天然产物的提取和分离技术:综合综述

几千年来，天然药物是预防和治疗人类疾病的唯一选择。天然产物是药物开发的重要来源。天然药物中生物活性天然产物的含量总是相当低。目前，开发有效和选择性的方法提取和分离这些生物活性天然产物是非常重要的。本文旨在全面介绍天然产物提取和分离中使用的各种方法。本文还介绍了传统技术和现代技术在天然产物研究中的优点、缺点和实例。

中药、阿育吠陀等天然药物，是在人类几千年的日常生活和对抗疾病的过程中形成和发展起来的，对人类文明进步产生了积极影响。今天，天然药物不仅满足了发展中国家大多数人口的初级保健需要，而且由于保健费用飙升和普遍财政紧缩，在发达国家也引起了越来越多的注意。在美国，大约49%的人口尝试过天然药物来预防和治疗疾病[1］．已知具有药用价值的化学物质被认为是天然药物的“活性成分”或“活性成分”。天然产物为新药开发提供了主要来源。从20世纪40年代到2014年底，FDA批准的用于治疗人类疾病的化学药物中，有近一半源自天然产物或受其启发[2，3.］．天然产物在官能团、手性和结构复杂性方面为组合化学中的分子提供了更多类似药物的特征[4，5］．

天然药物中有效成分的含量总是相当低。天然产物的提取和分离过程耗时且实验室密集，一直是天然产物在药物开发中应用的瓶颈。迫切需要开发有效和选择性的提取和分离生物活性天然产物的方法。本综述旨在提供一个全面的观点，各种方法用于提取和分离天然产物。

萃取是将所需天然产物从原料中分离出来的第一步。根据提取原理，提取方法包括溶剂萃取法、蒸馏法、压制法和升华法。溶剂萃取是应用最广泛的方法。天然产物的提取经过以下几个阶段:(1)溶剂渗透到固体基质中;(2)溶质在溶剂中溶解;(3)溶质扩散出固体基体;(4)收集提取的溶质。在上述步骤中，任何提高扩散系数和溶解度的因素都会促进萃取。萃取溶剂的性质、原料的粒度、溶剂固比、萃取温度和萃取时间都会影响萃取效率[6，7，8，9，10］．

溶剂的选择是溶剂萃取的关键。溶剂的选择应考虑选择性、溶解度、成本和安全性。基于相似和互混相定律(相似溶解相似)，极性值接近溶质极性的溶剂可能表现更好，反之亦然。醇类(乙醇和甲醇)是植物化学研究中常用的溶剂萃取溶剂。

一般情况下，粒度越细，萃取效果越好。粒度越小，溶剂的渗透和溶质的扩散能力越强，萃取效率越高。但颗粒尺寸过细会使溶质在固体中吸收过多，不利于后续过滤。

高温增加了溶解度和扩散。然而，过高的温度可能会导致溶剂的损失，导致不需要的杂质的提取和可热性成分的分解。

在一定时间范围内，萃取效率随着萃取时间的增加而增加。在固体材料内外溶质达到平衡后，增加时间不会影响萃取。

溶剂固比越大，萃取得率越高;但是，过高的溶剂固比会导致萃取溶剂过多，需要较长的浓缩时间。

传统的提取方法包括浸渍、渗透和回流提取，通常使用有机溶剂，溶剂用量大，提取时间长。超临界流体萃取(SFC)、加压液体萃取(PLE)、微波辅助萃取(MAE)等现代或更环保的萃取方法也已应用于天然产物的萃取，它们具有有机溶剂消耗低、萃取时间短、选择性高等优点。然而，目前植物化学研究中很少使用升华法、蒸馏法和蒸馏法等提取方法，本文不作详细讨论。表中列出了用于天然产品的各种提取方法的简要摘要1．

浸渍

这是一种非常简单的提取方法，缺点是提取时间长，提取效率低。该方法可用于可热性组分的提取。

Ćujić等在50%乙醇、固液比为1:20、粒度为0.75 mm的优化条件下从苦莓中提取总酚和总花青素，表明浸渍法是一种简单有效的苦莓酚类化合物提取方法[11］．儿茶素的提取工艺研究(1,无花果。1)杨梅unedo利用浸渍、微波辅助和超声提取技术对L.果实进行研究，结果表明微波辅助提取(MAE)效果最好，但浸渍温度较低，提取率几乎相同，可转化为经济效益[12］．jovanovic等人评价了多酚的提取效率Serpylli草采用各种提取技术(浸渍，热辅助提取和超声辅助提取)。从总多酚含量来看，超声辅助提取总黄酮得率最高，浸提与热辅助提取差异无统计学意义[13］．Cajanus毛竹茶叶在中国民间医学中用于治疗肝炎、水痘和糖尿病。类黄酮是一种具有生物活性的化合物。Jin等比较了东方皂苷的提取率(2)、木犀草素(3.)和总黄酮c .毛竹对叶片进行微波辅助提取、回流提取、超声辅助提取和浸渍提取。浸渍法提取液中东方草苷、木犀草素和总黄酮的提取效率最低[14］．

渗滤

渗透比浸渍更有效，因为它是一个连续的过程，在这个过程中饱和的溶剂不断地被新的溶剂所取代。

Zhang等比较了渗透萃取法和回流萃取法对提取物的影响Undaria pinnatifida．他们发现其中的主要成分岩藻黄质(4,无花果。2)，渗提法的提取率高于回流法，但两种方法的提取率差异不显著[15］．狗皮贴片是由29种中药组成的复方中药制剂。Fu等以酸碱滴定法测定的全生物碱含量为指标，优化乙醇渗滤方法为55%乙醇浸泡24 h，再用12倍55%乙醇渗滤[16］．采用青藤碱提取率(5)及盐酸麻黄碱(6)为指标，提出了另一种优化的渗滤方法:用70%乙醇浸泡24h后，再用20倍70%乙醇渗滤。青藤碱和盐酸麻黄碱的转移率分别为78.23和76.92% [17］．

煎煮

汤剂提取液中含有大量水溶性杂质。汤剂不能用于提取可热性或挥发性成分。

人参皂苷(7- - - - - -31)在煎煮过程中会发生水解、脱水、脱羧和加成反应(图;3.) [18］．张等人研究了一种著名中药制剂当归补血汤的化学转化，当归补血汤是一种含有黄芪和当归的中药汤剂。他们发现了两种黄酮苷，毛蕊异黄酮-7-O-β-d葡萄糖苷(32,无花果。4)和ononin (33)，在黄芪中可水解形成毛蕊异黄酮(34)和芒柄花素(35)，煎煮时，分别为。水解效率受pH值、温度和草药用量的影响较大[19］．三黄泻心汤和附子泻心汤这两种中药复方在中国已经被用于治疗糖尿病等疾病数千年了。仙仙汤由大黄、黄芩和黄连组成，而福仙汤则是在仙仙汤中加入另一种中药附子制成。Zhang等采用超高效液相色谱-电喷雾质谱法(UPLC-ESI/MS)监测了川芎和川芎煎液和浸渍液中的17种有效成分。与浸渍工艺相比，煎煮工艺可促进部分活性物质的溶出。其中11种成分[苯甲酰aconine (36)、苯甲酰hypaconine (37)、苯甲酰美沙康碱(38)、小檗碱(39)、coptisine (40)、巴马汀(41)、喷罗根碱(42)、芦荟大黄素(43)及大黄素(44)、黄芩苷(45)、羊草皂甙(46)]，显著高于川芎汤剂和川芎汤剂浸渍液。中草药中的β-葡萄糖苷酸酶可以催化糖苷(黄芩苷和黄芩苷)中的葡萄糖醛酸基团水解转化为苷元[黄芩苷(47)和wogonin (48)]。煎煮过程中的高温使其活性失效β-葡糖醛酸酶抑制了糖苷向苷元的转化，从而发现煎煮液中黄芩苷和沃金苷含量较高，浸渍液中黄芩苷和沃金苷含量较高。还观察了不同药材化学成分之间的相互作用。煎剂和浸渍液中均未检出二酯二萜类生物碱，而次乌头碱(49)在单味附子煎液中发现。FXT中其他三种药材的成分可能促进附子中二酯二萜生物碱向其他毒性较低的单酯二萜生物碱的转化，这可能解释了中药配方减毒增效的机制[20.］．

回流提取

回流萃取比渗透或浸渍更有效，所需时间和溶剂更少。它不能用于可热性天然产物的提取。

用70%乙醇回流可获得最高产量的天然生物杀虫剂二脱氢stemofoline (50,无花果。5)(提取物的0.515% w/w)，从百部collinsiae不同提取方法(超声法、回流法、索氏法、浸渍法和渗滤法)所制备的提取物中的根[21］．张比较了有效成分(黄芩苷(45,无花果。4)及葛根素(51)由中药复方七药组成，采用煎煮和回流两种不同的方法。回流法提取黄芩苷和葛根素的效果较好，以60%乙醇为提取溶剂回流法提取黄芩苷和葛根素的得率最高[22］．

索氏提取

索氏提取法综合了回流提取和渗透的优点，利用回流虹吸原理，用新鲜溶剂连续提取药材。索氏提取法是一种自动连续提取方法，提取效率高，比浸渍或渗透法所需时间和溶剂消耗少。索氏萃取的温度高、萃取时间长，会增加热降解的可能性。

Wei等得到熊果酸(52,无花果。6)，经索氏提取，其产率为38.21 mg/g [23］．由于索氏提取温度过高，茶中的儿茶素也会发生降解。与40°C下浸渍法相比，70°C下索氏提取法中总多酚和总生物碱的浓度均有所下降[24，27］．

加压液体萃取(PLE)

加压液体萃取(PLE)也被不同的研究小组描述为加速溶剂萃取、增强溶剂萃取、加压流体萃取、加速流体萃取和高压溶剂萃取。PLE采用高压萃取。高压使溶剂保持在沸点以上的液态，使得脂质溶质在溶剂中的溶解度高，扩散速度快，溶剂在基质中的渗透率高。与其他方法相比，该方法显著降低了提取时间和溶剂的消耗，具有更好的重复性。

澳门大学和其他研究机构的研究人员已成功应用加压液体萃取技术从中药中提取多种天然产物，包括皂苷、黄酮类化合物和精油[8，25，26，27］．一些研究人员认为，由于PLE的提取温度较高，不能用于提取可热性化合物，而另一些研究人员认为，由于PLE的提取时间较短，可以用于提取可热性化合物。当PLE在200°C下从葡萄渣中提取抗氧化剂时发生美拉德反应[28］．花青素是可热的。Gizir等成功利用PLE从黑胡萝卜中获得了富含花青素的提取物，因为花青素的降解速率随时间变化，且高温-短时间PLE提取条件可以克服高温提取的缺点[29］．

超临界流体萃取

超临界流体萃取(SFE)采用超临界流体作为萃取溶剂。SF具有与液体相似的溶解性和与气体相似的扩散性，并且可以溶解各种各样的天然产物。由于压力和温度的微小变化，它们的溶剂化性能在临界点附近发生了巨大变化。超临界二氧化碳(S-CO₂)因其具有临界温度低(31℃)、选择性、惰性、成本低、无毒、能提取热不稳定化合物等优点，在SFE中得到了广泛的应用。S-CO的低极性₂使其成为提取非极性天然产物如脂类和挥发油的理想选择。可以在S-CO中加入修饰剂₂显著提高其溶剂化性能。

Conde-Hernández提取迷迭香精油(迷迭香属officinalis) S-CO₂萃取、水力蒸馏和蒸汽蒸馏。他发现SFC提取物的挥发油得率和抗氧化活性均高于其他两种方法[30.］．S-CO₂在300 bar和40℃条件下，用2%乙醇改性后，长春碱的提取选择性较高(53,无花果。7)(一种抗肿瘤药)从Catharanthus roseus也叫，与传统提取方法相比，该方法提取长春碱的效率提高92% [31］．

超声辅助萃取(UAE)

超声辅助萃取(UAE)，又称超声萃取或超声化，是利用超声波能量进行萃取。超声波在溶剂中产生空化，加速了溶质的溶解扩散和传热，提高了萃取效率。其优点还包括低溶剂和低能耗，降低萃取温度和时间。UAE适用于可热性和不稳定化合物的提取。UAE通常用于多种天然产物的提取[32，33］．

jovanovic等人从多酚中获得了较高的收率胸腺serpyllumL.在优化条件下(50%乙醇为溶剂;1:30 solid-to-solventratio;0.3 mm粒径和15 min时间)比浸渍和热辅助提取方法[13］．Wu等发现人参皂苷的提取无统计学差异，包括人参皂苷Rg1 (54,无花果。8)和Rb1 (7,无花果。3.)、七苦皂苷V (55)， iv (56)及IVa(57)，以及假人参皂苷RT1 (58)，从中药人参中提取，用70%甲醇水萃取30 min [34］．Guo等发现回流法和UAE法均具有省时、操作方便、提取得率高的优点，且UAE法相对于回流法提取二黄根的热呋卡因得率和含量(59)作为索引[35］．

微波辅助萃取(MAE)

微波通过离子传导和偶极旋转机制与水等极性化合物和植物基质中的一些有机成分相互作用产生热量。MAE过程中热量和质量的传递方向一致，产生协同效应，加快萃取速度，提高萃取收率。MAE的应用具有提高提取率、减少植物材料的热降解和选择性加热等优点。MAE也被重新评级为绿色技术，因为它减少了有机溶剂的使用。MAE有两种方法:无溶剂萃取(通常用于挥发性化合物)和溶剂萃取(通常用于非挥发性化合物)[36，37］．

Chen优化了MAE提取白藜芦醇的条件(60,无花果。9)从中药虎尾蓼(Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix)中提取蓼属植物cuspidatum)正交试验。在提取时间7 min、乙醇80%、液固比25:1 (ml:g)、微波功率1.5 kw的优化条件下，白藜芦醇的提取率可达1.76% [38］．Benmoussa等人采用增强型无溶剂MAE法提取香精油可轧机。种子在大气压下，不添加任何溶剂或水。增强的无溶剂MAE提取物的产率和芳香族特征与水力精馏提取的相似，所需时间仅为水力精馏的六分之一[39］．Xiong等人开发了一种MAE提取五种主要生物活性生物碱，包括莲子碱(61)、莲叶碱(62)、异莲子碱(63)、达乌里辛(64)，及莲心素(65)，取自中医荷花Plumula(荷花plumule，绿色的胚莲属椰子种子)采用单变量方法实验和中心复合设计。微波微波萃取工艺的优化条件为:甲醇含量65%，微波功率200 W，提取时间260 s [40，44］．

脉冲电场(PEF)萃取

脉冲电场能破坏膜结构，增加萃取过程中的传质量，从而显著提高萃取收率，缩短萃取时间。PEF处理的效果取决于几个参数，包括场强、比能量输入、脉冲数和处理温度。PEF提取是一种非热方法，最大限度地减少了可热性化合物的降解。

Hou等人在电场强度为20 kV/cm、频率为6000 Hz、乙醇-水溶液为70%、速度为150 l/h条件下，采用PEF法获得了最高的人参皂苷得率(12.69 mg/g)。PEF法人参皂苷得率高于MAE法、热回流法、UAE法和PLE法。整个PEF提取过程耗时不到1秒，远远少于其他测试方法[41］．在一项从挪威云杉树皮中提取抗氧化剂的研究中，Bouras发现PEF处理后的酚含量(8倍)和抗氧化活性(30倍)比未处理的样品要高得多[42］．

酶助萃取(EAE)

细胞膜和细胞壁的结构，多糖和蛋白质等大分子形成的胶束，以及提取过程中蛋白质在高温下的凝固和变性是天然产物提取的主要障碍。由于酶对细胞壁和细胞膜组分以及细胞内大分子的水解作用，促进了天然产物的释放，因此EAE可提高提取效率。纤维素酶、α-淀粉酶和果胶酶通常用于EAE。

多糖是中药黄芪中的生物活性成分之一。Chen等研究了黄芪根茎多糖的EAE黄芪通过对多种酶的测试，发现葡萄糖氧化酶在提取多糖方面的性能优于其他7种酶(淀粉酶、半纤维素酶、细菌淀粉酶、真菌淀粉酶、果胶酶、纤维素酶和醋酶)。在优化后的葡萄糖氧化酶EAE条件下，多糖产量较非酶处理方法提高了250%以上[43］．绿原酸的提取率(66,无花果。10)杜仲使用纤维素酶和离子液体对叶片有很大改善[44］．Strati等人发现类胡萝卜素和番茄红素(67)通过使用果胶酶和纤维素酶，提高了番茄废料的提取率。与非酶处理的溶剂萃取方法相比，纤维素酶和果胶酶处理的样品分别获得了6倍和10倍的两种目标化合物的收率[45］．

水力蒸馏和蒸汽蒸馏

水力蒸馏(HD)和蒸汽蒸馏(SD)是常用的挥发油提取方法。一些天然化合物在HD和SD中会发生分解。

研究了龙舌兰精油和龙舌兰精油的化学成分及抑菌活性各种citrata均受到蒸馏方法的显著影响。HD处理的一次挥发油和二次挥发油产量均高于SD处理[46，50］．叶海亚和尤努斯发现，提取时间确实会影响广藿香精油的提取质量。随着提取时间的增加，部分成分含量减少或增加[47］．

上述方法提取液中的成分比较复杂，含有多种天然产物，需要进一步分离纯化才能得到活性部分或纯天然产物。分离取决于单个天然产物的物理或化学差异。色谱法，尤其是柱色谱法，是从复杂混合物中获得纯天然产物的主要方法。

基于吸附特性的分离

吸附柱层析法由于吸附剂(如硅胶、大孔树脂)简单、容量大、成本低，被广泛应用于天然产物的分离，特别是在分离初期。这种分离是基于天然产物对吸附剂表面吸附亲和力的差异。吸附剂(固定相)和流动相的选择对于实现天然产物的良好分离，最大限度地回收目标化合物，避免目标化合物在吸附剂上的不可逆吸附至关重要。

硅胶是植物化学研究中应用最广泛的吸附剂。据估计，近90%的植物化学分离(制备规模)是基于硅胶。硅胶是一种含有硅醇基团的极性吸附剂。分子通过氢键和偶极子-偶极子相互作用被硅胶保留。因此，极性天然产物比非极性天然产物在硅胶柱中保留的时间更长。有时，某些极性天然产物可能发生不可逆的化学吸附。使用前加水使硅胶失活或使用含水的流动相会减弱吸附。在硅胶上分离生物碱时，会出现严重的尾砂现象，加入少量氨或三乙胺等有机胺可减少尾砂。12种生物碱属于糠醛酸甲酯组，包括6种新生物碱，prunifolines A-F (68- - - - - -73,无花果。11)，均从叶中提取Kopsia arborea采用MeOH-CHCl梯度初始硅胶柱层析_3.以氨饱和Et为流动相进行离心薄层色谱₂o -己烷或EtOAc/己烷体系作为洗脱液[48］．

氧化铝(氧化铝)是一种强极性吸附剂，用于天然产物的分离，特别是生物碱的分离。Al的强正场^{3 +}而氧化铝中影响易极化化合物的碱基导致了氧化铝吸附与硅胶吸附不同。由于氧化铝在分离过程中可催化脱水、分解或异构化，近年来在天然产物分离中的应用已明显减少。Zhang和Su报道了一种利用碱性氧化铝分离紫杉醇的色谱方法(74,无花果。11的提取物水松尖的愈伤组织培养发现紫杉醇的回收率超过160%。他们发现紫杉醇的增加来自于7-的异构化epi紫杉醇(75)由氧化铝催化。研究亦发现少量紫杉醇可分解为巴卡肽III (76)和10-去乙酰bacaccatin III (77)在氧化铝柱内[49］．进一步研究了紫杉醇在酸性、中性和碱性氧化铝上的分离，结果表明，Lewis源和氧化铝表面的碱性活性核诱导了7-的异构化epi-taxol to taxol [50］．

色谱中使用的聚酰胺结构同时含有丙烯基和酰胺基。疏水和/或氢键相互作用将发生在聚酰胺柱色谱中，这取决于流动相的组成。以水性溶剂等极性溶剂为流动相时，聚酰胺作为非极性固定相，其色谱行为与反相色谱相似。相反，聚酰胺作为极性固定相，色谱行为类似于正常的相色谱。聚酰胺柱色谱是分离蒽醌类、酚酸类和类黄酮类等天然多酚类化合物的常用工具，其机理主要是聚酰胺吸收剂、流动相和目标化合物之间形成氢键。Gao等人在聚酰胺柱上研究了包括酚酸和黄酮类化合物在内的多酚类化合物的色谱行为。研究发现聚酰胺具有氢键受体的功能，酚羟基的数量及其在分子中的位置影响着吸附强度[51］．除多酚类化合物外，还报道了用聚酰胺柱层析法分离其他天然产物。用聚酰胺柱层析法富集苦青茶总皂苷，可显著降低SHR大鼠的收缩压[52］．以二氯甲烷和甲醇的梯度混合物为洗脱剂，测定黄连中的七种主要异喹啉类生物碱，包括小檗碱(39)、coptisine (40)、巴马汀(41)、喷罗根碱(42)、耧斗菜(78)、格伦兰(79)(图。4)和木兰碱(80,无花果。11)经一步聚酰胺柱层析分离[53］．

吸附性大孔树脂是具有大孔结构但不含离子交换基团的聚合物吸附剂，可以选择性地吸附几乎任何类型的天然产物。由于其吸附容量大、成本低、易再生、易于放大等优点，无论是作为独立体系，还是作为去除杂质或富集目标化合物的预处理工艺的一部分，都被广泛应用。吸附性大孔树脂的吸附机理包括静电作用力、氢键作用、络合物形成以及树脂与溶液中天然产物的筛分作用。表面积、孔径和极性是影响树脂性能的关键因素[54］．20 (年代)-原萘三醇皂苷(81)及20(年代)-原萘二醇皂苷(82,无花果。11)被认为是根中的两种主要生物活性成分田七．在30和80% (v/v)乙醇溶液下，从D101大孔树脂柱中分别成功分离出PTS和PDS。在Zorbax SB-C上比较大孔树脂柱色谱和高效液相色谱图谱，发现PDS和PTS的色谱行为接近反相色谱₁₈列(55］．最近，孟等利用D101大孔树脂制备了日本参总皂苷。四种主要皂苷的含量分别为:七叶皂苷V (55)， iv (56)及IVa(57)，以及假人参皂苷RT1 (58)(图。8)， PJRS均大于73%。该PJRS可作为三七质量控制的标准参考[56］．有研究者认为大孔树脂吸附多酚的主要机理与树脂乙醚键的氧原子与苯酚酚羟基的氢原子形成氢键有关。氢键相互作用力受溶液pH值的影响较大[57，58］．

硝酸银是天然产物分离中另一种有用的固体载体。这些含有π电子的天然产物与银离子可逆相互作用形成极性配合物。天然产物的双键或芳香度越多，络合形成越强。硝酸银通常浸渍在硅胶(SNIS)或氧化铝上进行分离。几个研究小组报告了脂肪酸在SNIS上的分离[59，60，61］．Wang等报道了用SNIS柱层析法从生姜油树脂中分离姜姜烯[62］．一对同分异构体，巴西酸(83,无花果。11)和异巴西酸(84)，从属brasiliense由Lemos等人在SNIS列[63，69］．一些课题组还在高速逆流色谱(HSCCC)的两相体系中加入硝酸银，以提高分离效果。Xanthochymol (85)及古替菲酮E (86)是一对π键的二苯甲酮异构体藤黄属植物xanthochymus由AgNO_3.-HSCCC。该AgNO中π键异构体的洗脱顺序_3.-HSCCC分离是内部π键(更早)<末端，这与SNIS柱层析观察到的结果相同[64］．

基于分配系数的分离

分区色谱(PC)是根据两种不同的不混溶液体的相对溶解度来进行液-液萃取的。前期将一个液相涂覆在固体基质(硅胶、碳、纤维素等)上作为固定相，另一个液相作为流动相。容易移除固定相位和不可重复结果的缺点导致这种PC在今天很少使用。结合相，其中液体固定相被化学结合到惰性支撑物上，被用作固定相，克服了这些缺点。市售的烷基如C8和C18、芳基、氰基和氨基取代硅烷常被用作键合相，广泛用于分离各种天然产物，特别是在最后的纯化步骤中。

三七皂苷R1 (87)(图。11)、人参皂苷Rg1 (55)(图。8)及Re (88)(图。11))和两种二聚乳酸菌多糖[人参皂苷Rb1 (7)及Rd (9)(图3.)在C18色谱柱中使用EtOH-H分离₂O体系为流动相[65］．Cai等合成了一种新型的基于聚丙烯酰胺的二氧化硅固定相，并成功地应用于低聚半乳糖和皂苷的分离巴黎重楼与EtOH-H₂O为流动相[66］．

逆流色谱(CCC)是一种利用重力或离心力使液体保持固定相的色谱。CCC因其固位性差、分离时间长、过程劳动强度大，在早期很少使用。然而，在20世纪80年代，包括HSCCC和离心隔断色谱(CPC)在内的现代CCC得到了显著改进。流体动力学CCC系统，如HSCCC，具有围绕两个旋转轴的行星旋转运动，没有旋转密封，这提供了一个低压降过程。流体静压色谱，例如离心隔断色谱，只使用一个旋转轴，并有一系列相互连接的室来捕捉固定相，这提供了更高的固定相保留率和比HSCCC更高的系统压力。CPC的高系统压力阻止了通过增加色谱柱的长度来提高分辨率。高性能CCC (HPCCC)代表了新一代流体动力CCC，其工作方式与HSCCC相同，但具有更高的g级。HPCCC仪器产生的能量超过240克，而早期HSCCC设备的g水平低于80克。与之前HSCCC的数小时相比，HPCCC将分离时间缩短至不到一小时，并且可以实现至少十倍于HSCCC仪器的吞吐量[67］．与使用固体固定相的传统柱分离方法相比，流体静力和流体动力CCC系统都具有一些优点，包括消除不可逆吸附和峰尾，高负载能力，高样品回收率，样品变性风险最小，溶剂消耗低。CCC的局限性在于它只能在一个相对狭窄的极性窗口内分离化合物。近20年来，HSCCC、HPCCC和CPC在分离科学中引起了广泛的关注，已广泛应用于天然产物的分离。Tang等人开发了一种HSCCC方法，采用两相溶剂体系，包括乙酸乙酯-n-丁醇-乙醇-水(4:2:1.5:8.5,v/v/v/v)分离六种黄酮C苷(89- - - - - -94,无花果。12)，包括两种新化合物淡竹叶［68］．HSCCC、HPCCC和CPC也已成功应用于常规柱层析难以分离的挥发油的分离。六种挥发性化合物(curdione (95)、姜黄酚(96)，杰玛龙(97)、curzerene (98)， 1,8-桉树脑(99),β-elemene (One hundred.))，经CPC分离得到姜黄wenyujin采用石油醚-乙腈-丙酮(4:3:1 v/v/v)的非水两相溶剂体系[69］．四种主要倍半萜类化合物(姜黄酮(101)，α-turmerone (102)，β-turmerone (103),E-atlantone (104))，结构相似姜黄在单个HSCCC运行中使用两相溶剂系统组成n-庚烷-乙酸乙酯-乙腈-水(9.5/0.5/9/1,v/v)，每种化合物的纯度均超过98% [70］．芳樟醇(105), terpinen-4 -ol（106)，α松油醇(107)，p茴香醛(108)、茴香(109)及小茴香(110)成功地从植物挥发油中分离出来Pimpinella anisum采用HPCCC逐步梯度洗脱[71］．Li等开发了一种CPC方法分离广藿香醇(111)非水醚-乙腈(1:1,v/v)溶剂体系。在240 ml色谱柱中，从12.5 g精油中分离出超过2 g纯度超过98%的广藿香醇[72］．大容积(几升)柱已被用于商业流体静压CCC和流体动力CCC设备，用于中试/工业规模的分离。由于商业机密，几乎无法获得报告。在工业应用中，很难判断是流体静力法更好还是流体动力法更好。用户可根据不同的用途选择不同类型的CCC仪器。当流动相与固定相粘度大、密度差小，使得固定相在流体动力CCC中滞留较差时，由于流体动力CCC中固定相的滞留对液体体系的物理性质不太敏感，会有较高的固定相滞留，因此流体静力CCC比流体动力CCC更实用。当流体动力CCC中固定相被很好地保留时，在相同的液体体系和相似的柱体积下，流体动力CCC比流体静力CCC的分离效率更高，因为流体静力CCC的混合程度有限，分配效率相对较低，而流体动力系统提供了高效的混合以产生较高的分配效率。

基于分子大小的分离

通过膜过滤(MF)或凝胶过滤色谱(GFC)分离天然产物是基于它们的分子大小。

膜过滤(MF)

在MF中，半透膜允许较小的分子通过并保留较大的分子。根据膜的孔径大小，天然产物的MF可分为微滤、超滤和纳滤。

膜过滤已经成为实验室中浓缩，澄清和去除杂质的强大工具，以及在食品和制药工业中。总酚(338%)、绿原酸(66)(图。10)(483%)、可可碱(112,无花果。13(323%)，咖啡因(113)(251%)，缩合单宁(278%)和皂苷(211%)冬青属植物paraguariensis在纳滤后显著增加[73，80］．当单个膜过滤步骤不能满足要求时，采用耦合膜过滤。采用微滤、超滤和纳滤的方法从橄榄叶提取物中分离活性成分。微滤+超滤去除大于5 kDa的杂质。纳滤可回收抗氧化和抗菌的多酚类化合物和黄酮类化合物，主要成分橄榄苦苷(114)，在纳滤保留液中浓缩约十倍[74］．

凝胶过滤色谱(GFC)

凝胶过滤色谱法又称凝胶渗透色谱法或尺寸排除色谱法。小分子在GFC中的滞留时间比大分子长。

葡聚糖交联形成葡聚糖，葡聚糖的g型葡聚糖被用于分离亲水化合物，如多肽[75]、寡糖及多糖[76］．

葡聚糖LH20是葡聚糖G25的羟丙基衍生物，具有疏水性和亲水性。Sephadex LH-20在分离过程中还存在吸附机制。葡聚糖LH-20可用于各种天然产物的分离，无论是在水或非水溶剂体系。以100%水为流动相，Sephadex LH-20分离多年生谷类中间小麦阿魏酸化阿拉伯木聚糖低聚糖[77］．三种新的嘧啶二萜，阿西他汀1-3 (115- - - - - -117,无花果。14)连同三种已知的甲酰胺(118- - - - - -120)是从抗癌活性CH中分离出来的₂Cl₂的一部分Agelas axifera在Sephadex LH-20柱与一系列溶剂系统[CH_3.哦,CH_3.OH-CH₂Cl₂hexane-CH (3:2)_3.oh - 2-丙醇(8:1:1)，己烷-甲苯- ch₂Cl₂-EtOH(17:1:1:1)和exane-EtOAc-CH_3.OH(4:5:1)]，然后使用Prep-HPLC进行纯化[78，85，87］．

聚丙烯酰胺(生物凝胶P) [79]和交联琼脂糖[80]也用于天然产物的分离。

基于离子强度的分离

离子交换色谱(IEC)根据分子的净表面电荷的差异来分离分子。一些天然产物，如具有能电离官能团的生物碱和有机酸，可以用IEC分离。离子交换树脂可以通过改变流动相的离子强度(如改变pH值或盐浓度)来捕获和释放带电分子。阳离子离子交换树脂用于生物碱的分离，阴离子离子交换树脂用于天然有机酸和酚类的分离。

从XAD-7处理的中性多酚类化合物中分离出带正电荷的花青素猕猴桃melanandra采用Dowex 50WX8阳离子离子交换树脂提取猕猴桃果实[81］．Feng和Zhao使用半制备色谱法分离(-)表没食子儿茶素没食子酸酯[121,无花果。15)]和(−)表儿茶素没食子酸酯(122)用弱酸性多糖凝胶CM-Sephadex C-25 [82］．一种新的生物碱伏马菌素B₆（123)，以及一种已知的生物碱伏马菌素B₂（124)，经Strata X-C混合模式rp -阳离子交换树脂IEC分离，反相色谱分离黑曲霉nrrl326培养物提取[83］．

其他现代分离技术

分子蒸馏(MD)

分子蒸馏是在远低于分子沸点的真空温度下进行的。它是一种适用于分离热敏性和高分子量化合物的蒸馏方法。Borgarello等人获得了百里香酚(125,无花果。16人工神经网络模拟牛至精油分子蒸馏富集馏分。所得馏分具有抗氧化性能，可稳定葵花籽油[84］．在最佳蒸发温度为50℃、蒸发器压力为5 kPa、进料流量为0.75 ml/min的条件下，分子蒸馏法可有效去除甜橙油中的3种邻苯二甲酸酯[85］．

制备气相色谱(Prep-GC)

气相色谱(GC)具有分离效率高、分离分析速度快等优点，有望成为分离挥发性化合物的理想制备方法。由于缺乏商用的Prep-GC，必须对GC设备的注入口、色谱柱、裂解装置和捕集装置进行改进，以进行制备分离[86］．

五种挥发性化合物，即curzerene (98)(6.6毫克)，β-elemene (One hundred.,无花果。12)(5.1毫克)、curzerenone (126)(41.6毫克)、姜黄烯醇(127)(46.2毫克)，以及姜黄素(128)(21.2毫克)17)，在10% OV-101 (3 m × 6 mm, i.d)填充的不锈钢柱上，经83次单次注射(20 μl)，从姜黄甲醇提取物中分离得到[87］．制备气相色谱法也应用于天然异构体的分离。总共178毫克独联体细辛醚(129)和82毫克反式细辛醚(130)，是从植物的精油中提取的菖蒲属tatarinowii在上述同一柱上单次注射(5 μl) 90次后[88］．制备气相色谱法已成为天然挥发性化合物的重要分离方法;然而，较大的样品负荷和大直径的制备柱降低了效率[89］．同时，制备-气相色谱缺乏商用设备、载气用量大、可热性化合物在高温下分解、馏分收集困难、产量低等缺点仍然制约着制备-气相色谱的应用。

超临界流体色谱(SFC)

SFC采用超临界流体作为流动相。超临界流体具有高溶解性、高扩散性、低粘度等特性，可实现快速高效的分离，因此，超临界流体综合了气相色谱和液相色谱的优点。因此，与HPLC相比，SFC可以使用更长的色谱柱和更小的固定相颗粒，从而提供更多数量的理论板和更好的分离。SFC可用于分离GC不适用的非挥发性或热不稳定化合物。SFC系统与各种不同的检测器兼容，包括LC和GC系统中使用的检测器。广泛使用的流动相极性为S-CO₂，在SFC中极性接近己烷，因此多年来SFC被用于脂肪酸、萜烯、精油等非极性天然产物的分离。甲醇和乙腈等洗脱改进剂增强了洗脱强度，这增加了用SFC分离极性天然产物的兴趣[90，91，92］．

赵等人成功分离了三对25R/年代非对映体螺旋体皂苷(131- - - - - -136,无花果。18)是从中药葫芦巴子(葫芦巴的种子生长foenum-graecum)安装在两个串联的CHIRALPAK IC柱上[93］．Yang等人利用SFC技术制备分离了两对7-表异构spiro oxindole生物碱(137- - - - - -140)从茎具钩钩藤macrophylla在Viridis Prep Silica 2-EP OBD色谱柱上，使用含0.2% DEA修饰S-CO的乙腈₂．SFC中使用的非水流动相阻止了分离的spiro oxindole生物碱的互变异构[94］．SFC也应用于天然对映体的分离。（R，年代) -goitrin (141- - - - - -142)是中药材板蓝根的有效成分。的手性分离R)及(年代)以乙腈为有机改性剂，在Chiralpak IC色谱柱上制备sfc，成功制备甲状腺肿素[95］．

分子印迹技术

分子印迹技术具有选择性高、成本低、制备简单等特点，是近十年来备受关注的分离方法。当模板分子从分子印迹聚合物(MIP)中去除时，会产生许多具有模板分子大小、形状和官能团记忆的互补腔。因此，模板分子及其类似物对MIP具有特异性识别和选择性吸附。MIPs已广泛应用于天然产物的分离，或作为固相萃取吸附剂用于中草药样品的制备以富集微量化合物。

Ji等人以dl -酪氨酸和苯丙酮酸为模板分子制备了多模板分子印迹聚合物，分离鼠二胺碱(143,无花果。19)从水提取物田七．猫鼠碱和dl -酪氨酸模板分子(144)含有氨基(NH₂)基和羧酸(COOH)基，以及另一个模板分子苯丙酮酸(145)，含有一个α-酮酸(COCOOH)基团，该基团也可在水仙碱的结构中找到[96］．Ma等开发了一种分离茄尼醇的制备分离方法(146)，采用基于MIP的闪相色谱法进行分析。以甲基丙烯酸甲酯为单体，茄尼醇为模板分子，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用悬浮聚合法制备了MIP。从烟叶提取物中分离出茄尼醇370.8 mg，纯度为98.4%，得率为烟叶干重的2.5% [97］．You等使用热响应磁性MIP分离了三种主要的姜黄素，姜黄素(147)、去甲氧基姜黄素(148)和双去甲氧基姜黄素(149)，取自中药姜黄(Curcumae Longae Rhizoma)姜黄)．所设计的热响应磁性MIP对姜黄素的印迹因子在2.4 ~ 3.1之间，热响应性较低(33.71℃为临界溶液温度)，磁分离速度快(5 s) [98］．

模拟移动床色谱法

模拟移动床色谱(SMB)采用多柱固定相(床)。通过旋转阀模拟床的逆流运动，旋转阀周期性地切换进气口(进料和洗脱液)和出气口(萃取和萃余液)。SMB工艺是一种连续分离方法，是大规模分离天然产物的有力工具，具有在较短时间内降低溶剂消耗的优点。

两种环肽，环肽C和E (150 - 151,无花果。20.)，以无水乙醇为脱吸附剂，采用三区SMBC和8个制备HPLC正相球形硅胶柱从亚麻籽油中获得[99］．Kang等人开发了串联SMB工艺，由两个四区SMB单元组成，在环I和环II中具有相同的吸附剂颗粒大小，以分离紫杉醇(紫杉醇)。74)(图。11)、13-去羟基bacaccatin III (152)和10-去乙酰紫杉醇(153)．在第一个SMB单元中回收紫杉醇，而在第二个SMB单元中分离13-去羟基bacaccatin III和10-去乙酰紫杉醇[One hundred.］．Mun通过在环I和环II中使用不同粒径的吸附剂增强了这种SMB色谱方法[101］．超临界流体也可用作SMB色谱的解吸剂。Liang等成功利用超临界二氧化碳和乙醇作为三区SMB的解吸剂分离白藜芦醇(60)(图。9)及大黄素(44)(图。4)从中药虎杖的粗提物中提取而成[102］．

多维色谱分离

被分离的提取物中成分比较复杂，一般在一层色谱中不会分离出纯化合物。基于固相萃取和不同固定相的多柱耦合的多维分离，大大提高了分离效率。随着越来越多的商用多维分离设备进入市场，天然产物的分离正变得越来越快速、高效和自动化。

通常，目标化合物通过一维分离富集，通过末维分离纯化。采用同一类型的分离设备(LC或GC)或不同类型的设备(GC和LC)可实现多维分离。一种新型挥发性化合物，(2E，6E() 2-methyl-6) - 4-methylcyclohex-3-enylidene hept-2-enal (154)，由黄皮精油经三维预gc纯化而成[103］．五种抗氧化化合物，包括两种生物碱[葡萄糖二氢胺AK (155)及葡萄糖二胺B (156)]和三种黄酮类化合物[tricin (157)、同碘二醇(158)(图。21)和木犀草素(3.)(图。1)]，采用二维高效液相色谱法(RP/HILIC)分离Arenaria电子密度在RP-C18HCE和NP-XAmide制备柱上[104］．Sciarrone等利用三维Prep-GC分离广藿香精油中的倍半萜。广藿香醇(111,无花果。12) (496 μg)在聚(5%二苯基/95%二甲基硅氧烷)柱上一维分离，295 μgα-bulnesene (159)来自第二色谱柱，该色谱柱涂有高分子量聚乙二醇和160 μgα-guaiene (160)在离子液体色谱柱上(SLB-IL60) [105］．Pantò等采用两种三维方法(GC-GC-GC和LC-GC-GC)分离倍半萜醇[(Z）-α檀香醇(161), (Z）-α-反式bergamotol (162), (Z）-β檀香醇(163)，epi-（Z）-β檀香醇(164)，α没药醇(165), (Z) -lanceol (166)，及(Z) -nuciferol (167)]取自檀香精油。他们发现，使用LC的第一维分离降低了样品的复杂性，提高了低浓度组分的生产率[106］．

在过去的几十年里，天然产物对药物开发做出了贡献，并将继续这样做。然而，提取和分离过程的实验室密集和耗时阻碍了天然产物在药物开发中的应用。随着技术的不断发展，越来越多新的自动快速提取分离天然产物的技术被创造出来，这可能会达到高通量筛选的要求。

关于萃取，回流萃取是制备分离中最常用的技术。近年来，UAE、MAE、SFE和PLE等现代提取方法也因其高提取率、选择性、目标提取物的稳定性和工艺安全等优点而受到越来越多的关注，也被视为绿色提取方法。其中一些绿色方法已经成为分析目的的常规样品制备方法。

在隔离方面，新型填料的开发可以提高隔离效率，值得进一步研究。色谱和光谱或光谱技术的结合，目的是阐明结构而不需要隔离，如LC-NMR和LC-MS，是一种有用的重复工具，用于寻找新的天然产物。尽管从复杂混合物中分离纯天然产物仍然具有挑战性，而且我们离一步分离程序还很远，但从提取到分馏和纯化的更有选择性的方法的应用将加快从收集生物材料到分离最终纯化化合物的时间。

总之，人们对天然产物的提取和分离及其有利应用的兴趣明显增加。这些具体的应用也使所采用的提取方法和新的固定相和流动相被这些技术所使用。因此，预计这些趋势将在不久的将来保持下去，因为它们主要是由新兴的消费者需求以及安全、环境和监管问题所推动的。

CCC:

逆流色谱法

中国共产党:

离心划分色谱法

FXT:

附子协信堂

GC:

气相色谱法

GFC:

凝胶过滤色谱

高清:

水电蒸馏

HPCCC:

高效逆流色谱法

高效液相色谱法:

高效液相色谱法

HSCCC:

高速逆流色谱法

IEC:

离子交换色谱法

LC:

液相色谱法

梅:

微波辅助萃取

MD:

分子蒸馏

MF:

膜过滤

MIP:

分子印迹聚合物

PC:

分配色谱法

PDS:

20 (S)原人参二醇皂苷

PEF:

脉冲电场

比如:

加压液体萃取

PJRS:

参总皂苷

Prep-GC:

制备气相色谱法

分:

20 (S) -protopanaxatriol皂苷

S-CO2:

超临界二氧化碳

SD:

蒸汽蒸馏

科幻小说:

超临界流体

证监会:

超临界流体色谱法

技术:

超临界流体萃取

SMB:

模拟移动床

sni:

浸渍在硅胶上

SXT:

三黄协心堂

中医:

中药

阿联酋:

超声波协助提取

QWZ设计研究，进行文献检索，提取和分析数据，起草稿件，是通讯作者。LGL对手稿的关键修订做出了贡献。WCY参与设计了本研究，并共同编写了全文，是共同通讯作者。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

确认

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

数据和材料的可用性

本系统综述中使用的所有数据均可在公共领域获得。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

不适用。

资金

本研究由澳门科技发展基金(FDCT/042/2014/A1)、中国科学技术部(No. 2013DFM30080)、澳门大学(MYRG2014-00162-ICMS-QRCM和MYRG2016-00046-ICMS-QRCM)资助。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

作者及隶属关系

1. 中药质量研究国家重点实验室，澳门大学中医科学研究所，澳门，中华人民共和国

   张清文，林立根

2. 暨南大学药学院中药及天然药物研究所，广东省中药现代化工程研究中心，广州510632

   Wen-Cai你们

相应的作者

对应到晴雯张或Wen-Cai你们．

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