分裂总数，当将肿瘤与邻近的正常组织进行比较时，发现在13种癌症类型(包括结肠腺癌)中，MiAge普遍加速[18］．加速的MiAge也被发现与较差的癌症生存率有关[18］．

在目前的分析中，我们使用了前面提到的波兰健康冒号数据集[14]并探索了长期服用阿司匹林与EpiTOC、EpiTOC2和MiAge的关系。此外，我们对现有的CRC表观遗传衰老研究进行了盘点，并为该领域的未来工作提供了建议。

研究人口和数据收集

我们使用公开的NCBI GEO MethylationEPIC BeadChip健康结肠粘膜数据集(系列GSE142257，更新于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo2020年11月9日)。该数据集包括来自31名健康波兰女性的124例正常盲肠(近端)和乙状结肠(远端)结肠黏膜活检，收集这些数据用于先前对阿司匹林使用和表观遗传衰老的纵向分析[14］．在基线(T1)和10年后(T2)随访期间对妇女进行结肠镜检查和粘膜活检。每个研究参与者总共进行了4次活检，在T1时进行近端和远端活检，在T2时进行近端和远端活检。通过自我管理问卷评估基线(T1)和随访(T2)的阿司匹林使用情况，并将其分为非使用者和长期使用者(每周≥两次，持续≥2年)。在31名研究参与者中，有17名在T1时为长期使用者，20名在T2时为长期使用者——3名从T1的非使用者在T2时转变为长期使用者。鉴于本研究旨在检查阿司匹林使用与表观遗传有丝分裂时钟在10年研究期间的纵向关系，因此将这3名交叉使用阿司匹林的个体排除在分析之外，只留下28名受试者(112个粘膜样本)。数据集还包含参与者的实际年龄、bmi指数、DNA甲基化批数，以及在T1或T2结肠镜检查中是否观察到任何类型的息肉(是与否)。关于研究参与者的更多细节，以及关于该数据收集的知情同意和研究信息的道德行为，可在数据的原始出版物中找到[14］．

DNA甲基化数据和表观遗传有丝分裂时钟

根据该数据集的最初发表，使用带窄带成像的高清结肠镜检查来获得正常的粘膜活检，并从这些新鲜的活检中提取基因组DNA。然后使用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip进行全基因组DNA甲基化分析[14］．Minfi预处理和归一化DNA甲基化数据由本手稿的作者从NCBI下载。从文献综述中，我们发现了三种稳健的表观遗传有丝分裂时钟，用于甲基化epic串珠芯片数据:16]， EpiTOC2 [17]和MiAge [18］．使用指令和R代码从下载的甲基化beta值计算出EpiTOC和EpiTOC2https://doi.org/10.5281/zenodo.2632938．同样地，MiAge也从下载的甲基化beta值中计算出来，使用的指令和R代码在http://www.columbia.edu/~sw2206/softwares.htm．

统计分析

我们使用年龄无关的内在率(IRs)对每个有丝分裂时钟进行了初步分析。如文献所述[17]，这些IRs是通过将每个参与者的有丝分裂时钟值除以各自的实际年龄来计算的。然后，为了检查在我们的两个时间点之间，非用户和长期用户之间的有丝分裂时钟IRs是否独立于其他协变量，我们为每个测量创建了加速度残差。更具体地说，在线性混合效应模型中，通过回归所有112个样本中每个有丝分裂时钟的IRs来获得IR残差，这些样本分别是基线和随访BMI、息肉状态和DNA甲基化批次。该模型还包括对参与者的随机拦截，以解释每个参与者的重复测量。然后，我们在组内分别对非阿司匹林使用者和长期阿司匹林使用者的EpiTOC、EpiTOC2和MiAge IR残差进行配对Wilcoxon秩检验。最后，我们进行了分析，以确定从T1到T2组间有丝分裂时钟IR变化是否存在统计学上的显著差异(比较非阿司匹林使用者和长期阿司匹林使用者)。对于非阿司匹林使用者和长期阿司匹林使用者，我们分别从T2减去T1处的有丝分裂时钟值。然后，我们进行了Wilcoxon秩和检验，以比较两组阿司匹林使用之间的这些“差异”值。所有分析都重复了EpiTOC、EpiTOC2和MiAge残差(不除以实际年龄)。所有统计分析均使用R 3.6.3版本(R核心团队，维也纳，奥地利)进行P以< 0.05为阈值，有统计学意义。

表格1介绍了研究参与者的基线(T1)和随访(T2)临床和有丝分裂时钟特征。所有参与者都是女性，39%(11人)在10年的研究期间没有服用阿司匹林。在基线和随访时，非用户的平均(SD)年龄分别为53.8(6.7)岁和63.8(6.7)岁。在基线和随访时，长期服用阿司匹林者的平均(SD)年龄分别为60.2(5.7)岁和70.2(5.7)岁。非阿司匹林使用者和长期阿司匹林使用者的基线中位年龄分别为50岁和60岁(Wilcoxon秩和检验)P= 0.01)。在基线时，大多数非使用者在结肠镜检查中观察到息肉(64%)，BMI较高(≥26 kg/m)²)(55%)。在随访中，大多数非使用者在结肠镜检查时没有息肉(91%)。在基线时，大多数长期服用阿司匹林的患者BMI正常(在8.5 ~ 25 kg/m之间)²)(59%)，结肠镜检查时没有息肉(76%)。在长期使用者的随访中观察到类似的模式。

在每个时间点，与长期用户相比，非用户的所有中位数EpiTOC、EpiTOC2和MiAge值都较低，不考虑基线年龄。在非使用者中，从T1到T2，近端和远端结肠的EpiTOC、EpiTOC2和MiAge中值增加。在T1至T2长期服用阿司匹林的患者中，近端MiAge中值下降。长期服用阿司匹林的所有其他中位数从T1上升到T2。数字1在非使用者和长期使用者中，每个时间点近端和远端样本的EpiTOC、EpiTOC2和MiAge与实际年龄的相关性。所有相关均有统计学意义(P< 0.05)，相关系数为0.41 ~ 0.63。远端结肠样本的EpiTOC和MiAge与实际年龄的相关性最强。在近端，EpiTOC, EpiTOC2和MiAge之间的所有相关性都很强。r> 0.89,P< 0.0001)和远端(r> 0.79,P< 0.0001) T1和T2的样品。在两个结肠位置和两个时间点，EpiTOC和EpiTOC2之间的所有相关性都特别强(r> 0.99,P< 0.0001)。

表格2显示中位有丝分裂时钟IR残差随时间点、阿司匹林使用和结肠位置的变化。相比之下，在两个结肠部位以及非阿司匹林使用者和长期阿司匹林使用者中，T2 IR残差中位数均低于T1 IR残差中位数。然而，这种减速在长期服用阿司匹林的近端结肠中具有统计学意义。我们观察到EpiTOC的中位时钟IR减速(−0.0004 DNAm，P= 0.008)， EpiTOC2(−16个细胞分裂，P= 0.009)， MiAge(−3个细胞分裂，P= 0.002)。我们还观察到远端结肠MiAge的中位时钟IR减速(−3个细胞分裂，P= 0.009)。数字2使用有丝分裂时钟IR残差随时间点和长期服用阿司匹林的箱线图图形描述这些结果。在EpiTOC (0.013 DNAm，P= 0.002)， EpiTOC2(796个细胞分裂，P= 0.003)， MiAge(207次细胞分裂，P= 0.007)残差不考虑实际年龄，观察到远端长期使用者结肠有丝分裂时钟加速的相反趋势(表S1)．在这些结果中，与T1中位数残差相比，T2中位数残差也有更高的总体趋势。

表格3.显示未服用阿司匹林者和长期服用阿司匹林者之间中位有丝分裂时钟IR残差的基线和10年随访比较。对于所有时钟和结肠近端，与非使用者相比，长期使用者的T2 - T1 IR残差中位数差异更负。尽管如此，这些关系都没有达到统计显著性的阈值。数字3.使用箱线图图形化地描述这些结果。表的年代2使用不考虑实际年龄的EpiTOC、EpiTOC2和MiAge残差进行相同分析的结果。在这里，结果不符合统计显著性，趋势不太明显。

在这项为期10年的健康结肠DNA甲基化数据分析中，我们研究了长期服用阿司匹林与表观遗传有丝分裂时钟的关系。我们观察到长期服用阿司匹林的人近端(盲肠)结肠样本中有丝分裂时钟IR减慢的趋势，而非服用阿司匹林的人则没有。

我们进行这一分析的基本原理源于观察到许多表观遗传衰老和CRC的研究没有检查与表观遗传有丝分裂时钟的关系。这种生物标记物利用的差距可能源于研究人员缺乏熟悉。Hannum [19霍瓦特[10表观遗传衰老测量首次在2013年的文献中被描述，而MiAge [18]， EpiTOC [16]，和EpiTOC2 [17]，分别于2018年、2016年和2020年推出。然而，鉴于有丝分裂与癌症的已知关系[20.，我们假设有丝分裂时钟在检测癌症关系方面可能更敏感。我们从长期使用阿司匹林的分析中得到的数据表明，有丝分裂时钟可能反映了类似的生理现象，这也被其他表观遗传年龄标记物所捕获。

Noreen等人(2020)在对这些数据的原始分析中，观察到近端结肠样本的表观遗传年龄减速趋势(通过Hannum、Horvath和表型指标)[14］．我们观察到，在组内，近端结肠样本的长期用户分析与他们的发现一致，具有统计学意义和稳健的时钟IR减速模式。此外，当比较非阿司匹林使用者和长期阿司匹林使用者之间的T2 - T1有丝分裂时钟IR变化时，我们观察到长期阿司匹林使用者近端组织中有更多负中位IR差异。虽然没有统计学意义，但这与先前观察到的T2长期使用者的近端组织与T1长期使用者的近端组织相比有显著的IR减速是一致的。与我们的组内比较不同，组间“差异”比较不是成对的。因此，由于我们的样本量和缺乏统计力，我们的组间分析很可能不符合统计显著性。我们假设，对阿司匹林使用组内差异的分析能够解释人与人之间的可变性，从而产生可靠的估计。

此外，考虑到有丝分裂时钟与实际年龄有强烈的正相关，我们对每个阿司匹林使用组在T1和T2之间不考虑实际年龄的有丝分裂时钟残差增加并不感到惊讶。除了两个阿司匹林使用组的年龄基线差异(长期使用者的实际年龄中位数比非使用者高10岁)之外，这些观察结果为关注IR结果(将实际年龄考虑在内)的解释提供了额外的动力。

事实上，我们观察到所有三个有丝分裂时钟的显著IR减速表明有丝分裂时钟对长期阿司匹林关系具有良好的敏感性。然而，在回顾文献时，尚不清楚有丝分裂时钟对CRC癌症过程的敏感性是否大于其他表观遗传时钟。表观遗传老化标记的稳健性和敏感性的差异可能是由于用于创建它们的数据量。例如，Horvath指标使用了大约8000个样本，表型指标使用了近10,000个样本[10，13］．相比之下，EpiTOC的开发使用了超过650个样本[16］．MiAge和EpiTOC2分别使用了大约4000和3000个样品[17，18］．此外，我们在一项独立分析中观察到这种模式对生物衰老过程的差异敏感性。在之前一项模拟长时间太空旅行的研究中，我们观察到表型和EpiTOC2都有所下降，但只有表型减速在520天模拟太空旅行任务结束时仍然具有统计学意义[21］．在另一项对334名健康左结肠样本的研究中，研究人员根据腺瘤或结直肠癌的个人病史将其分为低、中、高风险组，研究人员观察到，与低风险组相比，高风险组的表型显著下降;与此同时，Horvath、Hannum和EpiTOC指标之间的关系也有相似的趋势，但不具有统计学意义[22］．尽管这些发现与大多数CRC表观遗传衰老文献的范式相违背，即更高的癌症风险与年龄加速有关，但它为建议提供了额外的动力，以帮助标准化未来的研究，努力就哪些表观遗传衰老标记物最适合研究CRC关系达成共识。共识指南也有助于促进元分析，这可以进一步帮助阐明crc相关生物学与表观遗传时钟的真实关系和敏感性。

虽然这一领域的数据仍处于初级阶段，但我们将达到这一领域必须为生物衰老黄金标准建立共识的地步[9］．即使一个通用的生物衰老金标准是不可可行的，特定领域或健康结果的金标准(即CRC)可能更合理。因此，在特定领域内的所有研究都将包括某些标准标记，即使更多的新标记是研究的主要焦点。在前进的道路上,我们建议所有CRC的表观遗传衰老研究都包括传统的表观遗传衰老标记物(至少是Hannum、Horvath和PhenoAge)以及有丝分裂时钟(至少是MiAge、EpiTOC和EpiTOC2测量)，以帮助该领域在现有数据上达成共识。同样，观察到表观遗传衰老可能基于结肠位置的差异，这可能与胚胎起源的差异有关，但尚未完全理解[14，23］．肿瘤发生的途径在左半结肠和右半结肠之间也有所不同。DNA错配修复途径突变在右结肠肿瘤中更为普遍，而染色体不稳定性途径相关突变在左结肠肿瘤中更为普遍[23］．这些分子特征的明显差异可能与CRC的表观遗传衰老有重要关系。此外，可能与胚胎起源和分子特征的差异有关，有文献表明，一些化学预防干预措施，如阿司匹林，在近端结肠比远端结肠更有效[24］．最终，还需要进一步的研究来充分理解表观遗传衰老背景下的所有这些关系。因此,我们还建议表观遗传老化研究在可能的情况下继续提供结肠特定位置的结果。最后，结肠癌的种族差异是有据可查的，与同龄人相比，非裔美国人的CRC发病率和死亡率更高[25］．最近的一项研究报告了非裔美国人右冒号的年龄加速(霍瓦特度量)，而欧洲裔美国人右冒号的年龄减速。作者表示，“我们的结果为表观遗传衰老提供了新的见解，这可能是CRC中潜在的种族差异[26］．”我们建议未来关于crc表观遗传衰老的研究——以及其他方面——继续注意表明差异仅仅是由祖先造成的．Devall等人(2020)对种族进行了差异甲基化位置(DMP)分析，发现18.4%的DMP与祖先标记重叠;然而，没有提到生活方式和社会因素是他们观察到的结果的潜在驱动因素。我们鼓励研究人员概述和区分种族主义的作用，而不是祖先在这些生物标志物。考虑到表观遗传衰老与包括饮食在内的社会因素之间的关联，这一点尤为重要。13，27]、种族歧视[28]，邻里剥夺[29]，以及暴力[30.］．

这项研究有一些重要的局限性，包括样本量小，考虑到队列仅由波兰女性组成，其概括性有限。同样重要的是，该研究的观察性设计没有对随访期间服用阿司匹林的剂量和有限的协变量进行规范(我们只能调整实际年龄、BMI、息肉状态和甲基化批次)。因此，我们不能直接说阿司匹林的因果关系。即使在我们计算结肠组织指标的特定情况下，阿司匹林使用与有丝分裂时钟和其他表观遗传衰老指标的关联可能是相关的，并由其他机制(如免疫系统相互作用)驱动。未来需要在更大、更多样化的人群中进行调查，以及实验研究，以更广泛地证实我们的发现。我们相信，我们提出的建议对提高这些未来研究的质量也很重要。

表观遗传老化措施，包括有丝分裂时钟，显示出检测CRC关系的敏感性。我们特别观察到长期服用阿司匹林的近端结肠粘膜有丝分裂时钟IR减慢。未来的研究(1)包括传统的表观遗传年龄和有丝分裂时钟测量，(2)提供结肠特定位置的结果，(3)探索种族表观遗传衰老差异的遗传和社会驱动因素，这对于更好地描述CRC的表观遗传衰老关系至关重要。

本研究中使用的数据集(GSE142257系列)可在以下网站公开获取:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo．

儿童权利公约:

结肠直肠癌

USPSTF:

美国预防服务工作组

EpiTOC2:

Cancer-2的表观遗传时间

EpiTOC:

癌症的表观遗传时间

MiAge:

有丝分裂的年龄

计算1 /基准:

T1

时间点2/10年随访:

T2

作者感谢并感谢Faiza Noreen, Anna Chaber-Ciopinska, Jaroslaw Regula, Primo Schär和Kaspar Truninger公开了他们的数据集。

JNE和AC由美国国立卫生研究院拨款R03AG067064和R01ES031259支持。

作者及隶属关系

1. 美国佐治亚州亚特兰大市埃默里罗林斯公共卫生学院Gangarosa环境卫生系和埃默里大学医学院急诊医学系

   jamji C. Nwanaji-Enwerem

2. 加州大学伯克利分校公共卫生学院环境健康科学部和计算生物学中心，加州大学伯克利分校，加州，美国

   jamji C. Nwanaji-Enwerem和Andres Cardenas

3. 德克萨斯大学MD安德森癌症中心，美国德克萨斯州休斯顿

   Chijioke Nze

贡献

JCN构思并设计了该研究。JCN进行了数据分析。JCN和AC起草了手稿。所有作者都参与了分析，并对手稿进行了修改和批准。

相应的作者

对应到jamji C. Nwanaji-Enwerem．

伦理批准并同意参与

这项研究是对公开数据的分析。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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