检测乳腺癌细胞系内和细胞间的异质性

背景

肿瘤细胞的细胞异质性是一个公认的现象。在许多研究中，无论是在同一类型的癌细胞内，还是在不同类型的癌症中，都观察到细胞间的遗传和表型变异。转移性肿瘤细胞的另一个已知事实是，它们往往比正常或非转移性肿瘤细胞更软。然而，肿瘤细胞力学性质的异质性并没有得到广泛的研究。

结果

在这里，我们用机器学习算法分析了三种不同乳腺肿瘤细胞系的单细胞光学拉伸数据，并表明在乳腺肿瘤细胞系内部和之间的细胞力学特性中也可以看到类似的异质性。我们在MDA-MB-231细胞中发现了两个簇，其中一个簇中的细胞比另一个簇中的细胞更柔软。此外，我们发现MDA-MB-231细胞和MDA-MB-436细胞都是来源于转移性癌症的间充质样表型的上皮性乳腺癌细胞系，它们之间在机械上的差异比与非恶性上皮性MCF-10A细胞更大。

结论

由于肿瘤细胞的硬度可以作为转移潜力的一个指标，这一结果表明，同一单克隆肿瘤细胞系的转移能力可能不同。

早在1958年(赫胥黎1958)，在肿瘤细胞中，遗传异质性是一个公认的现象，特别是在转移阶段(Torres等。2007；Park等人。2010；Patel等人。2014；Alizadeh等人。2015)．研究表明，来自单一癌症的细胞通常包含多个基因不同的亚群(Cleary et al。2014；米查姆和莫里森2013；Gay等人。2016；Marusyk和Polyak2010)．如此高水平的异质性是癌症难以治愈的原因之一(McGranahan和Swanton2017；Mann等人。2016；Koren和Bentires-Alj2015)．然而，迄今为止，肿瘤细胞异质性的原因和程度仍不清楚(Alizadeh等。2015)．两种主要理论被提出来解释肿瘤细胞异质性的起源:癌症干细胞的存在(Magee等。2012)和克隆进化(McGranahan和Swanton)2017)．这两种理论分别试图从生态学和进化的角度解释异质性，并且每一种理论都存在证据(Shackleton et al。2009)．此外，对基因调控网络的新见解为解释广泛的异质性而不需要过多的突变活动提供了一个框架(Huang2012年,一个；黄2013；黄2012 b)．基因表达的变化导致分子的变化，而分子的变化反过来又影响细胞的形状和功能。

另一个与肿瘤相关的公认现象是细胞硬度的变化。细胞积极构建和调节细胞骨架的不同元素，这是细胞刚性和顺应性的主要贡献者(Huber等。2013)．事实上，细胞骨架的不同成分有助于不同的结构和机械任务，例如，肌动蛋白有助于细胞在响应小应变时的弹性，而微管影响对大应变的响应(Lautenschlager et al.)。2009；Kubitschke等人。2017)．细胞的力学已经用多种实验工具进行了研究(Kubitschke等。2018；Pawlizak等人。2015)，包括原子力显微镜(AFM) (Hayashi和Iwata2015)，定量变形细胞术(q-DC) (Nyberg et al.;2017)、实时变形性细胞仪(Mietke et al.;2015；奥托等人。2015)、微流体光学电池拉伸器(Farzbod和Moon)2018)和流体动力流动拉伸器(Dudani et al.;2013；Gossett等人。2012)．由于转移是导致90%以上癌症死亡的原因(Wirtz et al。2011；Mehlen和Puisieux2006；Taketo2011)中，转移性肿瘤细胞的力学特性以及肿瘤细胞的力学特性是如何影响其转移能力的研究已经投入了大量的精力。许多研究发现，转移性肿瘤细胞比非转移性肿瘤细胞和正常细胞更柔软(Lekka et al。2012；Plodinec等人。2012；Swaminathan等人。2011)．此外，研究表明，利用机械性能作为转移的生物标志物的潜力(Xu et al。2012)和用于癌症诊断(Remmerbach et al。2009)．

在这篇论文中，我们迈出了第一步，将转移性肿瘤细胞的这两种表型-细胞异质性和细胞硬度的变化联系起来。虽然大多数细胞力学研究是在单细胞水平上进行的，但对数据的分析和解释通常局限于平均值，因此忽略了异质性作为转移性表型的重要方面。之前的工作(Plodinec等。2012；Kiessling等人。2013)产生了重要的提示，即力学特性实际上是异质的-细胞粘弹性特性的测量分布，即使在单个细胞系中，也不是高斯分布，这表明存在各种力学表型，例如，由通常长尾分布的异常值表示。

在本文中，我们使用微流体光学细胞拉伸器来测量和对比三个上皮细胞系MCF-10A、MDA-MB-231和MDA-MB-436的单细胞力学特性，并利用每个细胞系的细胞力学特性的异质性来对比不同的表型。这三种细胞系代表了一个公认的乳腺癌细胞组。MCF-10A是一种非致瘤性上皮细胞系，而MDA-MB-436和MDA-MB-231是具有间充质样转移表型的乳腺癌细胞系。通过单细胞数据分析，我们发现细胞硬度的异质性存在于细胞系内部和细胞系之间。我们特别观察到两组MDA-MB-231细胞。其中一组的细胞明显比另一组的细胞更柔软。此外，我们发现MDA-MB-231和MDA-MB-436虽然都是具有转移倾向的三阴性乳腺癌细胞系(即不表达雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体[HER]2)，但与非恶性细胞系MCF-10A相比，它们彼此有很大的不同。

我们使用微流体光学细胞拉伸器从我们的乳腺癌细胞系面板中机械拉伸单个细胞，并测量它们的硬度(Kiessling等。2013；林肯等人。2007年,一个)．处于悬浮状态的细胞不会受到环境的刺激，因此它们的皮层张力代表了细胞的机械“基态”。悬浮的单细胞被捕获1 s，随后拉伸2 s，然后在捕获条件下放松2 s(图。1)．以每秒30帧的速度拍摄细胞图像，并在每一帧中测量每个细胞的长轴长度。在本文中，我们只使用了从这些测量中计算出的两个力学特征:1。拉伸结束时相对长轴变形(deformation EOS);弛豫2 s后的相对长轴变形(弛豫EOE)1)．EOS值与杨氏模量成反比，EOS值越高，杨氏模量越低(更容易拉伸)。另一方面，EOE是衡量细胞恢复其形状的能力，EOE的绝对值越高，表明细胞恢复原始形状的能力越强。实验结束变形(EOE)也可以解释为在给定的施加载荷或应变下，细胞的可塑性程度。这种可塑性原则上是一种粗粒度的性质，其中包含了肌动蛋白、微管和中间纤维网络的贡献(Kubitschke等。2017)．由于EOE和EOS都是线性测量，观测到的变形的两倍变化对应着弹性模量的两倍变化。

在之前的工作中，机械测量参数化超过50个指标，我们确定变形和松弛是细胞力学的重要独立决定因素(Kiessling等。2013)．这两个特征结合在一起，可以很好地估计单个单元的弹性特性。

使用这种技术，我们测量了用于研究EMT的乳腺癌细胞面板中的细胞。MCF-10A是一种非致瘤性乳腺上皮细胞系，用作对照细胞系。MDA-MB-231和MDA-MB-436都是三阴性乳腺癌细胞系，本质上是上皮细胞。两者都有转移潜力，MDA-MB-231被认为比MDA-MB-436更具侵袭性(Bianchini等。2016)．

在MDA-MB-231细胞中观察到两个亚群

我们首先在MDA-MB-231细胞中发现了两个亚群。一个子组(簇2，图。2)在拉伸结束时(EOS)表现出更高的变形，在实验结束时(EOE)表现出更高的松弛绝对值(图1)。2)．EOS和EOE的绝对值都较高，表明簇2中的细胞比簇1中的细胞更柔软、更有弹性(更容易拉伸，更容易恢复原始形状)，而簇1与MDA-MB-436和MCF-10A细胞重叠(图2)。3.一个)。

在E-cadherin标记的MDA-MB-231细胞中不存在更有弹性的基团

钙粘蛋白负责细胞与细胞的结合。E-cadherins在正常上皮细胞中表达，而在间充质癌细胞中主要表达N-cadherins。在我们的实验中，我们还测量了用E-cadherin抗体标记的MDA-MB-231细胞的力学特性，以激活细胞外结合位点。由于这是间充质样细胞系，我们发现E-cadherin表达水平较低，这在其他地方也被量化(Pawlizak et al.)。2015)．尽管表达水平低，我们在E-cadherin标记和非标记的MDA-MB-231细胞中观察到不同的拉伸和松弛行为。E-cadherin标记的MDA-MB-231细胞只形成一个簇，而不是在未标记的MDA-MB-231细胞中观察到的两个簇。标记的231细胞与MDA-MB-231细胞的低弹性和低松弛性亚组重叠(簇1，图。3.b).通过结合抗体激活E-cadherin受体导致钙粘蛋白聚类和E-cadherin结合到肌动蛋白皮层，从而上调肌动蛋白聚合和细胞骨架的交联(Perez-Moreno和Fuchs2006)．与簇2细胞相比，簇1细胞中发现的变形减少与e -钙粘蛋白激活引起的力学变化一致，因为弹性存储模量强烈依赖于交联密度和动力学(Gardel等。2004；Lieleg等人。2010；Strehle等人。2011；Schnauß等。2016)．此外，簇1亚群的细胞松弛性降低也可以用肌动蛋白成核和聚集上调来解释，而微管细胞骨架骨架的不稳定可能进一步导致松弛性缺乏和可塑性增加(Kubitschke etal .)。2017)．

MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞之间的差异大于与MCF-10A细胞之间的差异

虽然我们在上面展示了MDA-MB-231细胞的簇1与MCF-10A和MDA-MB-436细胞有很大的重叠，但这三个细胞系在单细胞水平上仍然可以分离。由于MDA-MB-436和MDA-MB-231细胞系都具有恶性间充质样表型，因此与上皮样MCF-10A细胞系相比，预期它们彼此更相似是合理的。为了分离细胞表型，我们应用k近邻(k- nn)算法对三种表型进行成对分类。我们首先将细胞分为两组:训练组和测试组。表现型标签提供给了训练组的细胞，但没有提供给试验组。然后，给定单个细胞在测试组中的位置，k- nn识别出它在训练组中最近的k个邻居。然后k个邻居用他们的表型进行“投票”，来自测试组的细胞被分配到票数最高的表型。分类后计算敏感性(真阳性率)、特异性(真阴性率)和F1分数(分类结果的衡量指标，分数越高分类越好;每对分类F1的最高分数为1)。我们发现无论k值如何，MCF-10A和MDA-MB-436细胞之间的分类敏感性、特异性和F1评分最低(图中绿线)。4)．另一方面，MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞簇1之间的分类F1评分最高(图中蓝线)。4c) -这甚至高于MCF-10A和MDA-MB-231细胞之间的分类(图中红线)。4c)为k的大多数值。使用不同的分类算法(SVM)也得到了类似的结果，其中MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞之间的分类F1值也最高(表1)．SVM在分类上采取了不同的方法，它的目的是找到最好地将两组分开进行分类的线性平面。此外，当所有四种表型同时分类时，MDA-MB-436细胞被误分类为MDA-MB-231细胞的可能性小于MCF-10A细胞，反之亦然(图2)。5)．总之，这些结果表明MDA- mb -231簇1中的细胞与MDA- mb -436细胞的差异大于MCF- 10a细胞，尽管MDA细胞在表型上被认为是间充质样细胞，而MCF细胞是上皮细胞。

肿瘤细胞的力学特性可能是肿瘤转移潜力的重要标志。研究表明，转移性肿瘤细胞平均比非转移性肿瘤细胞更软(Xu et al。2012；Guck等人。2005；Fritsch等人。2010；Alibert等人。2017；Mierke2015)．在这篇文章中，我们说明了肿瘤细胞硬度的异质性在细胞系内和细胞系之间。仅基于力学性质，我们发现MDA-MB-231细胞内有两个不同的簇。簇1与MCF-10A和MDA-MB-436细胞有很大的重叠，而簇2的细胞更柔软、更有弹性(更容易变形和恢复原状)。此外，我们发现两种恶性上皮细胞系MDA-231和MDA-436在机械表型上比非致瘤性MCF-10A细胞系更明显。

我们发现MDA-MB-231细胞系内的力学异质性补充了先前的发现，表明MDA-MB-231细胞的分子单细胞特征也是异质性的。例如，已经证明MDA-MB-231细胞有两个不同的亚群，它们在各种细胞因子受体(CCR5, CXCR3, CXCR1)的细胞表面密度上存在显著差异(Norton等。2015)．特别是CXCR3在转移性肿瘤细胞中被发现过表达，靶向CXCR3的药物减少了肿瘤细胞的迁移(Zhu等。2015)．为了将我们观察到的力学异质性与分子异质性直接联系起来，未来的研究可以将光学拉伸与荧光成像结合起来。

我们还发现了不同三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系之间的异质性，即我们发现MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞彼此之间非常不同，甚至比非致瘤性MCF-10A细胞系之间的差异更大。这一发现与经典克隆进化模型的观点一致，假设所有女性正常乳腺组织的表观遗传和(更重要的)表型特征是相似的。因此，MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞株来源的患者最初的乳腺组织与MCF-10A组织非常相似。从这个健康的起始细胞群，可以采取不同的途径达到转移表型。事实上，基于癌症基因组图谱(TCGN)的广泛基因相似度分析显示，平均约。40%的特定部位的肿瘤，例如乳腺癌，在基因上可能更接近于来自其他部位的肿瘤，而不是同一起源的肿瘤(Heim et al.)。2014；Andor等人。2016)．实际上，两个完全不同的患者不太可能积累完全相同的癌细胞表型，具有相同的光学拉伸特征。

此外，我们的发现可能具有重要的临床意义。三阴性乳腺癌患者目前被认为预后很差(Bianchini等。2016；莱曼和皮滕波尔2014；Denkert等人。2017)．然而，有一种新兴的趋势是将TNBC视为预后不同的异质患者群体(Bianchini等。2016；莱曼和皮滕波尔2014；Denkert等人。2017)．此外，tnbc可能具有非常不同的分子特征，这可能使某些肿瘤更适合靶向治疗(Bianchini等。2016；莱曼和皮滕波尔2014；Denkert等人。2017)．确定这些病人的身份对临床至关重要。目前的数据令人兴奋，因为它表明两种TNBC细胞系(在临床上将它们放入一个预后篮子中)确实非常不同。光学拉伸分析是否可以用于区分预后较好的TNBC病例(即复发率和远处转移率较低)和预后较差的TNBC病例，这是一个有趣的猜测。

此外，我们在细胞系间异质性方面的发现表明，基于平均的分析方法可能会过度简化肿瘤细胞数据。例如，MCF-10A、MDA-MB-436和MDA-MB-231细胞的cluster 1在力学上是相似的，但在平均值上可能有微小的差异(图2)。3.a).但是，当使用k-NN等更复杂的算法进行分类时，可以获得相当好的分类精度。也就是说，尽管三个细胞系的细胞平均重叠，但在局部，来自某一细胞系的细胞比来自其他细胞系的细胞更接近同一细胞系的细胞。

最后，我们对E-cadherin标记的MDA-MB-231细胞的研究表明，抗体标记可以显著改变机械表型。我们认为这是因为抗体与e -钙粘蛋白受体的结合模拟细胞-细胞结合，导致钙粘蛋白聚集并刺激与钙粘蛋白结合的肌动蛋白皮层。这是一个很好的例子，说明了抗体标记如何改变细胞的特性，以及抗体如何提供对癌细胞行为变化的见解，以响应它们的肿瘤微环境。需要进一步的实验来验证和提供E-cadherin抗体治疗在改变MDA-MB-231细胞机械表型中的作用的分子证据。

总之，我们阐明了细胞系内和细胞系间细胞力学特性的异质性。未来的研究应探讨趋化因子受体表达的变化与肿瘤细胞硬度的相关性。需要进一步的研究来确定癌细胞的机械特性如何有助于确定三阴性乳腺癌患者的不同预后亚群。

实验程序

光学拉伸器(OS)的一般设置描述在(Lincoln等。2007 b)，并对微流体、计算机̵控制的拉伸过程和热控制阶段进行了进一步改进(Lincoln et al。2007 b；Guck等人。2001；施密特等人。2015)．通过将细胞悬浮液引导到自动微流体操作系统中，单个细胞连续被捕获和拉伸，确定了细胞的机械性能。细胞被困在100兆瓦1秒和细胞半径沿激光轴被确定。然后将电池在875 mW的电压下拉伸2 s。在压力停止后，允许细胞放松2 s。在整个拉伸过程中，安装在显微镜上的相机以每秒30帧的速度拍摄图像。然后，利用边缘检测算法提取细胞形状和细胞参数，对病理细胞(如死亡细胞)进行分类。

细胞培养及培养基

MCF-10A细胞(猫。CRL-10317, ATCC)在含有l-谷氨酰胺(Cat.No.;FG 4815, Biochrom)，添加5%马血清(猫号)。人表皮生长因子(Cat.No. 12449C, SAFC)， 20ng /ml;E9644, Sigma-Aldrich)， 10 μg/ml胰岛素(Cat;不。I9278, Sigma-Aldrich)， 100 ng/ml霍乱毒素(猫号;C8052, Sigma-Aldrich)， 500 ng/ml氢化可的松(Cat.No.;H0888, Sigma-Aldrich)和100u /ml盘尼西林/链霉素(Cat.No.;A 2213, Biochrom)。

MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞在含4.5 g/l葡萄糖、l-谷氨酰胺的DMEM中培养。FG 0435, Biochrom)补充10%胎牛血清(Cat.No.;S 0615, Biochrom)和100 U/ml青霉素/链霉素。

所有细胞系在37°C的95%空气和5% CO2气氛中孵育。每2 ~ 3天更换一次培养基，每4 ~ 5天传代一次细胞。为了分离细胞，使用含有0.025%(w/v)胰蛋白酶和0.011%(w/v) EDTA (Cat.No. 11)的PBS溶液。L 2113, Biochrom)应用几分钟。

数据分析

两簇MDA-MB-231细胞用kmeans()函数R(3.0.3版本)，2个中心，1000次迭代，50个随机初始条件。对于kNN分类，首先从每个细胞系中随机选择1200个细胞。从这1200个细胞中，随机选取200个作为测试集，其余1000个作为每个细胞系的训练集。对每对细胞系分别进行分类然而,()函数在R中有8个不同的值k(2,3,5,7,10,15,20,50)。同样，同时对三种细胞系进行分类。分类后，计算假阳性率为FPR =(假阳性)/(假阳性+真阳性)，计算假阳性率为(FNR) =(假阴性)/(假阴性+真阴性)。最后，基于所有随机选择的1200个细胞，使用支持向量机(SVM)进行分类ksvm()函数具有线性核和C= 10R包kernlab．所有的图都是用ggplot2包制作的R．在上述分析之前，数据集被归一化为零均值和单位方差。

资料可按要求提供。

EOE:

实验结束变形

EOS:

拉伸变形结束

FNR:

假阴性率

玻璃钢:

假阳性率

资讯:

K个最近邻

操作系统:

光学担架

支持向量机:

支持向量机

TCGN:

癌症基因组图谱

TNBC:

三阴性乳腺癌

不适用

该项目已获得欧洲研究委员会(ERC-741350/HoldCancerBack)的资助，我们感谢欧盟委员会H2020-PHC-2015-two-stage在“FORCE”项目框架内的资助。W.L.部分由AFOSR基金FA9550-16-1-0052资助。Y.S.得到了美国国立卫生研究院、国家眼科研究所的内部研究项目的支持。E.M.得到了欧盟和萨克森州Europäischer Sozialfonds (ESF - 100234741)的支持。

作者及隶属关系

1. 马里兰大学物理科学与技术研究所，马里兰大学帕克分校，20742，美国

   沈杨，塞巴斯蒂安·施密特，沃尔夫冈·洛塞特

2. 莱比锡大学彼得·德拜软物质物理研究所，Linnéstr。504103，莱比锡，德国

   汉斯·库比施克，埃里克·w·莫拉韦茨，约瑟夫·A. Käs

3. 莱比锡大学医学中心妇产科，德国莱比锡Liebigstr. 20a, 04103

   本杰明狼

贡献

YS分析数据并撰写稿件，BUSS和BW协助解读数据并编辑稿件，HK和EWM进行实验并编辑稿件，WL和JAK监督项目并编辑稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到沃尔夫冈Losert．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

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