血浆代谢组学和蛋白质组学的综合分析揭示了乳腺癌的代谢景观

背景

乳腺癌(BC)是最常见的癌症。目前，乳腺x线摄影和乳腺超声检查是临床筛查BC的主要方法。我们的研究旨在揭示BC患者的特定代谢特征，并探索人类血浆中的特定代谢特征，以用于BC的诊断。

方法

本研究招募了216名参与者，包括BC患者、良性患者和健康对照(HC)，分为两个队列，一个训练队列和一个测试队列。从每位参与者身上收集血浆样本，并进行非靶向代谢组学和蛋白质组学检测。通过机器学习识别BC诊断的代谢特征。

结果

代谢组学分析显示，与HC个体相比，BC患者的代谢谱发生了显著变化。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸途径、谷氨酰胺和谷氨酸代谢途径和精氨酸生物合成途径是BC的关键生物代谢途径。蛋白质组学鉴定出29个上调蛋白和2个下调蛋白。我们的综合分析发现，天冬氨酸转氨酶(GOT1)l-乳酸脱氢酶B链(LDHB)、谷胱甘肽合成酶(GSS)和谷胱甘肽过氧化物酶3 (GPX3)密切参与这些代谢途径。支持向量机(SVM)建立了包含47种代谢物的预测模型，该模型对BC的预测准确率较高(AUC = 1)。此外，该代谢物面板在BC vs HC (AUC = 0.794)、良性vs HC (AUC = 0.879)的检测队列中也显示出较高的预测能力。

结论

这项研究揭示了乳腺癌患者代谢和蛋白质组学特征的特定变化，并确定了47种血浆代谢物，包括鞘磷脂、谷氨酸和半胱氨酸，可能是乳腺癌的潜在诊断生物标志物。

乳腺癌是世界范围内严重威胁女性健康的第一大恶性肿瘤。据最新统计，女性BC已经超过肺癌成为最常见的癌症，预计到2020年将有230万例(11.7%)新发病例[1]．在中国，BC也是女性中最常见的恶性肿瘤，2015年报告的新发BC病例约为30.4万例(17.1%)[2]．近年来，随着社会的发展，20 ~ 40岁的年轻BC患者显著增加，且BC发病呈低龄化趋势。在新诊断的BC病例中，约有3%至10%的患者伴有远处转移。大约30%的早期患者可发展为晚期BC [3.]．发现BC的预后与疾病的发展阶段密切相关。具体而言，BC患者的总体5年生存率为89.9%，其中原位癌的5年生存率接近100%，早期浸润性癌的5年生存率为85.5%，而远处转移的5年生存率仅为25% [4]．因此，提高BC的早期诊断率并给予及时有效的治疗对提高BC患者的生存率至关重要。

许多因素与BC的发生密切相关，包括年龄、家族史、生殖因素、雌激素、生活方式等。此外，乳腺癌相关基因1和2 (BRCA1/2)、人表皮生长因子受体2 (HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)等基因的突变和异常扩增在BC的发生发展中也起着重要作用[5，6]．目前BC的发病机制尚未完全阐明。除遗传因素外，环境因素也参与了该病的发生和发展。lsamuyer等人发现高水平的葡萄糖、肌酐、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和缬氨酸与BC的高风险密切相关[7]．另一项研究报告说，谷氨酰胺/异谷氨酰胺、缬氨酸/正缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、γ-谷氨酰苏氨酸、5-氨基戊酸或5-氨基戊酸的水平较高与BC的风险增加有关[8]．这些发现表明代谢物可能在BC的发生和发展中起重要作用。目前，指南建议使用影像学检查筛查BC，包括乳房x光检查、乳腺超声检查和乳腺MRI检查。然而，这些方法的灵敏度不高;因此，通常需要通过乳腺组织活检进行额外的检查，以获得更准确的诊断[9，10]．血清肿瘤标志物(TM)已被广泛用于临床筛查BC，如癌胚抗原(CEA)和碳水化合物抗原15-3 (CA15-3) [qh]11]．然而，这两种TMs的敏感性和特异性都较差。因此，确定更敏感的生物标志物以及了解这些生物标志物促进BC发生和发展的机制至关重要。一个答案在于使用代谢组学技术。代谢组学对生物体中所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化之间的相对关系[12]．与基因组学和蛋白质组学不同，代谢组学的重点是基因和蛋白质的下游产物，可以更准确地识别已经发生的与疾病相关的变化，而不是预测[13]．

目前，代谢组学技术已成功用于鉴定肺癌等多种肿瘤中的生物标志物[14]、胰导管腺癌[15]、前列腺癌[16]、膀胱癌[17]和乳癌[18]．许多代谢组学研究都集中在BC上。这些研究根据基于人血清、组织或尿液的代谢组学分析，发现了诊断和预测BC治疗反应的特异性生物标志物[19，20.，21]．然而，一些研究只报告了一个小样本量，而另一些研究的结果则不一致。据我们所知，没有研究系统地探讨了BC中关键代谢变化的可能机制。因此，我们在此评估了BC患者和健康个体的血浆代谢组学，以确定代谢物和代谢途径中与癌症相关的变化。并通过机器学习识别出特定的代谢物特征，可用于BC早期诊断。

研究设计和参与者登记

如图5所示1从浙江大学医学院邵逸夫医院招募了两组参与者，对BC患者进行血浆代谢组学和蛋白质组学研究，包括一个培训组和一个测试组。首先，我们测量了两个队列的代谢物谱。其次，从训练队列中随机抽取9例BC患者和9例HC个体进行蛋白质组学分析。然后，我们对代谢组学和蛋白质组学数据进行了综合分析。最后，我们使用训练队列中的差异代谢物来训练机器学习模型，并在测试队列中进行后续测试。

培训队列包括2018年1月至2018年12月招募的75名BC患者，30名良性患者和20名健康对照(HC)。该测试队列包括从2019年10月至2020年6月招募的32名BC患者，30名良性患者和29名HC患者。收集研究对象的年龄、性别、体质指数(BMI)、月经史、家族史等人口学和临床资料。对于BC患者，还收集了特殊的临床病理特征，包括分子水平上的肿瘤类型、肿瘤分期、CA15-3、CEA。然后，在训练队列中，对随机选择的9名BC患者和9名HC个体进行tmt标记的定量蛋白质组学分析。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的。所有参与者都对我们的研究非常熟悉，并提供了一份签署的知情同意书。本研究方案经浙江大学医学院邵逸夫医院伦理委员会批准(20180601-006)。纳入标准要求BC患者(1)年龄在18 - 79岁之间，(2)经组织病理学证实为BC并无其他恶性肿瘤。此外，(3)BC患者在入组前不应接受过手术、化疗或放疗。 The inclusion criteria for HC participants required that they (1) be 18 to 79 years old and (2) have no history of tumor or other breast diseases. Other criteria excluded any participant with (1) systemic chronic disease, such as cardiovascular diseases, hypertension, and diabetes; (2) metabolism-related disease, such as phenylketonuria and hepatic encephalopathy; (3) mental illness; and (4) females in menstruation, pregnancy, or lactation.

血浆收集和保存

所有参与者在禁食过夜(8 - 14小时)后的早晨收集血浆样本。使用EDTA抗凝管采集血样，室温下静置30分钟，然后在3000 rpm下离心10分钟。收集上清(血浆)于1.5ml冷冻管中，保存在- 80°C以待进一步分析。

血浆代谢组学样品的制备

样品使用Hamilton公司的自动化MicroLab STAR®系统制备。为了质量控制(QC)的目的，在萃取过程的第一步之前添加了几个回收标准。为了去除蛋白质，将与蛋白质结合的小分子或被困在沉淀的蛋白质基质中的小分子解离，并回收化学上不同的代谢物。用甲醇在剧烈摇动下沉淀蛋白质2分钟(Glen Mills GenoGrinder 2000, USA)，然后离心。将样品短暂放置在TurboVap®(Zymark)上以去除有机溶剂。样品提取物在准备分析前在氮气下储存过夜。每个血浆样品的小份额被汇集成QC样品，然后在整个平台运行过程中定期注入。

超高效液相色谱-串联质谱分析(UPLC-MS/MS)

代谢组学由Metabolon Inc.(编号:09- 19vw) (Durham, NC, USA)使用Waters ACQUITY超高效液相色谱(UPLC)和Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率质谱仪进行，该质谱仪与加热电喷雾电离(HESI-II)源和Orbitrap质谱仪连接。发现队列中的所有样本都在同一批次中检测到，测试队列中的所有样本也在同一批次中检测到。提取液干燥并在与每种方法相容的溶剂中重组。在酸性条件下，用带正电荷的离子电喷雾电离法分析亲水化合物。具体来说，提取液在C18柱(Waters UPLC BEH C18-2.1×100 mm, 1.7 μm)上进行梯度洗脱，使用含有0.05%全氟戊酸(PFPeA)和0.1%甲酸(FA)的水和甲醇。如前所述，在较高的有机含量下，使用甲醇、乙腈、水、0.05% PFPeA和0.01% FA，在相同的C18色谱柱的酸性条件下，使用带正电荷的离子电喷雾电离分析疏水化合物。碱性提取液在碱性负离子条件下进行分析，提取液在专用C18柱上用甲醇、水和6.5mM碳酸氢铵在pH 8下梯度洗脱。然后，在亲水性相互作用液相色谱(HILIC)柱(Waters UPLC BEH Amide 2.1×150 mm, 1.7 μm)洗脱后，使用负电离进行萃取物梯度洗脱，梯度由水和乙腈与10 mm甲酸铵组成，pH为10.8。MS分析在MS和依赖于数据的MSn扫描之间交替使用动态排除。扫描范围在不同的方法之间略有不同，但覆盖了70 - 1000m /z。

代谢组学分析

通过Metabolon的硬件和软件进行原始数据提取、峰识别和QC处理。通过与纯化标准品库条目或反复出现的未知实体进行比较来鉴定化合物。文库中包含所有分子的保留时间/指数(RI)、质荷比(m/z)和色谱数据，包括质谱/质谱数据。生化鉴定基于其他三个标准，即:(1)在提议鉴定的窄RI窗口内的保留指数，(2)与库的精确质量匹配±10 ppm，以及(3)实验数据与真实标准之间的MS/MS正向和反向得分。进行了各种管理程序，以确保为统计分析和数据解释提供高质量的数据集。

用曲线下面积对峰进行量化，缺失值用lod(变量最小正值的1/5)代替。然后使用MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/)，归一化的参数为“归一化求和”，数据缩放的参数为“自动缩放(以均值为中心，除以每个变量的标准差)”。在单变量分析阶段，计算每种代谢物的折叠变化阈值(FC)，并计算Student 'st曼-惠特尼测试U采用试验测定各组间代谢物的差异。在多变量分析阶段，采用正交投影到潜在结构判别分析(OPLS-DA)，根据投影中变量重要度选择重要代谢物(VIP > 1.0)。根据以下标准认为代谢物发生了显著改变:FC > 1.2或< 5/6,VIP >1，并且P< 0.05。符合这些标准的代谢物进行KEGG途径分析，以寻找与BC密切相关的特定代谢途径。

用于蛋白质组学的血浆样品制备

蛋白组学实验前，血浆样品在15000 g下离心15 min，上清用0.22 μ m过滤器过滤。采用免疫亲和层析法(IAC)去除前14个高丰度蛋白(白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、转铁蛋白、触珠蛋白、纤维蛋白原、α 2-巨球蛋白、α 1-酸性糖蛋白、IgM、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、补体C3和转甲状腺素)。然后，低丰度蛋白进行还原、烷基化和特异性胰蛋白酶裂解。消化的肽经过10层tmt标记，然后冷冻干燥成粉末状。冻干后的样品用0.1%三氟乙酸(TFA)重组，用0.22 μ m过滤器过滤。过滤后的样品进行高ph反相高效液相色谱分离，并收集色谱分离组分。流动相A为5% NH_3.H₂H O + 95%₂流动相B为乙腈+5% NH_3.H₂H O + 5%₂O.共使用25个组分进行纳米lc -MS/MS分析。

Nano-LC-MS / MS分析

采用Q Exactive HF-X高分辨率质谱联用Easy nLC-1200液相色谱系统对高ph RP-HPLC获得的25个色谱组分进行分析。流动相a为0.1%甲酸水溶液，流动相b为0.1%甲酸乙腈水溶液(80%乙腈+ 20%水)。色谱柱由富集柱和分析柱组成，用100%流动相a进行平衡。样品通过自动进样器上样到富集柱(100μm_ID×4cmL, C18, 3μm, 100A)，用分析柱(75 μm_ID×25cmL, C18, 3μm, 100A)分离。然后用Q Exactive HF-X质谱仪进行质谱分析。检测方式为正离子和母离子扫描范围350-1800 M/Z, 200 M/Z时主质谱分辨率12万，AGC(自动增益控制)目标设置为3×10⁶离子，最大注射时间为50ms，动态排除时间为40s。采用数据依赖获取(data-dependent acquisition, DDA)方法收集肽和肽片段的质量电荷比，每次全扫描(全扫描，主质谱)后获得20个二级谱(MS/MS, MS2扫描)。

蛋白质组学数据分析

获得的光谱与完整的蛋白质组集进行比对智人从SwissProt(发布版本2020_05)。数据库搜索参数设置为:允许胰蛋白酶酶切的两个缺失切割位点的最大值，10-ppm前体质量耐受性，0.02 Da片段质量耐受性，半胱氨酸氨基甲酰化(CAM)修饰(+57.021 Da)为静态修饰，甲硫氨酸氧化修饰(+15.995 Da)为动态修饰。使用Proteome Discoverer 2.4版(ThermoFisher Scientific)对LC-MS/MS数据进行处理和分析。所有搜索都被过滤到<1%的错误发现率(FDR)。

将tmt标记肽峰强度归一化，按1.25倍变化筛选BC/HC > 1.25的上调蛋白和BC/HC < 0.80的下调蛋白。将实验中鉴定和定量的蛋白质与标准数据库中的整套蛋白质进行比对，然后进行基因本体(Gene Ontology, GO)分析。然后，利用String (https://string-db.org/)，使用版本:3.2.1的Cytoscape生成并分析相互作用网络。

代谢组学和蛋白质组学的整合

首先，使用BC组和HC组之间显著不同的代谢物和蛋白质进行代谢组学和蛋白质组学之间的相关性分析。然后，使用MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/）.

预测乳腺癌的机器学习

对于BC与非BC(良性+ HC)，首先根据以下标准选择重要代谢物:PVIP > 0.5, AUC > 0.6。然后，我们通过R软件包“glmnet”和“Boruta”进行Lasso回归10倍交叉验证和随机森林，选择潜在代谢物用于训练疾病预测模型。在此基础上，利用R软件包“e1071”和“randomForest”分别应用支持向量机(SVM)和随机森林(RF)模型，并利用R软件包中的“pROC”计算受试者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)。然后，将SVM模型应用于检测队列，计算AUC，评价模型的诊断效果。

统计分析

所有统计分析采用SPSS 26.0 (statistical Product and Service Solutions, IBM, USA)和R 3.5.2 (R Foundation for statistical Computing, Austria)进行。数值变量数据以均数±标准差(mean±SD)表示。数值变量之间的比较使用Student 's进行t测试,Mann-WhitneyU检验或单因素方差分析。分类变量间比较采用卡方检验。不同变量间的相关分析采用Spearman秩相关分析。P< 0.05为差异有统计学意义，原P采用FDR (Benjamin-Hochberg)校正多项检验值。

参与者的人口统计学特征

本文对血浆样本进行代谢组学和蛋白质组学分析，以研究BC、良性和HC个体之间代谢物和蛋白质的差异，并确定BC患者的诊断标志物。在训练队列中，共有75名BC患者(均为女性)，30名良性患者(均为女性)和20名HC患者(均为女性)进行代谢组学分析。BC患者比良性患者和HC患者年龄大(52.03±10.62 vs．43.60±11.93 vs．分别为44.68±13.20;P= 0.001)。绝经后妇女在BC组、良性组和HC组中无显著差异(分别为40%、26.7%、35%)。P> 0.05)。然后从训练队列中随机抽取9例BC患者和9例HC个体进行蛋白质组学分析。在测试队列中，分析了32例BC患者(均为女性)，30例良性患者(均为女性)和29例HC患者(均为女性)。在该队列中，BC患者也比其他两组的参与者年龄大(53.81±11.15 vs．39.60±11.67 vs．分别为37.97±8.60;P< 0.001)，绝经后妇女的比例也高于良性组(37.5 vs．10%,分别P< 0.001)。BC肿瘤标志物CEA、CA15-3 CEA > 5ng/ml、CA15-3 > 25 U/ml均为BC阳性。根据CA15-3和CEA, BC组的BC阳性率高于良性组和HC组(分别为18.8%和6.3%)。在训练组和测试组中，三组之间的BMI均无显著差异。训练和测试队列的详细人口学和临床特征见表1及补充表1．

血浆代谢谱

为了评估BC的特定代谢谱，我们在训练队列中基于UPLC-MS/MS对配对血浆样本进行了非靶向代谢组学分析，最终确定并量化了三组的917种代谢物(图2)。1A).剔除缺失值超过20%的代谢物后，进一步分析750个代谢物。然后，在对原始数据进行归一化并使用lod分配缺失值后，我们首先计算FC和P每个两两比较(BC vs. HC，良性vs. HC，以及BC vs.良性)中每种代谢物的值。接下来，我们在BC、良性和HC中应用两两比较的火山图来显示代谢物的表达。BC与HC对比(图2)1B)， BC中最丰富的代谢物主要包括初级胆汁酸代谢化合物(牛磺胆酸、牛磺胆酸脱氧胆酸、糖胆酸、尿囊素);次级胆汁酸代谢化合物(牛磺酸去氧胆酸盐、糖去氧胆酸盐、熊去氧胆酸盐);果糖、甘露糖和半乳糖代谢化合物(甘露糖和果糖);酪氨酸代谢化合物(o -硫酸酪胺，N-甲酰基苯丙氨酸，多巴胺4-硫酸盐);和甘油脂代谢化合物(甘油和甘油3-磷酸)。HC组脂肪酸代谢(酰基肉碱)化合物(油基肉碱(C18:1)和二十二碳五烯基肉碱(C22:5n3))水平较高;谷胱甘肽代谢化合物(半胱氨酸甘氨酸、半胱氨酸甘氨酸、氧化半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物);糖酵解、糖异生和丙酮酸代谢化合物(丙酮酸和乳酸);和柠檬酸循环(TCA循环)途径代谢化合物(富马酸、苹果酸、琥珀酸)，以及尿素循环、精氨酸和脯氨酸代谢化合物(N-甲基脯氨酸和鸟氨酸)。良性vs .良性．HC(无花果。1C)，良性患者最丰富的代谢物包括脂肪酸、酰胺代谢化合物(油酰胺、palitamide(16:0)、亚油酰胺(18:2 . 6)、棕榈烯酰胺(16:1));初级胆汁酸代谢化合物(胆酸盐、胆酸脱氧胆酸盐);次级胆汁酸代谢化合物(牛磺酸去氧胆酸盐、糖去氧胆酸盐);脂肪酸、二羧酸代谢化合物(2-羟基癸二酸酯、十八烯二烯二酸酯(C18:2-DC))。HC中较高水平的代谢物与上述相似。然而，BC与良性之间没有明显差异(补充图5)2一个)。

然后进行OPLS-DA评价组间分离度，同时两两比较中鉴定对分类和区分有重要意义的代谢物，并进行100次排列检验验证模型。结果显示BC组和HC组之间存在明显的分离(PC1 = 9.1%， PC2 = 13.8%)。1D)，与良性和HC组相似(PC1 = 14.1%， PC2 = 12%)(图2)。1E).两种模型的解释能力(R₂)和预测能力(问₂） (R₂Y= 0.960,P< 0.01和问₂= 0.892,P< 0.01;R₂Y= 0.966,P< 0.01和问₂= 0.93,P< 0.01)。然而，BC组和良性组并没有完全分开问₂和R₂结果也很糟糕(R₂Y= 0.537,P =0.83和问₂= 0.0344,P< 0.01)2B).上述结果表明BC和HC之间以及良性和HC之间的代谢谱存在差异。结果还表明，BC和良性可以通过特定的代谢物特征与HC区分开来。然而，目前的研究结果并不能证明代谢物可以区分BC和良性。因此，我们进一步分析了BC和HC之间的代谢谱。根据OPLS-DA模型，我们鉴定出194种重要代谢物(VIP > 1)。在前25种代谢物中，丙酮酸、半胱氨酸甘氨酸、5-氧脯氨酸、尿嘧啶、N-氨甲基天冬氨酸、AMP、天冬氨酸、磷酸盐等在HC中增加。而5-甲基硫代腺苷(MTA)和2 ' - o -甲基胞苷的水平在BC参与者中增加(图2)。2A) FC, VIP，和P各代谢物的BC值与．HC比较见补充表2．

BC和HC组之间的代谢物差异和途径

根据VIP >1、FC >1.2或<5/6，共鉴定出187个显著代谢物P< 0.05。其中17种代谢物为外源代谢物，2种代谢物属于部分表征分子。对其余168种代谢物进行进一步分析(补充表)3.）.然后，我们基于168种代谢物进行了途径和富集分析。根据富集分析结果(图1)。2B)，这些显著代谢物主要集中在46条代谢途径中，包括谷氨酰胺和谷氨酸代谢途径(5条);精氨酸生物合成途径(7 hits);丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径(9击);泛酸和辅酶a生物合成途径(4命中);柠檬酸循环(TCA循环)途径(4命中);嘧啶代谢途径(6个hit)。在途径分析中，我们生成了气泡图来识别与BC密切相关的特定代谢途径。根据-log10(P)值和通路影响评分两个指标，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;谷氨酰胺和谷氨酸代谢;精氨酸生物合成;柠檬酸循环(TCA循环);和嘧啶代谢是最重要的代谢途径(图2)。2C).分层聚类(HCA)分析表明，168种差异表达的代谢物可以明显区分BC和HC。其中，71种代谢物在BC患者中较高，而其余97种代谢物在HC患者中呈相反的模式较高(图2)。3.）.

蛋白质组学和代谢组学的综合分析

为了了解与BC发病和进展相关的特定蛋白质组学变化，我们进行了全球范围的血浆蛋白质组学分析。对于BC组和HC组，从训练队列中随机抽取9份血浆样本。然后将9份HC血浆样品混合到一个上样中。共鉴定出1538个基因编码的2103个蛋白，其中定量鉴定出1407个基因编码的1934个蛋白。根据1.25倍(FC > 1.25或< 0.8)、独特肽≥2、肽谱匹配≥5的标准，BC组共观察到29个上调蛋白和2个下调蛋白，可作为进一步评价和验证实验的潜在生物标志物(补充表)4）.基因本体(GO)分析表明，这些差异蛋白具有许多重要的生物学功能，包括血小板脱粒、肌丝滑动和肌动蛋白-肌球蛋白丝滑动。蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)分析显示，这些蛋白密切相关，最密切相关的是转甲状腺素(TTR)、羧肽酶B2 (CBP2)和维生素d结合蛋白(GC)(补充图5)3.一个)。

接下来，我们进行了一项综合分析，以评估BC患者的代谢物和蛋白质之间的联系。我们首先分析了差异代谢物与蛋白质表达之间的相关性。根据与蛋白质的相关值，将差异代谢物分为四类。上面的2簇代谢物与这些蛋白质呈负相关，而下面的2簇代谢物与这些蛋白质呈正相关(补充图5)3.B).具体来说，果糖、甘露糖和半乳糖代谢途径化合物(果糖和甘露糖)的水平;血红蛋白和卟啉代谢途径化合物(胆红素和胆绿素);亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸代谢途径化合物(异丁基甘氨酸)与这些差异蛋白呈负相关。而谷氨酸代谢途径化合物(谷氨酸和焦氨酰胺)的水平;谷胱甘肽代谢途径化合物(5−氧脯氨酸和半胱氨酸甘氨酸);糖酵解、糖异生和丙酮酸代谢途径化合物(乳酸和丙酮酸);以及蛋氨酸、半胱氨酸、SAM和牛磺酸代谢途径化合物(牛磺酸和半胱氨酸)与这些蛋白呈正相关(图2)。4）.然后，我们将代谢组学和蛋白质组学数据中的顶级生物标志物整合到联合途径分析中(图2)。5A).这导致确定了几个密切参与BC病理生理过程的重要途径，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;精氨酸生物合成;精氨酸和脯氨酸代谢;糖酵解或糖异生;半胱氨酸和蛋氨酸代谢;以及谷胱甘肽代谢。这些代谢途径含有13种关键代谢物(5-甲基硫代腺苷(MTA)、谷氨酰胺、葡萄糖、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸甘氨酸、琥珀酸、谷氨酸、α -酮戊二酸、丙酮酸、乳酸、N-乙酰天冬氨酸(NAA)、半胱氨酸)和4种重要蛋白(天冬氨酸转氨酶(GOT1)、l-乳酸脱氢酶B链(LDHB)、谷胱甘肽合成酶(GSS)和谷胱甘肽过氧化物酶3 (GPX3))(图3)5B)。

血浆代谢特征在乳腺癌诊断中的鉴定

为了识别可用于BC早期诊断的代谢物，采用了机器学习算法，即随机森林(RF)和支持向量机(SVM)模型。对于临床应用，乳腺癌筛查的主要目标是从人群中识别乳腺癌患者。为此，我们首先根据以下标准选择BC和非BC(良性+ HC)组之间的重要代谢物:PVIP > 0.5, AUC > 0.6。结果鉴定出428种代谢物。然后，我们进行Lasso回归10倍交叉验证和随机森林进一步筛选代谢物生物标志物。Lasso回归鉴定出13种代谢物(补充图5)4)，随机森林鉴定出46种代谢物。通过对13种代谢物和46种代谢物的梳理，最终筛选出47种代谢物(补充表)5）.基于47种选定代谢物的途径分析表明，最重要的代谢途径是谷氨酰胺和谷氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成和柠檬酸循环(TCA循环)(补充图5)5)，这与上述差异代谢物参与途径一致。这强调了这些代谢途径可能在乳腺癌的发病机制中起着关键作用。为了验证鉴定出的47种代谢物在预测BC中的价值，我们使用这47种代谢物来训练RF和SVM模型。

两个RF(补充图5)6A)和支持向量机(图。6A)模型对训练队列BC的预测非常准确(AUC分别为0.998和1)。除了训练队列外，我们还在内部测试队列中测量了代谢物的表达。将从训练队列中训练出来的SVM模型应用到测试队列中，进一步评价模型的性能，我们发现BC和非BC之间有很好的预测能力(AUC = 0.610) (Supplementary Fig. S .)6B).除了该模型在区分BC和非BC方面表现良好外，我们还进一步评估了测试队列中不同亚组的表现。BC与HC的AUC为0.794(图2)。6B)，良性与HC的AUC为0.879(图2)。6C)。两者均高于BC的两种常用肿瘤标志物CA15-3和CEA (AUC分别= 0.722和0.757)。6但BC与良性的AUC较低(补充图5)6这些结果表明，由47种代谢物训练的SVM模型可以有效区分BC和HC个体。

早期发现、诊断和干预BC具有挑战性，但也至关重要[22]．目前，最常用的BC筛查方法包括乳房x光检查和乳腺超声检查[9]．然而，几乎所有在上述检查中发现的乳腺结节通常都需要进一步的乳腺活检来确定结节的性质。这就需要开发无创、可靠的血浆生物标志物，用于建立具有成本效益的常规临床筛查检测，从而大大改善BC的管理。

BC是高度异质性的，这种异质性很难通过常规组织病理学检查显示[23]．然而，癌细胞往往表现出明显的细胞代谢变化，这种变化显示出致瘤性和恶性的生化基础[24]．在科技进步和社会发展的推动下，代谢组学已广泛应用于临床，以帮助诊断疾病[25]．代谢组学是一门新的学科，涉及在给定的生理时期对给定生物体或细胞中的所有代谢物同时进行定性和定量分析[26]．与基因组学和蛋白质组学不同，代谢组学主要反映细胞代谢过程的最终产物，它在基因组和蛋白质组学之外，代表了生命运动的最下游阶段[13]．这些代谢物的水平可以被认为是生物体对遗传或环境变化的最终反应，从而成为疾病表型的准确反映[12]．因此，代谢组学已成为疾病生物标志物鉴定的关键工具，也是发现生物过程驱动因素的技术。在这里，我们应用这种方法来探索在BC诊断中特定使用的特定代谢特征。

在这项研究中，我们对来自两个队列的216例HC、良性和BC受试者的血浆进行了代谢组学分析。在训练队列中，代谢组学分析鉴定并量化了917种代谢物。BC和HC之间以及良性和HC之间可以观察到明显的分离，表明每种情况都存在特定的代谢谱。然而，BC与良性肿瘤之间的距离较窄。以前也有类似的分组分离的报道[27]．对于BC与HC，我们的代谢组学结果发现谷氨酸和谷氨酰胺代谢，以及丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸生物合成代谢是BC中最重要的途径，表明BC进展过程中存在广泛的代谢紊乱。既往研究表明，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸途径是早期诊断BC的重要生物学途径[28]．精氨酸代谢途径已被确定为胃癌的潜在治疗靶点和诊断性生物标志物[29]．与HC相比，这三种代谢途径中的大部分代谢物在BC患者中下调，提示这三种代谢途径以及这些代谢途径中的代谢物可能在BC的病理生理过程中发挥重要作用。然而，这些代谢途径与BC发展之间的明确联系仍需要进一步澄清。

事实上，蛋白质和代谢物相互作用。一方面，蛋白质可以影响代谢物的特征，而反过来，代谢物可以通过酶促反应影响蛋白质的水平[30.，31]．因此，结合蛋白质组学和代谢组学的分析可以让我们对BC有更全面的了解。蛋白质组学数据特别鉴定了29个上调蛋白，如GOT1, LDHB, GPX3和GSS，以及2个下调蛋白，包括二肽基肽酶4 (DPP4)和GC)。在31种差异蛋白中，GOT1、LDHB、GPX3和GSS与代谢物密切相关，共同参与了谷氨酸、谷氨酸、丙氨酸、精氨酸生物合成、精氨酸、脯氨酸代谢、糖酵解或糖异生、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等重要代谢途径。

这四种蛋白在BC患者中的作用机制和功能是什么?GOT1是一种转氨酶，主要存在于心肌细胞和肝细胞线粒体中。众所周知，GOT1水平升高通常是对肝细胞和心肌细胞损伤的反应。GOT1催化丙氨酸和酮戊二酸生成丙酮酸和谷氨酸，因此与柠檬酸循环和谷氨酸代谢途径密切相关。近年来，GOT1代谢途径被发现在多种癌症中发挥重要作用，如多形性胶质母细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺导管腺癌(PDCA)、BC [32，33，34]．GOT1对癌细胞的作用在PDAC中得到了充分的证明。具体来说，抑制GOT1活性可以抑制PDAC细胞的生长。同时，GOT1可以调节酸中毒中能量代谢与活性氧(ROS)之间的平衡[35]．因此，GOT1敲低可破坏PDAC细胞的核苷酸代谢、糖酵解和氧化还原稳态[36]．此外，GOT1敲低还可通过调节铁代谢和铁下垂加速胰腺癌细胞死亡[37]．LDHB是糖酵解和糖异生的重要酶之一，通常用于监测心肌梗死。LDHB在丙酮酸和乳酸的相互转化中起重要作用，对肿瘤特异性Warburg效应至关重要，可能是一个重要的肿瘤相关靶点。研究发现LDHB可通过kruppel-like factor 14 (KLF14)转录因子调控糖酵解[38]并受成纤维细胞生长因子受体1 (FGFR1)调控，调控Warburg效应[39]．LDHB升高可促进丙酮酸对乳酸的适应，肿瘤微环境乳酸水平升高可通过激活血管生长因子促进肿瘤侵袭转移，并促进透明质酸及其受体CD44的表达活性[j]。40]．此外，LDHB的表达对不同的肿瘤有不同的作用，促进或抑制肿瘤的生长。许多研究发现，LDHB可通过调节细胞凋亡和自噬来促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭[41，42，43]．GPX3是一种硒蛋白，可以催化还原性谷胱甘肽(GSH)还原过氧化氢和其他超氧化物，从而去除活性氧，减少DNA损伤。研究发现，GPX3在肿瘤发展中起双重作用。一方面，它可以作为肿瘤抑制蛋白，另一方面，它也可以在肿瘤进展过程中作为促生存蛋白[44]．具体而言，GPX3过表达可降低前列腺癌细胞的克隆生长、异种移植物肿瘤的大小以及迁移和侵袭[45]．此外，GPX3过表达同样抑制癌细胞的增殖和转移[46]．GPX3的抗肿瘤活性依赖于其下调氧化调控的促肿瘤信号通路。然而，其他研究发现GPX3过表达可促进肿瘤进展[47，48]．基于这些发现，我们推测GOT1、LDHB和GPX3可能通过与上述相同的机制影响BC，如破坏糖酵解和核苷酸代谢，促进铁凋亡，或下调氧化调控的促肿瘤信号通路。然而，这些假设还需要进一步的研究来验证。

为了进一步确定诊断BC的特异性代谢特征，采用SVM模型，定义了包含47种代谢物的预测模型。在这47种代谢物中，有几种代谢物被证明与癌症密切相关。鞘磷脂(SM)是一类主要的鞘脂，大部分在BC中上调。SMs是细胞膜的基本元素，在细胞功能中起着至关重要的作用。SMs的增殖作用可以用几种可能的机制来解释。神经酰胺(CER)、鞘氨醇(SPH)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)等代谢产物作为重要的信号分子，调控细胞增殖、生长、凋亡和自噬等多种细胞生命活动[j]。49，50]．许多研究发现，SMs的增加与卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的预后不良密切相关[51，52]．此外，SMs已被确定为几种癌症的诊断和预后生物标志物，如子宫内膜癌和上皮性卵巢癌[53，54]．谷氨酸在BC中下调，是一种重要的兴奋性神经递质，参与生物合成、代谢和致癌信号通路[55]．谷氨酸与氨结合形成谷氨酰胺，解离后转运到肝脏和肾脏，是防止氨中毒的重要途径。此外，谷氨酸还参与尿素合成和核苷酸代谢。有趣的是，血浆中谷氨酸的减少与BC组织中谷氨酸的增加相反[56]，提示BC细胞从血液循环中吸收大量谷氨酸维持肿瘤细胞的生命活动。谷氨酸的上调也见于其他类型的癌症，如浆液性卵巢癌和肺腺癌[57，58]．研究发现谷氨酸可通过激活α -氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑油酸受体(AMPAR)加速肿瘤发生，并可通过激活MAPK通路促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移[59]．在BC中，谷氨酸也被发现在常氧条件下对hif - 1α的诱导起重要作用[60]．半胱氨酸在BC中下调，是生物体中常见的氨基酸。同样，血浆中半胱氨酸的减少与BC组织中半胱氨酸的增加相反[56]，表明BC细胞利用了更多的半胱氨酸。半胱氨酸以不同的方式积极参与肿瘤代谢重建。例如，它可以作为谷胱甘肽氧化还原反应的一种成分。它也是产生硫化氢(H2S)的底物，刺激细胞生物能量学。最后，它为能源生产和生物质生产提供了碳源[61]．一种与半胱氨酸相关的代谢途径——半胱氨酸白三烯途径(CysLT)与癌症密切相关[62]．CysLT能促进多种癌细胞的存活和增殖。然而，它的破坏降低了细胞活力，导致许多类型的癌细胞死亡，包括乳腺癌、肺癌和神经系统恶性肿瘤。此外，CysLT还与癌症的化疗耐药有关，其破坏可以逆转化疗耐药。基于以上发现，我们认为SM、谷氨酸、半胱氨酸等47种代谢物组成的小组密切参与了BC的病理生理，在乳腺癌的诊断中可以达到较高的疗效。当然，具体机理还需进一步研究。

我们的研究也有一些局限性。首先，样本量相对较小。所有参与者均来自单一中心，未建立外部测试队列。其次，用于蛋白质组学分析的样本太少，结果没有得到验证。第三，这些已确定的代谢物参与BC的确切机制尚不清楚。因此，进一步的蛋白质组学和代谢组学分析需要来自多个中心的更大样本量来验证我们的结果。对乳腺癌病理生理中几种代谢物和蛋白质的机制研究是我们下一步研究的重点。

总之，我们已经描述了BC患者血浆代谢组和蛋白谱的系统性变化。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸途径、谷氨酰胺和谷氨酸代谢途径以及精氨酸生物合成途径是乳腺癌发病过程中至关重要的代谢途径。我们还确定了47种代谢物，包括鞘磷脂、谷氨酸和半胱氨酸，这些代谢物可以有效地用于BC的诊断。虽然现在推断这些生物标志物将取代目前临床使用的BC筛查还为时过早，但我们的研究确实成功地证明了血浆代谢组学分析为探索BC的诊断性生物标志物提供了高置信区间。我们相信，在进一步的实验证实后，我们的发现将有助于开发有效的诊断工具，并广泛应用于乳腺癌的临床筛查。

由于我们进一步研究的需要，本次研究中产生和分析的原始质谱数据不对外公开，但应通讯作者的合理要求，可以向其提供。

公元前:

乳腺癌

HC:

健康的控制

BRCA1/2:

乳腺癌相关基因1和2

HER2:

人表皮生长因子受体2

表皮生长因子受体:

表皮生长因子受体

TM:

肿瘤标记物

东航:

癌胚抗原

CA15-3:

碳水化合物抗原15-3

体重指数:

身体质量指数

质量控制:

质量控制

UPLC-MS / MS分析:

超高效液相色谱-串联质谱分析

舰队指挥官:

折叠变化阈值

OPLS-DA:

潜在结构判别分析的正交投影

贵宾:

投影中不同的重要性

去分析:

基因本体分析

PPI:

蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

支持向量机:

支持向量机

射频:

随机森林

中华民国:

接收机工作特性曲线

AUC:

曲线下面积

PFPeA:

Perfluoropentanoic酸

费尔南多-阿隆索:

甲酸

GOT1:

天冬氨酸转氨酶

LDHB:

l-乳酸脱氢酶B链

GSS:

谷胱甘肽合成酶

GPX3:

谷胱甘肽过氧化物酶

竞技场队伍:

转体基因

CBP2:

羧肽酶B2

GC:

维生素d结合蛋白

PDCA:

胰腺导管腺癌

ROS:

活性氧

一类:

类克虏伯系数14

FGFR1:

成纤维细胞生长因子受体1

SM:

鞘磷脂

CER:

神经酰胺

主任:

鞘氨醇

S1P:

Sphingosine-1-phosphate

AMPAR:

α -氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑油酸受体

CysLT:

半胱氨酸白三烯途径

我们感谢李凤英、黄军和丁彦军在样品收集方面所做的努力。同时，我们也要感谢王红、孔子青和盛泉在蛋白质和代谢质谱方面所做的努力。

本研究得到浙江省重点研发计划(No. 2019C03021)和国家自然科学基金(No. 82172362)的支持。

作者指出

1. 安睿和于海涛对这项工作也做出了同样的贡献。

作者及单位

1. 浙江大学医学院邵逸夫医院检验科，浙江杭州庆春东路3号，310016

   安睿，于海涛，王彦忠，卢杰，高玉珍，谢新友，张军

2. 浙江省精准医学诊断与监测研究重点实验室，浙江杭州庆春东路3号，310016

   安睿，于海涛，王彦忠，卢杰，高玉珍，谢新友，张军

贡献

JZ:构思、监督、申请经费、审稿、编辑。RA:方法论、数据管理、形式分析、软件和写作原稿。HY:方法论、数据管理和形式分析。YW和JL:样品收集。YG:软件。XX:写作、审稿、编辑。作者们阅读并批准了最后的手稿。

相应的作者

对应到6张．

伦理批准并同意参与

本研究方案经浙江大学医学院邵逸夫医院伦理委员会(20180601-006)批准同意。所有参与者都对我们的研究非常熟悉，并提供了一份签署的知情同意书。这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

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