糖蛋白组学中的纳米技术

蛋白糖基化作为一种重要的翻译后修饰，与许多疾病有关。将蛋白质组学方法，包括在生物标志物检测和疾病早期诊断中发挥重要作用的质谱(MS)分析应用于糖蛋白或糖肽的研究，将有助于更深入地了解与癌症、炎症和退行性疾病有关的许多生理功能和生物学途径。与非糖肽相比，糖肽的丰度和电离电位相对较低;因此，在质谱分析之前，对糖肽进行样品富集是必要的。在过去的十年中，纳米技术的应用已经迅速渗透到许多不同的科学研究领域。特别是在我们现在所说的“糖蛋白组学领域”，纳米技术提高了复杂生物液体中糖肽检测的敏感性和特异性，这对疾病诊断和监测至关重要。在这篇综述中，我们重点介绍了一些最近的研究，这些研究将特定纳米技术的能力与糖蛋白组学的综合特征结合起来。特别是，我们专注于纳米技术在复杂生物样品中促进糖肽检测的方式，并在强度和分辨率方面增强了质谱的表征。这些研究揭示了纳米技术在帮助克服生物标志物发现中的某些技术挑战方面的日益重要的作用，特别是在糖蛋白组学研究中。

蛋白糖基化是活细胞中最常见的翻译后修饰(PTMs)之一[1，2]。糖蛋白在细胞粘附、受体激活和信号转导等生物过程中起着至关重要的作用[3.- - - - - -5]。因此，改变或错误的糖基化常常与炎症性疾病、神经退行性疾病甚至某些癌症有关[6，7]。例如，一些研究人员观察到不同糖化蛋白的异常表达与疾病有关，糖蛋白水平的变化可以作为疾病诊断的标志，包括结肠癌的碳水化合物抗原CA-19-9 [8]，前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA) [9α-胎儿蛋白对肝癌的影响[10]， β-人绒毛膜促性腺激素用于生殖细胞肿瘤[11]。此外，许多可获得的膜结合蛋白或细胞外蛋白被糖基化，可以用于治疗目的，例如用于乳腺癌治疗的Her2受体[12]。

到目前为止，鉴定(有时是微妙的)疾病相关糖蛋白变化的分析方法可分为两大类:基于糖蛋白或基于糖肽类的分析。我们在图中说明了这两种方法的工作流程1(1]。在第一种方法(基于糖蛋白)中，糖蛋白通过不同的分离方法富集，如尺寸排除、离子交换、亲和层析、化学固定等方法。鉴定糖蛋白的蛋白质部分比鉴定同一糖蛋白的聚糖部分要容易得多。在后一种(基于糖肽的)策略中，糖蛋白最初经过酶或化学降解，得到的糖肽可以通过几种方法富集，如凝集素亲和层析[13- - - - - -15]，硼酸法[16，17]、肼化学[18- - - - - -20.]，或利用亲水性相互作用进行固相萃取[21]。然后将富集的糖肽去糖基化并通过质谱分析进行定量。因此，可以很容易地确定各种糖肽的序列及其特定的糖基化位点。随着越来越复杂的MS模式的出现，我们现在可以在糖蛋白组学研究领域进行更深入的研究。然而，使用当前基于质谱的技术分析复杂样品(如血清或血液)中的糖肽仍然存在挑战，因为糖肽在总溶液中的比例很小，而且它们在质谱中的信号通常被非糖基化肽的信号所掩盖。22]。因此，提高复杂样品中糖肽富集和检测的特异性和敏感性仍然是一个非常现实的挑战。

在过去的十年里，我们见证了纳米技术在解决生物和生物医学问题方面的巨大发展。由于这些(纳米)技术的进步，我们现在可以以前所未有的速度和分辨率识别和分析生物分子。与传统的宏观尺度材料相比，纳米材料，如纳米颗粒、纳米线、纳米管、纳米棒和具有中尺度孔的薄膜，具有独特的输运性质(即更有效的电子输运)、更好的光激发和更高的检测效率。纳米材料还使其制造的平台具有更高的表面体积比和更小的尺寸，这是增强材料物理和化学性能的关键特征。此外，具有较低维度的材料有助于在阵列和芯片实验室平台上实现极高的单元密度集成，用于高通量生物检测的护理点设备。由纳米材料组成的小型化装置具有成本低、便携性好等优点，在微创仪器中具有潜在的应用前景。23]。在图2，我们提出了一些纳米材料支持的生物分子检测平台的例子，例如用于检测前列腺特异性抗原(PSA)的硅纳米线场效应晶体管(SiNW-FET)传感器，用于检测血清蛋白的实时石英晶体微天平(QCM)和用于检测蛋白质相互作用的ZnO纳米棒平台。我们和其他人已经开发了一系列具有各种纳米结构的介孔二氧化硅薄膜芯片，可以选择性地从复杂的生物流体中富集低分子量肽，作为生物标志物发现平台的一部分[24- - - - - -28]。

由于复杂的聚糖结构、聚糖异构体和附着在寡糖链上的氨基酸残基等混杂因素，糖蛋白不容易被分离和鉴定。蛋白糖基化分析(糖基化位点鉴定、聚糖结构测定、位点占用和聚糖异构体分布)最常用的技术是质谱，尽管仍存在一些技术挑战[32]。在这篇综述中，我们将重点介绍一些已经开发出来的用于从复杂样品中富集糖肽的平台，并介绍将质谱的灵敏度和准确性与纳米平台的精致选择性相结合的新兴组合平台。

纳米材料是一种天然的、偶然的或人造的材料，含有未结合、聚集或凝聚状态的颗粒，其中一个或多个外部尺寸在1-100纳米的尺寸范围内。由于它们的尺寸更小，纳米材料比笨重的材料拥有更大的表面积。这一特性为糖肽富集提供了更多的活化位点和独特的光学性质，在快速和敏感的检测背景下。也许纳米材料最吸引人的特点是其尺寸、形状和形态可以精确控制的程度，以增强某些应用中通常需要的光学、电子或磁性能力。目前已有几种纳米平台可用于在复杂样品中分离糖肽，它们具有更高的灵敏度和特异性，我们将在下面的小节中详细讨论它们。

糖肽富集纳米颗粒

纳米颗粒可以说是最广泛用于组装生物分子富集芯片的纳米材料，因为:1)纳米颗粒可以合成具有各种尺寸分布和形态的纳米颗粒;2)纳米颗粒可以通过多种试剂进行修饰和多样化，用于特定用途;3)它们具有独特的光学和电化学特性。当试图在复杂样品中富集糖肽时，研究人员通常采用核-壳结构的纳米颗粒，其磁性核位于一层薄薄的兼容材料中。提供强大磁力的磁芯会被磁铁吸引，而外层很容易被各种有机或无机试剂修饰，以识别感兴趣的生物标志物。

使用上述方法的一个版本，Zhou等人制造了氨基苯基硼酸功能化的磁性纳米颗粒，并使用它们从含有非糖分子的混合物中选择性地捕获糖肽和糖蛋白[33]。其他研究小组也将表面修饰的纳米颗粒用于糖蛋白的选择。例如，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)经常被用作二氧化硅纳米颗粒的表面修饰试剂，其中氨基赋予正电荷。Zhang Y.和同事们设计了一个一步盐碱化反应，将APTES组装到纳米颗粒表面，以捕获氧化糖肽上的醛基。与传统的基于酰肼树脂的固相萃取方法相比，这些纳米颗粒在不牺牲富集效率的情况下，将偶联时间从12-16小时大大缩短至仅4小时。34]。张磊等开发了一种新型的核心-卫星结构复合材料。这些是金纳米粒子，用硼酸功能化，然后固定在硅涂层磁芯的表面。利用这种策略，研究人员在富集后能够回收85.9%的糖肽和71.6%的糖蛋白。复合纳米颗粒具有每克材料超过79毫克糖蛋白的吸附能力。研究人员使用这些新的复合纳米颗粒从人类结直肠癌组织中富集糖基化蛋白，用于随后鉴定n -糖基化位点。他们能够将194个独特的糖基化位点映射到155种不同的糖蛋白上，其中165个位点(85.1%)是新发现的[35]。

多糖也可用作糖肽富集的表面修饰成分。Xiong等人报道了一种逐层合成磁性纳米颗粒(MNPs)的方法，这些磁性纳米颗粒被多层多糖外壳包裹，然后使用这些亲水性材料选择性地富集生物样品中的糖肽。这些研究人员在616个不同的糖肽中鉴定出605个独特的n -糖基化位点，对应于20 μg小鼠肝蛋白样品中的350个糖基化蛋白。他们的研究结果表明，利用特定的糖-糖相互作用作为表征蛋白质糖基化的设计策略是有希望的[36]。

Tran等人没有使用硼酸作为纳米颗粒的表面修饰剂，而是开发了一种新型的金纳米颗粒，用超小的肼基团功能化，核直径为1.2 nm。组装过程包括氧化步骤和共价偶联，其中糖蛋白的碳水化合物部分被高碘酸盐氧化成醛，氧化的糖蛋白被共价偶联到肼树脂上。洗涤不去除糖蛋白。他们成功地利用这些纳米颗粒从复杂的生物样品中分离出90%的糖肽。纳米颗粒在生物溶液中的稳定性、独特的溶解度和大的肽捕获能力在糖蛋白组学研究中提供了巨大的应用潜力。37]。

通过它们的凝集素片段分离糖肽是另一种常见的方法，现在市场上有商业化的解决方案。Tsutsumi和同事将金纳米粒子(GNPs)与单糖修饰的肽结合作为检测凝集素的光学探针。糖肽修饰的GNPs与豆豆蛋白A (ConA)聚集导致从534 nm到620 nm的吸收位移，可以用肉眼检测到明显的颜色变化[38]。

配体修饰的纳米颗粒已被证明是糖肽富集的良好平台，但无配体的纳米颗粒正在成为糖蛋白或糖肽分离的良好候选者。复旦大学的一个研究小组开发了一种磁性纳米结构的无配体纳米银，利用聚糖与纳米银的可逆相互作用，选择性富集糖肽。利用这些银纳米颗粒磁珠，研究人员可以在糖肽:非糖肽(1:100)的低摩尔比下轻松快速地提取糖肽(仅需1分钟孵育时间)。此外，他们从非常小的样本量(仅1 μL大鼠血清)中绘制了127个独特的糖肽映射到51种不同的糖蛋白[39]。

颗粒基材料由于其纳米尺寸、严格控制的尺寸以及独特的光学和电化学性质而被广泛用于分离糖基化肽。它们可能会继续在糖蛋白组学中发挥重要作用，用于生物标志物检测和疾病的早期诊断。

糖肽富集的介孔材料

多孔材料有好几类，并按尺寸分组。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)澄清[40]，微孔材料和大孔材料，孔径分别小于2nm和大于50nm;介孔材料位于中间。自20世纪70年代发展起来的介孔二氧化硅材料，由于其孔排列规律、制备方法简单、成本低等优点，目前已广泛应用于药物输送、成像、生物传感器等领域。在强大的毛细管力作用下，进入介孔孔隙的生物分子会遇到更多的活化位点进行结合，从而获得更高的分离效率。许多糖蛋白组学研究已经使用介孔材料进行糖肽的分离和分离。

Xu和他的同事们首先介绍了用硼酸功能化的介孔二氧化硅材料，用于检测糖基化肽。在图3.，我们将演示这种方法的基本工作流程。所制备产物的场发射电子扫描显微镜图像显示出规则的蜂窝状六边形孔隙模式。溶液中的糖肽与孔内附着的基团具有高亲和力，显著提高了溶质检测限[41]。同样，Liu等。[22张宏等。[42应用氨基苯基硼酸(APB)功能化介孔二氧化硅分别分析标准蛋白溶液和大鼠血清中的糖肽。

除了硼酸，过渡金属氧化物也可以偶联到介孔二氧化硅上，正如Wan和同事所证明的那样。这些研究人员将介孔二氧化硅微球包覆在一层二氧化锆中，以创建亲水相互作用液相色谱(HILIC)固相萃取(SPE)的平台(如图所示)4)。HILIC具有广泛的聚糖特异性、良好的重现性和与质谱分析的相容性。ZrO₂物种高度分散在细观结构泡沫表面。氧化锆氧原子之间的氢键₂而多糖的氢原子之间形成了较强的相互作用，从而从复杂的样品中分离出糖肽。自从ZrO₂也能吸引磷酸肽，研究者用ZrO ? ?处理消化后的磷酸蛋白、α-酪蛋白和IgG的混合物₂/MPS HILIC SPE材料。结果表明，在氧化锆层覆盖二氧化硅表面的干扰下，糖肽可以有效富集[43]。

氧化介孔碳是糖蛋白组学研究中另一种非常有用的材料，因为它具有非凡的亲水性。因此，N-连接聚糖上的寡糖与碳官能团相互作用，使糖肽在质谱分析之前能够分离。使用这种方法，秦等人在基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析之前，使用氧化和有序的CMK-3介孔碳材料富集N-连接聚糖。在复杂样品中分析了32个n -链聚糖，其中5个(4个核心聚焦的聚糖)在肝癌中与健康样品相比表现出不同的模式。他们的研究结果支持了这样一种观点，即精确尺寸的介孔碳材料可以在临床糖蛋白组学中发挥重要作用。44]。

具有如此广泛的适用性和适应性，我们期望介孔材料的使用继续对糖蛋白组学领域产生影响。大的比表面积、表面修饰潜力、对大分子量生物分子的尺寸排斥、以及在纳米尺度上支持强大的毛细力等都是其广泛应用的特点。

其他糖肽富集的纳米平台

二维(2D)晶体材料最近被鉴定和分析用于糖肽富集[45]。石墨烯由单原子层碳组成，是第一个应用于这类新材料的材料。一些独特的性质使它有趣，适合基础研究和未来的应用。由于其大的比表面积和超强的可吸收性，表面功能化石墨烯或氧化石墨烯现在被用于聚糖富集。Zhang等人最近介绍了一种快速、高效、可视化的聚糖富集方法，使用1-芘丁酰氯功能化氧化石墨烯[46]，如图所示5．首先，用1-吡喃丁酸和1-吡喃丁基氯对石墨烯进行功能化处理。在氧化石墨烯上，聚糖的羟基和酰氯之间通过1-芘丁基氯的π-π堆叠形成可逆共价键。活性的1-芘丁酰氯具有较大的比表面积和较重的功能化，大大提高了富集效率。当研究人员在几种样品处理应用中测试这种材料时，质谱信号强度、信噪比和在标准寡糖或从糖蛋白中释放的n -聚糖上鉴定的糖型数量显著增加。

碳纳米管是碳的同素异形体，具有圆柱形纳米结构。这些圆柱形碳分子具有不同寻常的特性，可以被电子工业、光学工业和其他材料科学与技术领域所利用。Zhang X.及其同事构建了一种新型的基于凝集素的电化学生物传感器，该传感器具有功能化的多壁碳纳米管，可从活细胞中捕获聚糖[47]。他们通过将聚二烯基二甲基氯化铵(PDDA)功能化碳纳米管(PDCNTs)吸附到玻璃碳电极(GCE)上，然后通过谷胱甘肽(GSH)保护的金纳米颗粒(AuNPs)吸附来制备生物传感器。该材料具有较高的稳定性和生物活性，成为凝集素固定化的有效平台。研究人员还合成了一种硫醇衍生的碳水化合物(硫甘露糖基二聚体)来构建(碳纳米管/硫氨酸/金- s -甘露糖)生物复合材料，该复合材料使用碳纳米管作为载体负载大量的硫氨酸(产生电化学信号)和AuNPs(锚定硫甘露糖基二聚体)。

功能化碳纳米管的两种应用，无论是作为生物传感平台还是作为生物复合材料，都可以增强聚糖信号检测。前者(电化学生物传感器)在分析人肺癌细胞中的甘露糖方面表现出高灵敏度、选择性和快速响应的良好分析性能。通过扩大生物传感器开发的选择片段(如凝集素)，这种方法可以适用于其他适应症。

研究者很早就认识到蛋白质糖基化在生理过程和疾病中的重要性，相关出版物的数量不断积累证明了这一点。此外，糖基化蛋白越来越多地被认为是通过蛋白质组学方法进行疾病早期检测的生物标志物。尽管近年来质谱技术的进步使得蛋白质的大规模鉴定成为可能，但由于糖肽通常只占总肽混合物的一小部分，其信号强度通常低于非糖基化肽，并且在非糖肽存在时受到抑制，因此在复杂样品中分析蛋白质糖基化仍然是非常具有挑战性的。纳米技术无疑为糖蛋白/糖肽富集方法的实现做出了贡献，特别是在为质谱表征做准备的复杂样品中富集。不同形态和特征的纳米材料(纳米颗粒、介孔材料、纳米片、纳米管等)的使用提高了糖肽分离的敏感性和特异性。

在检测翻译后修饰的蛋白质/肽，特别是循环糖肽方面仍然存在挑战。由于糖基化肽独特的电化学性质、光学性质和能量品牌结构，表征糖基化肽也很困难。通过将纳米级材料应用于可调谐平台，科学家们通过增加质量分辨率、质量范围、质量强度等，极大地增强了传统的基于质谱的技术的能力。我们相信这一重大进展为纳米工程、质谱和糖蛋白组学结合领域的未来努力(和成就)开辟了一条道路。

HZ、YL、YH参与了稿件的起草。所有的作者都阅读并批准了最终的手稿。

我们要感谢国防部创新者奖(DOD W81XWH-09-1-0212)， NIH U54CA151668，比尔和梅林达盖茨基金会以及国防部W81XWH-11-2-0168。

作者及单位

1. 休斯顿卫理公会研究所纳米医学部，休斯顿，德克萨斯州，77030，美国

   赵虎，李耀军，胡晔

2. 威尔康奈尔医学院细胞与发育生物学教研室，纽约10021

   你们胡

相应的作者

对应到你们胡．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

开放获取本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作品要有适当的署名。创作共用公共领域免责声明(https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。

转载及权限