CD4中AhR的缺失⁺急性移植物抗宿主病患者中的T细胞可能与CTCF表达不足有关

背景

急性移植物抗宿主病(aGVHD)是异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allogeneic hsct)的一种危及生命的并发症。越来越多的证据表明，Treg/Th17比例不平衡加速了aGVHD的进展。芳基烃受体(AhR)是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，通过同源配体结合激活。目前的证据支持AhR在Treg和Th17细胞的分化中起着关键的调节作用。然而，AhR和aGVHD之间的关系尚不清楚。

结果

我们的结果显示，AhR在CD4细胞中的表达显著下调⁺aGVHD患者的T细胞与非aGVHD组比较。我们还发现在激活AhR后CD4细胞缺乏⁺T细胞、活化标志物cd40l、CD134、CD137的表达水平及细胞增殖活性均显著高于表达ahr的CD4⁺T细胞。恢复aGVHD CD4细胞中AhR的表达⁺T细胞导致treg和相关基因转录物的百分比显著增加，包括Foxp3, IL-10和CD39。相比之下，Th17细胞数量和相关基因(包括RORγt、IL-17A和IL-17F)的转录显著降低。我们证实CTCF招募EP300和TET2结合到AhR启动子区域，并通过介导该区域组蛋白H3K9/K14的高乙酰化和DNA去甲基化促进AhR的表达。CTCF低表达导致AhR启动子组蛋白低乙酰化和DNA高甲基化，导致aGVHD CD4表达不足⁺T细胞。

结论

CTCF是AhR转录的重要诱导因子。CTCF表达不足导致AhR过度下调，导致CD4大量增加⁺T细胞活化和Th17/Treg比值增加，从而介导aGVHD的发生。

虽然异基因造血干细胞移植(异基因造血干细胞移植)被认为是造血恶性肿瘤的唯一治疗方法，但急性移植物抗宿主病(aGVHD)是异基因造血干细胞移植后非复发性死亡的主要原因[1，2，3.］．aGVHD是一个复杂的炎症过程，其中免疫反应是由同种异体供体T淋巴细胞识别宿主同种异体抗原触发的。激活后，异源反应供体T细胞迁移到目标器官，主要是皮肤、肺、肝脏和胃肠道，在那里它们引起aGVHD特有的组织损伤[4，5，6］．因此，控制T淋巴细胞的过度激活是防治aGVHD的关键。

CD4细胞比例不平衡⁺T细胞亚型Treg和Th17细胞(Treg/Th17)加速aGVHD的进展[7，8，9］．treg抑制多种T细胞相关炎症疾病并缓解GVHD而不削弱移植物抗白血病作用[10，11］．临床研究表明，与无aGVHD患者和健康供体相比，重度和轻度aGVHD患者Treg率和Foxp3表达明显降低[12，13］．Th17细胞与aGVHD的病理生理相关，并显著影响疾病的严重程度[14，15］．重度和轻度aGVHD患者的Th17细胞率和RORγt表达明显高于无aGVHD患者和健康供体[12］．因此，探索Treg/Th17失衡的分子机制是分析aGVHD发病机制、制定适当治疗方案的关键。

芳基烃受体(AhR)是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，通过同源配体结合激活。它位于细胞的细胞质中，是一种含有大量蛋白质的非活性复合物。在配体结合后，AhR易位到细胞核并发生构象变化，招募辅激活子或辅抑制子与目标基因的启动子结合并调节其表达[16，17］．目前的证据显示AhR在免疫系统调节中起着关键作用[18，19]，特别是Treg和Th17细胞的分化[20.，21，22，23］．AhR被2,3,7,8-四氯二苯并-对二恶英(TCDD)、(1 ' h -吲哚-3 ' -羰基)-噻唑-4-羧酸甲酯(ITE)、Kynurenine (Kyn)或Laquinimod代谢产物激活会增加Foxp3⁺Treg细胞通过不同的机制，包括直接转激活和诱导控制Foxp3转录的表观遗传修饰[23，24，25，26，27］．另一方面，6-Formylindolo [3,2-b]咔唑(FICZ)激活AhR可通过诱导RORC表达促进Th17细胞分化[28］．这些AhR激活后的不同结果被解释为反映配体对CD4的内在作用⁺T细胞分化，尽管没有明确的解释这种差异的报道。

AhR已被证实可抑制agvhd相关炎症因子如IL-1β、IL-6和NLRP3的表达[29，30.］．据报道，TCDD可诱导CD4细胞的调节功能⁺T细胞以ahr依赖机制抑制小鼠aGVHD [31］．此外，研究发现接受AhR的受体小鼠^-/-在两种不同的小鼠异基因骨髓移植模型中，T细胞提高了生存率并降低了aGVHD [32］．因此，AhR与aGVHD的关系尚不清楚，AhR在人aGVHD CD4细胞中的表达状况也不清楚⁺T细胞也不清楚。

在本研究中，我们证实了AhR在CD4中被下调⁺aGVHD患者与非aGVHD患者的T细胞。探讨CD4细胞中AhR下调的分子机制⁺在aGVHD的T细胞中，我们使用生物信息学方法发现AhR启动子区域包含多个CCCTC结合因子(CTCF)结合位点，以及多个CpG岛。有报道称CTCF与靶基因结合导致被占领区域DNA去甲基化，但具体机制尚不清楚[33］．蛋白-蛋白相互作用分析表明，CTCF可与TET2、EP300相互作用。

TET2是10 - 11易位(TET)家族成员，可将5-甲基胞嘧啶(5mC)氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)，从而促进DNA去甲基化[34］．E1A结合蛋白p300 (EP300)是一种组蛋白乙酰转移酶，通过染色质重塑调节转录，在细胞增殖和分化过程中起重要作用[35］．组蛋白H3 Lys 9 (H3K9)和H3K14是EP300修饰的常见乙酰化位点，被认为是激活基因转录的标志[36，37］．我们前期的研究证实CTCF在CD4细胞中表达减少⁺aGVHD患者与非aGVHD患者的T细胞比较[38］．因此，我们推测CTCF低表达可能减少了TET2与EP300在AhR启动子上的相互作用，导致AhR启动子DNA高甲基化和组蛋白H3K9/K14低乙酰化，导致AhR表达不足。

AhR在CD4中降低⁺来自aGVHD患者的T细胞

研究AhR在CD4细胞中的异常表达⁺GVHD患者T细胞CD4中AhR的表达水平⁺检测来自aGVHD和非aGVHD患者的T细胞。Real-time PCR和Western blot结果显示，CD4细胞中AhR的表达明显下调⁺aGVHD患者的T细胞与非aGVHD组比较(图2)。1A、B)。

探讨AhR表达降低对CD4的影响⁺T细胞活化后，我们将AhR干扰质粒(pRS-AhR)或阴性对照质粒(pRS)转染到CD4细胞中⁺来自健康捐献者的T细胞。转染后的细胞用AhR激动剂ITE培养，然后用Dynabeads T细胞扩张剂(TCR刺激)刺激。Western blot结果显示，与pRS组相比，rs -AhR组的AhR表达明显降低(图。1C).采用流式细胞术检测不同转染组T细胞活化标志物(CD40L、CD134、CD137)的表达水平;与pRS组相比，pRS- ahr组CD40L、CD134、CD137的表达水平明显升高(图。1d e)。此外，观察AhR下调对CD4的影响⁺T细胞增殖，CD4正常⁺分别用pRS- ahr和pRS质粒转染T细胞，并在含有IL2的抗cd3 /抗cd28抗体的情况下给予ITE。CCK8检测结果显示，转染pRS- ahr的细胞增殖明显高于转染pRS组(图2)。1F).这些结果表明，AhR下调可能是aGVHD CD4过度激活和增殖的重要原因⁺T细胞。

恢复aGVHD CD4中AhR的表达⁺T细胞增加Treg细胞数量，降低Th17细胞水平

评价恢复CD4细胞中AhR表达的效果⁺从aGVHD患者的Tregs和Th17细胞上提取AhR表达质粒(pCMV6-AhR)或对照质粒(pCMV6)转染到aGVHD CD4细胞上⁺T细胞。AhR表达组用ITE处理，pCMV6转染组用载体对照。流式细胞术显示treg在CD4细胞中的百分比⁺与转染对照组+载体对照组相比，AhR + ITE治疗组的T细胞表达显著升高(图．2a - c)。相比之下，AhR表达+ ITE处理组Th17细胞比例明显低于转染对照组+载体对照组(图．2a - c)。此外，我们还通过real-time PCR分析了Tregs和Th17细胞相关基因的表达水平。AhR表达和ITE处理导致treg相关基因转录物显著上调，包括Foxp3、IL-10和CTLA-4(图2)。2D)。相反，AhR表达和ITE处理降低了th17相关基因转录物的表达，包括rar γt, IL-17A和IL-17F(图。2E).总的来说，这些结果表明在aGVHD CD4中恢复AhR的表达⁺T细胞可以纠正Treg/Th17细胞失衡。

CTCF不足会下调CD4细胞的AhR⁺来自aGVHD患者的T细胞

探讨CD4细胞中AhR下调的分子机制⁺aGVHD患者的T细胞，我们用在线软件分析AhR启动子(http://jaspar.binf.ku.dk/)，发现−204 bp至+ 611 bp区域包含多个CTCF结合位点(图2)。3.A).在CTCF过表达的Jurkat细胞中，利用ChIP-PCR分析CTCF是否能与AhR启动子相互作用。采用覆盖AhR启动子(−805 ~ + 617 bp)区域的4对real-time PCR引物进行检测。如图所示。3.B, ChIP-PCR证实CTCF结合在AhR启动子的- 204 ~ + 611 bp区域。

我们之前的研究证实了CTCF在CD4细胞中的表达减少⁺aGVHD患者与非aGVHD患者的T细胞比较[38］．进一步探讨CTCF在CD4细胞AhR启动子区的结合水平⁺从aGVHD患者的T细胞中，我们评估了CD4中AhR启动子区CTCF的结合水平⁺利用抗ctcf抗体ChIP-qPCR检测aGVHD和非aGVHD患者的T细胞。如图所示。3.C, aGVHD患者与非aGVHD患者相比，CTCF与AhR启动子的结合减少。相关分析表明，CTCF结合与CD4细胞中AhR表达呈明显正相关⁺来自aGVHD患者的T细胞(图;3.D)。

为了进一步证实CTCF对AhR表达的促进作用，我们将CTCF表达质粒(pCMV6-CTCF)或对照质粒(pCMV6)转染到aGVHD CD4细胞中⁺T细胞转染CTCF干扰质粒(pRS-CTCF)或阴性对照质粒(pRS)到正常CD4细胞⁺T细胞。Real-time PCR和Western blot结果显示，aGVHD CD4细胞中AhR显著上调⁺CTCF表达后的T细胞(图．3.E-G)， AhR在正常CD4细胞中显著下调⁺CTCF沉默后的T细胞(图．3.H-J)。上述结果提示CTCF是诱导AhR表达的重要转录因子，CTCF表达降低可能是aGVHD CD4中AhR下调的主要原因之一⁺T细胞。

CTCF招募TET2和EP300与AhR启动子区域相互作用

为了进一步揭示CTCF促进AhR表达的分子机制，hTFtarget数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget#!/)预测可能与CTCF共同调节AhR表达的调控因子。TET2和EP300，甲基胞嘧啶双加氧酶和组蛋白乙酰化酶分别预测与CTCF相互作用。我们之前的研究证实了CTCF在CD4中的作用⁺T细胞可以与EP300结合;所以在这里我们只评估了CTCF与TET2的相互作用[38］．首先，将CTCF和TET2表达质粒转染Jurkat细胞，采用免疫共沉淀法检测CTCF是否能与TET2形成复合物。如图所示。4A，免疫共沉淀证实TET2与CTCF共沉淀。通过ChIP-qPCR检测CD4细胞中AhR启动子区TET2和EP300的结合水平⁺来自aGVHD患者和非aGVHD患者的T细胞。如图所示．4B-C, aGVHD患者与对照组相比，TET2和EP300在AhR启动子上的结合水平降低。

为了证实CTCF在介导TET2和EP300与AhR启动子结合中的重要作用，分别将CTCF干扰质粒和阴性对照质粒共转染到正常CD4细胞中⁺转染TET2和EP300表达质粒(pCMV6-TET2和pCMV6-EP300)的T细胞，采用ChIP-qPCR方法评估TET2和EP300与AhR启动子的结合。在CTCF干扰TET2和EP300表达组中，TET2和EP300在AhR启动子区域的结合水平明显低于打乱对照TET2和EP300表达组和阴性对照组(图．4d e)。此外，我们将CTCF表达质粒(pCMV6-CTCF)或对照质粒(pCMV6)转染到aGVHD CD4中⁺T细胞。如图所示．4aGVHD CD4细胞中AhR启动子区F-G、TET2和EP300结合水平明显升高⁺CTCF表达后的T细胞。这些结果表明CTCF是促进TET2和EP300与CD4中AhR启动子结合的重要转录因子⁺T细胞。TET2和EP300在AhR启动子中的结合减少与aGVHD CD4中CTCF表达不足有关⁺T细胞。

CD4中AhR启动子的DNA高甲基化和组蛋白H3K9/14低乙酰化⁺来自aGVHD患者的T细胞

TET2和EP300分别是介导DNA去甲基化和组蛋白H3K9/K14乙酰化的关键酶。确认TET2和EP300在AhR启动子中的结合减少是否会导致aGVHD CD4中的DNA高甲基化和组蛋白低乙酰化⁺在CD4的AhR启动子区，我们检测到DNA甲基化和组蛋白H3K9/K14乙酰化水平⁺有或没有aGVHD患者的T细胞。BSP显示CD4细胞中AhR启动子的DNA甲基化水平⁺aGVHD患者T细胞明显高于CD4细胞⁺来自非agvhd病例的T细胞(图;5A). ChIP-qPCR检测aGVHD CD4中AhR启动子组蛋白H3K9和K14乙酰化水平⁺T细胞明显低于对照组(图．5c)。此外，AhR启动子区DNA甲基化和组蛋白H3K9/K14乙酰化水平与AhR表达相关。结果表明，DNA甲基化与AhR表达呈负相关(图2)。5D)， H3K9/K14ac与aGVHD CD4细胞中AhR的表达呈正相关⁺T细胞(图．5E-F)。

为了进一步证实CTCF对AhR启动子区DNA甲基化和组蛋白H3K9/H3K14乙酰化的影响，在正常CD4细胞中检测AhR启动子区DNA甲基化和组蛋白H3K9/H3K14乙酰化水平⁺T细胞转染CTCF干扰质粒，或aGVHD CD4⁺用CTCF表达质粒转染T细胞。在正常CD4细胞中，我们观察到AhR启动子区DNA甲基化增加，组蛋白H3K9/K14ac减少⁺CTCF沉默后的T细胞(图．6a - c)。相应的，aGVHD CD4细胞DNA甲基化减少，H3K9和K14ac显著上调⁺CTCF表达后的T细胞(图．6D-F)。综上所述，这些结果表明CTCF缺失是aGVHD CD4中AhR启动子DNA高甲基化和组蛋白H3K9/K14低乙酰化的重要因素⁺T细胞。

CD4⁺T细胞是重要的免疫效应细胞，其功能的改变会严重影响炎症反应和免疫耐受[39］．最近，越来越多的实验和流行病学研究表明，AhR在免疫功能中起着重要作用，特别是在CD4领域⁺T细胞介导的炎症[17，21］．

TCDD激活AhR促进Foxp3分化⁺体内及体外treg [21，27］．分泌il -10的T调节类型1 (Tr1)细胞是CD4的一个重要子集⁺通过抑制抗原提呈细胞和抗原特异性效应T细胞的功能来控制过度炎症和自身免疫的T细胞[40］．tcdd介导的AhR激活CD4⁺T细胞直接改变IL-10、CTLA4、CD39、GITR等基因的表达，促进CD4⁺T细胞分化为Tr1细胞[41，42，43，44］．与TCDD增加treg相反，另一种高亲和力AhR配体FICZ已被报道在几种小鼠模型中增强Th17反应并加剧免疫介导疾病[21，45］．这些看似矛盾的结果可能与AhR信号的激活强度有关。新的研究发现，低剂量的AhR配体(TCDD, FICZ)不会诱导treg，也不会改变异体反应，而是增加CD4的百分比⁺产生IL-17的T细胞。当给予高剂量时，TCDD和FICZ诱导Tr1细胞并增加Foxp3⁺treg与抑制异体反应[46］．这些数据表明AhR对Treg和Th17的分化都有影响，但Treg可能对AhR信号的激活强度有更大的需求。Th17对AhR信号更为敏感，少量AhR激活可维持Th17分化。我们推测CD4细胞中AhR信号的衰减⁺T细胞对treg的分化有较大影响，导致Th17细胞占优势。

在本研究中，AhR在CD4细胞中的表达明显下调⁺aGVHD患者的T细胞与非aGVHD患者的T细胞进行比较。此外，我们的结果证实，激活AhR后CD4不足⁺T细胞、活化标志物cd40l、CD134、CD137的表达水平及细胞增殖活性均显著高于表达ahr的CD4⁺T细胞。研究表明，aGVHD患者血浆中AhR内源性配体明显减少，提示aGVHD患者AhR信号通路被抑制[47，48］．这些结果表明，AhR的正常表达和激活是阻止CD4的重要因素⁺T细胞过度活化和增殖，这可能与AhR促进Treg细胞分化和功能有关。恢复aGVHD CD4细胞中AhR的表达⁺T细胞，充分激活它可以促进Tregs的分化，诱导功能基因的表达，抑制CD4的激活和增殖⁺T细胞。

CTCF是一种广泛表达的多功能转录因子，涉及许多关键的细胞过程，包括启动子激活和抑制、激素反应性基因沉默和基因组印迹。它从果蝇到小鼠和人类都是必需的，而且高度保守[49，50］．值得注意的是，最近有研究表明CTCF可能与Th2细胞和Treg分化密切相关。ctcf缺陷CD4的Th2极化⁺T细胞被阻断，IL-4、IL-5、IL-13转录水平明显降低。此外，ctcf缺陷CD4的分化⁺T细胞转化为Tregs也受到抑制，Foxp3表达降低[51］．CTCF与Oct-1合作，直接与IL-17位点相互作用，调控Th17细胞分化和IL-17的产生[52］．这些研究表明CTCF参与增加treg和减少Th17细胞。

我们前期研究证实CTCF与EP300相互作用，直接与p53启动子区结合，通过上调该区域组蛋白H3K9/K14乙酰化水平促进p53表达。CTCF在CD4细胞中的低表达⁺aGVHD病例中的T细胞是导致p53启动子组蛋白H3K9/K14低乙酰化和p53下调的重要因素。恢复CD4细胞中CTCF的表达⁺aGVHD患者的T细胞增加p53数量并纠正Th17细胞/ treg的不平衡[38］．在本研究中，我们证实CTCF是AhR转录的重要激活因子。它招募EP300和TET2结合到AhR启动子区域，通过介导该区域组蛋白H3K9/K14的高乙酰化和DNA去甲基化促进AhR的表达。CTCF低表达导致AhR启动子组蛋白低乙酰化和DNA高甲基化，导致aGVHD CD4表达不足⁺T细胞。

EP300是调节Foxp3乙酰化及其功能的几种乙酰转移酶之一。Foxp3中EP300的条件缺失或药理学抑制⁺Tregs增加T细胞受体诱导的Treg细胞凋亡，损害Tregs的抑制功能以及外周Treg细胞诱导[53，54］．TET2是催化Foxp3基因treg特异性去甲基化区域(TSDR)去甲基化的关键因子。TET2介导TSDR去甲基化并激活Foxp3转录，驱动调节性T细胞分化。TET2缺失导致Foxp3高甲基化，损害Treg细胞分化和功能，以及自身免疫性疾病[55，56］．由此可见，EP300和TET2通过上调Foxp3来促进Treg细胞的分化和功能维持。目前的研究结果为EP300和TET2调控Treg/Th17细胞比例平衡和参与免疫抑制的分子机制提供了新的见解。

目前的数据强调了CTCF在维持AhR稳定表达中的关键作用。CTCF表达不足导致AhR表达过低，导致CD4过度活化⁺T细胞和Th17细胞/Treg比例失衡，从而介导aGVHD的发生。

主题

纳入2017 - 2021年湘雅医院造血干细胞移植中心收治的55例同种异体造血干细胞移植患者。所有受试者根据《赫尔辛基宣言》提供了签署的知情同意书。这项研究是根据涉及人体的生物医学研究国际伦理准则的建议进行的。研究方案经中南大学湘雅医学院人类伦理委员会批准。纳入患者的临床特征见表1．调理疗法是基于我们之前的研究[57］．aGVHD是根据临床症状及普遍接受的标准评估的[58，59］．我们分析了aGVHD发病患者的样本(n= 55)和来自无aGVHD患者的时间匹配样本(n= 55)。在aGVHD诊断后和开始治疗前尽快收集外周血样本。此外，我们还收集了正常的CD4细胞⁺从湘雅医院招募12名医务人员进行T细胞转染。

CD4细胞的分离、培养和转染⁺T细胞

采用Ficoll密度梯度法获得外周血单个核细胞。CD4⁺T细胞使用人CD4珠(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)从PBMCs中纯化，并在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)中培养。分离的CD4⁺以2 × 10电转染T细胞⁶/样品。使用人T细胞核载体Kit和Amaxa核载体(Lonza, MD, USA)将基因表达(pCMV6)和干扰(pRS)质粒转染到CD4细胞⁺T细胞。简单地说,CD4⁺将T细胞与质粒混合在100 μl人T细胞核载体溶液中。在Amaxa核载体中使用核载体程序V-024对混合物进行电转染。转染细胞在RPMI 1640完全培养基中培养48 h。

ITE治疗，CD4激活和增殖⁺T细胞

(1 ' h -吲哚-3 ' -羰基)-噻唑-4-羧酸甲酯(ITE) (MedChemExpress, NJ, USA)溶解于DMSO中。CD4⁺将健康供体的T细胞分别转染pRS- ahr和pRS质粒，并用ITE (40 μM)刺激[60］．然后用Dynabeads T细胞扩张剂(anti-CD3/CD28;Invitrogen, CA, USA) 3天。采用流式细胞术检测T细胞活化标志物CD40L、CD134、CD137的表达水平。此外，CD4⁺分别用pRS- ahr和pRS质粒转染T细胞，并用ITE处理;用Dynabeads T细胞扩张剂+ IL-2刺激细胞增殖。4天后，将细胞接种于96孔板中。然后，每个孔中加入10µL Cell Counting Kit-8 (CCK-8, MedChemExpress)，并在37℃的5% CO中孵育1小时₂孵化器。在450nm的微孔板阅读器上测量吸光度。

aGVHD之后是CD4⁺转染AhR表达的T细胞(pCMV6-AhR)或对照质粒(pCMV6)，过表达AhR的细胞用ITE处理，对照细胞用载体对照(DMSO)处理。同时，用Dynabeads T细胞扩张剂刺激所有转染细胞3天。流式细胞术检测各组Treg、Th17细胞百分比。实时荧光定量PCR检测Treg (Foxp3、IL-10和CTLA-4)和Th17 (RORγt、IL-17A和IL-17F)细胞相关基因的表达水平。

流式细胞术和细胞内细胞因子染色

采用流式细胞术检测T细胞活化标志物CD40L、CD134、CD137的表达水平。简单地说，将活化的细胞悬浮在冰冷的FACS缓冲液(PBS-2% FBS)中，并与氟色素标记的单抗(包括抗cd40l - pe (eBiosciences, Thermo Fisher, 24-31)、抗cd134 - fitc (eBiosciences, ACT-35)和抗cd137 - apc (eBiosciences, 4- 1bb)在4℃下孵育20分钟。作为对照，细胞用同型对照单克隆抗体染色。然后将细胞在冰冷的FACS缓冲液中清洗，并使用Cell Quest软件(BD Biosciences, NJ, USA)在BD FACScan上进行分析。

treg细胞用抗cd4 - percp (eBiosciences, MEM-241)和抗foxp3 - pe单抗(eBiosciences, PCH101)检测，Th17细胞用抗cd4 - percp和抗il - 17a - fitc单抗(eBiosciences, eBio64DEC17)检测。简单地说，对于Tregs，活化的细胞首先用抗cd4 - percp单抗表面染色。然后，分别用4%多聚甲醛固定液和Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences, NJ, USA)对细胞进行固定和渗透，进行细胞内染色。固定和渗透后，用抗foxp3 - pe染色，并在BD FACScan上分析。同时，Th17细胞在37℃、5% CO的组织培养箱中，加入50 nM PMA (Sigma Aldrich)和0.5 μg/ml ionomycin (Invitrogen, Thermo Fisher)，加入5 g/ml brefeldin A (eBiosciences)，孵育4 h₂．然后用抗cd4 - percp单克隆抗体标记细胞，固定和渗透，并用抗il - 17a - fitc单克隆抗体染色。作为对照，细胞也用同型对照单克隆抗体染色。

RNA分离和实时PCR

TRIzol试剂(Invitrogen, CA, USA)用于从CD4中分离总RNA⁺T细胞。DNase处理后，用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)逆转录RNA，然后用荧光染料SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)用ABI Prism 7500 (Thermo Fisher Scientific)实时PCR扩增cDNA。以管家基因人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内标进行样品归一化。数据分析由2^−ΔΔCt方法;ΔΔCt = (Ct_目标基因−Ct_内部控制)_样本−(Ct_目标基因−Ct_内部控制)_控制．引物列于表中2．

免疫印迹

CD4⁺T细胞在含有蛋白酶抑制剂的低温裂解缓冲液中裂解(赛默飞世尔科学公司)。然后，裂解液在4˚C下，以12000 g离心15 min。用Bradford蛋白测定试剂盒(Bio-Rad, CA, USA)测定蛋白浓度。接下来，等量的蛋白质被8%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分解，然后电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Bio-Rad, CA, USA)。37°C用5%牛奶在含有0.1% Tween-20的PBS中阻塞2小时后，在4°C下用一抗孵育过夜。一抗包括抗ahr、抗ctcf、抗tet2、抗ep300和抗gapdh (Cell Signaling Technology, MA, USA)。大量洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶偶联二抗在室温下孵育2小时。使用Quantity One软件(Bio-Rad, CA, USA)评估免疫反应条带。

染色质免疫沉淀(ChIP)

根据制造商的说明，使用SimpleChIP®Plus Sonication Chromatin IP Kit(细胞信号技术)进行ChIP分析。简单地说,CD4⁺T细胞用1%甲醛室温固定10min。然后，在0.125 m时用甘氨酸停止交联。用冰冷的PBS清洗细胞两次，然后裂解。染色质被剪成500-1000个碱基对片段。接下来，将抗ctcf、抗tet2、抗ep300、抗h3k9ac、抗h3k14ac和对照兔IgG (Cell Signaling Technology)分别加入裂解液中孵育一夜。免疫复合物用蛋白A琼脂糖珠沉淀，100 μl含有0.5% SDS和200 μg/ml蛋白酶k的TE缓冲液洗涤洗脱，纯化后的DNA通过PCR或real-time PCR扩增目标片段。向前引物如下:1(787年805−−):5 ' CCCTTCACTCCCCCTACA 3 '和扭转1(667年685−−):5 'tgggcctgcaaataacat3”,提出2(143−121−):5 ' GCCCTCAAGGAAGACGGAATG3”和反向2(40−−19):5 ' ACCGGCTGAATAGCAGGAGCA3”,提出3 (+ 134 + 155):5 ' GCGGGAAGCACCCTGGATTTA”和反向3 (+ 236 + 257):5 ' TAGAATCCTGGCCTGGGTCGC”,提出4 (+ 530 + 552):5 ' CCGCAGTGGTCCCAGCCTACAC”和扭转4 (+ 598 + 617):5 ' TCATGGTGCCCAGCCGACG”。

Co-Immunoprecipitation

来自CD4的核蛋白⁺T细胞用NE-PER™核和细胞质提取试剂(赛默飞世尔科学公司)提取。然后，在核提取物中分别加入抗ctcf抗体和对照兔IgG，在4℃孵育过夜。蛋白A/G +琼脂糖珠(Millipore)加入到每个IP反应中，在4˚C旋转2小时。通过3000克离心2分钟收集琼脂糖珠。用SDS样品加载缓冲液从固体载体中洗脱结合蛋白。利用抗ctcf和抗tet2一抗进行Western blot分析。

基因组DNA提取和亚硫酸氢盐测序

从CD4细胞中分离基因组DNA⁺T细胞与TIANamp基因组DNA试剂盒(天根，北京，中国)。亚硫酸氢盐转化使用EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, CA, USA)进行。通过PCR扩增AhR启动子区域的两个CpG岛。然后，将PCR产物亚克隆到pGEM-T载体(Promega, WI, USA)。对每个扩增片段分别测序8个独立克隆。所用引物如下:5 ' -GGTGGGGTTTTTAAGGAAGA-3 '(正向1)和5 ' -AAACTCCCCAACCACTACCTC-3 '(反向1);5 ' - ggtatttttttttttaaggggt -3 ' (forward2)和5 ' -TACAAATAAACTACCTAAACCTAAC-3 ' (reverse2);

统计分析

采用SPSS 22.0软件进行统计。具有正态分布的连续变量用均值±标准差表示;非正态分布变量报告为具有四分位范围的中位数。正态分布连续变量采用独立样本进行比较t测试。非正态分布变量比较采用Mann-Whitney法U测试。相关性分析采用斯皮尔曼相关系数。统计学意义定义为P< 0.05。

支持本文结论的数据集包含在本文中。在研究过程中使用和分析的所有其他数据集均可根据合理要求从通讯作者处获得。

不适用。

国家自然科学基金项目(No. 81974002)、中国科学院转化研究基金项目(No. 2021WWC02)资助。

作者指出

1. 曾聪和郑婷婷贡献相同

作者及隶属关系

1. 湖南长沙，中南大学湘雅医院血液科

   曾聪，程婷婷，马霞，刘毅，华娟，陈旭，王世玉，徐亚静

2. 国家老年疾病临床研究中心，湘雅医院，长沙，中国

   曾聪，程婷婷，马霞，刘毅，华娟，陈旭，王世玉，徐亚静

3. 湖南省血液肿瘤临床医学研究中心，长沙，中国

   曾聪，程婷婷，马霞，刘毅，华娟，陈旭，王世玉，徐亚静

4. 国家血液病临床研究中心，苏州大学第一附属医院，中国苏州

   Ya-jing徐

贡献

CZ、TTC和YJX参与了实验的设计和计划。XM, YL和JH提供了样品。CZ、TTC、XM、XC、YL、SYW进行了实验室实验工作。CZ、TTC、XM、JH、XC和YJX参与了研究结果的报道和手稿的撰写。所有作者都对手稿进行了严格的修改，并最终批准了要提交的版本。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Ya-jing徐．

相互竞争的利益

作者声明，这篇文章的发表不存在利益冲突。

出版商的注意

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