二甲双胍直接作用于线粒体，改变细胞生物能量学

背景

二甲双胍被广泛用于治疗糖尿病，人们对将这种药物“重新利用”用于预防或治疗癌症很感兴趣。然而，二甲双胍代谢作用的机制仍然知之甚少。

方法

我们对细胞和分离的线粒体进行了呼吸测量和稳定同位素示踪分析，以研究二甲双胍对线粒体功能的影响。

结果

我们表明二甲双胍减少线粒体呼吸，导致线粒体呼吸的比例增加，致力于解偶联反应。因此，二甲双胍处理的细胞变得能量效率低下，并通过柠檬酸循环显示出有氧糖酵解增加和葡萄糖代谢减少。先前的研究提出了二甲双胍作用的线粒体复合体I或各种细胞质靶点，但我们发现该化合物限制了分离线粒体的呼吸和柠檬酸循环活性，这表明至少对于这些作用，线粒体是主要靶点。最后，我们证明暴露于二甲双胍的癌细胞比未转化的细胞表现出更大的有氧糖酵解代偿性增加，突出了它们的代谢脆弱性。在癌细胞中预防这种代偿性代谢事件会显著损害生存。

结论

总之，这些结果表明二甲双胍直接作用于线粒体以限制呼吸，细胞对二甲双胍的敏感性取决于它们应对能量压力的能力。

双胍类药物二甲双胍已被公认为治疗II型糖尿病的重要药物[1- - - - - -3.]。药物流行病学证据[4，5]和实验室模型[6，7表明二甲双胍可能具有抗肿瘤作用，这引起了人们对该药物分子作用的新兴趣[8]。一种流行的观点是二甲双胍作为电子传递链络合物I的抑制剂。然而，二甲双胍直接作用于线粒体抑制复合体I的观点是有争议的[9- - - - - -15]。最近关于癌细胞对二甲双胍直接作用的敏感性的研究进一步突出了围绕二甲双胍作用方式的争议。这些研究表明，线粒体功能缺陷的癌细胞(rho0细胞)对二甲双胍的作用很敏感[11]，并且与没有这些突变的癌细胞相比，携带复合体I突变的癌细胞对二甲双胍的作用更敏感[16]。

虽然关于二甲双胍作用的分子机制存在争议，但人们普遍认为该药物会引起能量应激，并导致各种细胞谱系特异性的继发性效应。在糖尿病的情况下，肝脏是一个重要的靶器官。口服二甲双胍后，该器官通过门静脉循环暴露于相对高浓度的二甲双胍中，肝细胞表达高水平的药物内流所需的膜转运蛋白[17]。二甲双胍诱导的肝细胞能量应激导致糖异生减少[18- - - - - -20.]，从而改善高血糖和高胰岛素血症。这些代谢行为也代表了一种与胰岛素反应性癌症相关的候选机制[21]。最近的研究表明，二甲双胍治疗通过抑制线粒体甘油磷酸脱氢酶改变肝细胞氧化还原状态[22]。

了解二甲双胍对能量代谢的作用，特别是对线粒体功能的作用，对于“重新利用”该化合物在肿瘤学中的可能应用非常重要。越来越多的证据表明，线粒体代谢通过提供ATP和可用于合成代谢反应的代谢中间体，在支持肿瘤生长中起着重要作用[23]。此外，功能性线粒体复合体I已被证明对促进有氧糖酵解和Warburg效应至关重要[24]。为了支持这些观点，PGC-1α或ERRα这两种已知的线粒体代谢中枢调节因子已被证明可促进肝癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤的生长[25- - - - - -29]。在这里，我们证明了二甲双胍对细胞和分离线粒体的线粒体生物能量学的影响。

动物、细胞和试剂

野生型雄性C57BL/6J小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbour, ME, USA)。NT2196和NMuMG细胞由William Muller博士(McGill University, montracimal, Canada)提供，在其他地方有描述[30.]。MCF7和MCF10A细胞购自ATCC。除非另有说明，所有试剂均购自Sigma-Aldrich。

细胞培养

除非另有说明，所有细胞培养材料均购自Wisent公司。NT2196和NMuMG细胞按照先前发表的方法生长[30.]。MCF7细胞在含有10%胎牛血清，并添加青霉素和链霉素的Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM)培养基中培养。MCF10A细胞在添加5%马血清、20 ng/mL人表皮生长因子(hEGF)、0.5 μg/mL氢化可的松、10 μg/mL胰岛素、青霉素和链霉素的DMEM/Ham’s F12 50/50混合培养基中生长。所有细胞在37℃，5% CO条件下生长₂热模，系列II水套CO₂孵化器)。在比较葡萄糖或半乳糖培养基中生长对呼吸影响的实验中，MCF7细胞在标准葡萄糖DMEM或半乳糖(25 mM)培养基中培养，该培养基与DMEM具有相同的成分，只是葡萄糖已被半乳糖取代。细胞在葡萄糖或半乳糖培养基中培养20 - 25天。然后用ddH处理细胞₂0(对照组)或二甲双胍(0.5 mM)持续24小时，之后按先前描述的方法评估呼吸[31]。

细胞增殖

将固定数量的细胞镀于6孔板(9.6 cm)中²/)。每隔24小时取出培养基，用ddH处理细胞₂0(对照)或二甲双胍(0.5 mM和5.0 mM)。在相应的时间点(24,48和72小时)，取出培养基并储存在试管中(收集漂浮细胞);将贴壁细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，胰蛋白酶化，重悬于收集的培养基中，以2,500 rpm离心5分钟。取出培养基(并用于乳酸和葡萄糖的测量;取出培养基(在二甲双胍存在的情况下用于乳酸和葡萄糖的折叠变化测量)，重悬细胞颗粒，将细胞颗粒重悬在已知体积的新鲜培养基中。使用台盼蓝染色(0.4%，Gibco)和TC10自动细胞计数器(Bio-Rad)获得总细胞和活细胞计数。

乳酸和葡萄糖浓度

MCF10A、MCF7、NT2196和NMuMG细胞在6孔板(9.6 cm)中生长²/好吧)到60%的流利度。取出每孔中的培养基，以13000 rpm的转速离心10分钟，去除细胞碎片，放入新管中，用Nova BioProfile 400分析仪进行分析。只含有培养基而不含细胞的孔也用这种方法作为空白进行分析。为了计算细胞数，如上所述对细胞进行计数。为了计算乳酸产量和葡萄糖消耗，在每个条件下乳酸或葡萄糖的浓度从空白孔中减去，然后将该值归一化为总细胞计数。

呼吸

使用Digital Model 10 Clark电极(Rank Brothers, Cambridge, UK)对培养细胞或分离线粒体进行呼吸测量。用培养的细胞在各自的生长培养基中进行呼吸，用分离的线粒体在KHEB (120 mM KCl, 5 mM KH)中进行呼吸₂阿宝₄， 3 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)， 1 mM乙二醇四乙酸(EGTA)和0.3%牛血清白蛋白(BSA) (w/v)， pH 7.2)测定培养基。使用DigitizeIt软件(版本1.5)对分离线粒体的呼吸痕迹进行数字化。该软件使用在痕迹上发现的背景曲纸作为参考，从痕迹中提取值。简单地说，导入呼吸轨迹，根据轨迹图纸上的相应值手动定义坐标轴，并由软件生成数据值，使用GraphPad Prism 5软件绘制。

骨骼肌线粒体的分离

经麦吉尔大学动物保护委员会批准，小鼠在大约6个月大时被处死。从骨骼肌中分离线粒体，如前所述[32]。通过量化呼吸控制率(RCR)值来评估线粒体悬液的完整性，该值由ADP(状态3)存在时的耗氧量除以寡霉素(状态4)存在时的耗氧量得到。只有在对照条件下RCR值大于3的线粒体悬液才被使用。

用二甲双胍和呼吸治疗细胞

NT2196、NMuMG、MFC10A和MCF7细胞在ddH存在下生长₂0(对照)或特定剂量的二甲双胍24小时。1 × 10⁶细胞用于呼吸测量。耦合呼吸和非耦合呼吸的计算按[31]。简单地说，耦合呼吸是通过减去少霉素不敏感的总呼吸(2.5 μg/mL/1 × 10)来计算的⁶细胞呼吸。不耦合呼吸代表寡霉素不敏感呼吸。非线粒体呼吸表示对粘噻唑(10 μM)不敏感的呼吸。细胞未显示可检测到的非线粒体呼吸。

二甲双胍和呼吸治疗分离线粒体悬液

二甲双胍孵育实验中，线粒体(0.6 mg/mL)在37°C的KHEB培养基中，在温度控制的水浴(Fisher Scientific, Isotemp 3006S)中，在复合物I(等摩尔30 mM苹果酸盐和丙酮酸盐)或复合物II (25 mM琥珀酸盐和50 μM鱼藤酮)底物中，在ddH的存在下孵育₂0(对照组)或10mm二甲双胍30分钟。每10分钟重悬一次样品。30分钟后，用400 μL KHEB培养基(最终等摩尔浓度为6 mM苹果酸和丙酮酸或5 mM琥珀酸和10 μM鱼藤酮，不含或不含2 mM二甲双胍)稀释100 μL反应。立即记录呼吸作用，随后加入ADP (500 μM，状态3)、寡霉素(2.5 μg寡霉素/mg线粒体蛋白，状态4)和FCCP (1.5 μM)。

细胞和分离线粒体的稳定同位素示踪分析

MCF10A和MCF7细胞培养于6孔板(9.6 cm)中²/well)到80%的流畅度，之后是ddH₂培养基中加入0(对照)或二甲双胍(0.5 mM, 5.0 mM) 24小时。媒体随后被换成了[U-¹³C]葡萄糖(剑桥同位素实验室，图克斯伯里，MA, USA, CLM-1396, 99%原子)¹³C)标记培养基1小时。然后用4°C生理盐水(9 g/L NaCl)冲洗细胞一次，用80%甲醇(<20°C)淬火。将小鼠骨骼肌分离的线粒体重悬于浓度为1.5 mg/mL的KHEB培养基中。样品在37°C的温度控制水浴(Fisher Scientific, Isotemp 3006S)中，在1 mM苹果酸盐和1 mM [U-]存在下孵育¹³C]丙酮酸30分钟，或者在ddH存在的情况下₂0(对照)或5mm二甲双胍。然后样品在80%甲醇(<20°C)中淬火。剩下的步骤与细胞和线粒体提取物相同。代谢物提取通过超声在4°C(10分钟，30秒开，30秒关，高设置，Diagenode Bioruptor)进行。提取液通过离心(14000 rpm, 4°C)清除，上清液在-4°C的冷阱(Labconco)中干燥过夜。将微丸用含甲氧基胺-盐酸吡啶(10 mg/mL)超声和涡流溶解，离心后丢弃。样品在70℃(甲氧基肟)条件下孵育30分钟，然后用MTBSTFA在70℃条件下衍生1 h。然后，1 μL进样于按[33]。使用Chemstation软件(Agilent, Santa Clara, USA)进行数据分析。质量同位素分布分析根据[34，35]。

与未转化的细胞相比，癌细胞将更多的呼吸作用用于解偶联反应

为了评估乳腺癌细胞对有氧糖酵解和线粒体呼吸产生ATP的依赖性，我们将小鼠和人类乳腺癌细胞系与未转化的对照组的这些参数进行了比较。我们使用表达致癌Neu/ErbB2的NT2196细胞及其亲本NMuMG细胞作为小鼠细胞系模型。对于人类细胞模型，我们使用MCF7癌细胞和MCF10A上皮细胞作为比较对照。NT2196和MCF7癌细胞都显示出更高的葡萄糖消耗(图2)1A)和乳酸生成(图1B)与他们各自的控制相比。这些数据证实，与未转化的细胞相比，癌细胞中的有氧糖酵解升高。接下来，我们评估了乳腺癌细胞和非转化对照组的线粒体呼吸作用。线粒体呼吸作用可以是耦合的(与ATP的产生有关)，也可以是非耦合的(驱动质子泄漏反应)。NT2196癌细胞与NMuMG对照细胞相比，线粒体呼吸减少(图2)1C)。线粒体呼吸的减少是由于耦合呼吸的减少(图2)1小鼠癌细胞(NT2196)与其亲代对照之间的非偶联呼吸相似，而人类乳腺癌细胞(MCF7)的非偶联呼吸与对照细胞相比有所增加(图2)1E).耦合呼吸(图1D)在MCF7细胞中也比对照组减少，导致总体线粒体呼吸与对照组相比没有显著变化(图2)1C).接下来，我们通过计算线粒体呼吸与ATP产生耦合和不耦合的比例来量化线粒体偶联状态。与对照组相比，乳腺癌细胞投入了更大比例的线粒体呼吸来驱动解偶联反应(图2)1相反，对照细胞将更大比例的线粒体呼吸用于支持ATP的产生(图2)1综上所述，这些数据表明这些乳腺癌细胞比对照组有更高的有氧糖酵解速率，并且它们的线粒体有利于解偶联反应。

二甲双胍引起非偶联呼吸比例的剂量依赖性增加

二甲双胍导致MCF7癌细胞的呼吸量呈剂量依赖性下降(图2)2A)。呼吸的减少是由于用于ATP合成的呼吸速率的降低(图2)2B)。低剂量二甲双胍不影响解偶联呼吸速率，但在5 mM时下降(图2)2C)。随着二甲双胍剂量的增加，偶联呼吸速率降低，而非偶联呼吸基本不受影响，这一事实导致乳腺癌细胞将越来越多的呼吸比例用于非偶联反应(图2)2综上所述，这些结果表明二甲双胍降低了线粒体呼吸，并对线粒体产生ATP的能力产生了深远的影响。

二甲双胍导致癌细胞中有氧糖酵解比未转化的对照组更大的上调

由于二甲双胍对乳腺癌细胞线粒体代谢有显著影响(图2)2)，然后我们比较了这种药物在癌细胞和未转化的对照组之间的效果，因为它们在线粒体代谢方面表现出差异(图2)1)。二甲双胍导致乳腺癌细胞和未转化对照组的线粒体呼吸减少(图2)3.A、B)。然而，与乳腺癌细胞相比，未转化细胞的呼吸减少幅度更大(图2)3.A、B)。二甲双胍在急性治疗(15分钟潜伏期)时也引起呼吸减少[见附加文件]1、附加文件2小鼠对照细胞(NMuMG)中:图S1]，而小鼠乳腺癌细胞(NT2196)中未观察到变化。此外，二甲双胍引起线粒体偶联状态的转变，有利于非偶联呼吸，与癌细胞相比，非转化细胞的程度更大(图2)3.C, D)。暴露于二甲双胍后，癌细胞和未转化的对照组均显示有氧糖酵解升高(图2)3.情况)。糖酵解的上调将减轻二甲双胍引起的线粒体ATP产生的下降。在二甲双胍的存在下，癌细胞的有氧糖酵解比对照组明显增加(图2)3.情况)。尽管癌细胞有氧糖酵解的代偿性增加更大，但二甲双胍治疗对癌细胞增殖的影响与对照组相同，甚至更大(图2)3.I, J)。事实上，NMuMG和NT2196的增殖受到二甲双胍处理的影响相似(图2)3.1)，而MCF7在较早时间点受到的影响大于MCF10A(图2)3.J)。然而，与未处理的情况相比，所有细胞系在二甲双胍存在的情况下都表现出细胞增殖减少(图2)3.I, J)。总的来说，癌细胞糖酵解的代偿性增加未能在二甲双胍的存在下获得生存优势，这表明这些细胞在二甲双胍的作用下比未转化的对照组受到更大的能量压力，这与转化与ATP需求增加有关的观点是一致的。

这些数据的一个重要含义是，持续向细胞供应葡萄糖对于通过促进有氧糖酵解来减轻二甲双胍引起的能量应激至关重要。因此，我们测试了那些被迫完全依赖线粒体代谢产生ATP的细胞是否对二甲双胍更敏感。我们在用半乳糖代替葡萄糖的培养基中培养人乳腺癌细胞(MCF7) [36]。与在葡萄糖培养基中生长的MCF7细胞相比，在半乳糖培养基中生长的MCF7细胞显示出大约两倍的线粒体呼吸增加(图2)3.重要的是，在半乳糖培养基中生长的MCF7细胞比在葡萄糖培养基中生长的MCF7细胞将更大比例的呼吸用于ATP的产生(图2)3.这些结果验证了实验设计，表明与在葡萄糖中生长的细胞相比，在半乳糖存在下生长的癌细胞增加了线粒体呼吸，并提高了用于支持ATP生产的线粒体呼吸的比例(图1)3.K, L)。二甲双胍导致葡萄糖培养基中生长的MCF7细胞呼吸减少约20%(图2)3.然而，当MCF7细胞在半乳糖培养基中生长时，二甲双胍对线粒体呼吸的影响更深远，二甲双胍治疗后，线粒体呼吸减少了两倍以上(图2)3.二甲双胍导致在葡萄糖或半乳糖中生长的MCF7细胞的非偶联呼吸比例显著增加(图2)3.然而，二甲双胍对半乳糖中生长的MCF7细胞的非偶联呼吸比例的影响要比葡萄糖大得多，因为在基线时，这些细胞比葡萄糖中生长的MCF7细胞更偶联(图2)3.重要的是，在半乳糖培养基中生长的MCF7细胞，暴露于5 mM二甲双胍中48小时，比在葡萄糖培养基中生长的MCF7细胞表现出明显更多的细胞死亡(图1)3.J, M)。总之，这些结果表明，由于限制葡萄糖水平而不能进行有氧糖酵解的细胞完全依赖线粒体来产生ATP，因此更容易受到二甲双胍的影响。

二甲双胍通过柠檬酸循环减少葡萄糖代谢

二甲双胍导致乳腺癌细胞以及未转化对照组的线粒体呼吸减少(图2)2和3.)。鉴于电子传递链的活性与柠檬酸循环之间的密切联系[33，37，38]，我们研究了二甲双胍通过柠檬酸循环对MCF10A和MCF7细胞葡萄糖代谢的影响。为了解决这个问题，我们使用[U-]进行了稳定同位素示踪分析¹³6个碳(m + 6)标记的葡萄糖。葡萄糖(m + 6)通过糖酵解生成丙酮酸(m + 3)4A)。然后，丙酮酸(m + 3)可以通过有氧糖酵解转化为乳酸(m + 3)，或者通过线粒体代谢转化为柠檬酸循环中间体(m + 2)(图2)4A)。二甲双胍通过MCF7癌细胞和对照组的柠檬酸循环，降低了柠檬酸盐、异柠檬酸盐和α -酮戊二酸盐(m + 2)的标记(图2)4一部)。这些数据表明，与未处理的细胞相比，二甲双胍处理的细胞进入线粒体代谢的葡萄糖更少。此外，暴露于二甲双胍后，柠檬酸循环中间体在柠檬酸循环中所占的比例发生了很大变化(图2)4事实上，二甲双胍处理的细胞在柠檬酸循环中表现出柠檬酸盐的减少和苹果酸盐的增加(图2)4F).与MCF7细胞相比，MCF10A细胞在二甲双胍处理后表现出更剧烈的柠檬酸循环重排，这支持了线粒体代谢高的细胞对二甲双胍代谢反应更强的观点。与线粒体中葡萄糖代谢的减少相反，二甲双胍引起癌细胞和对照组细胞内乳酸与丙酮酸比值的增加，说明二甲双胍刺激有氧糖酵解(图2)4B).这一结果与图中数据一致3.使用不同的技术。在全球范围内，这些实验表明，用二甲双胍处理的癌细胞增加了糖酵解的活性，同时降低了线粒体柠檬酸循环的活性。

二甲双胍降低分离线粒体的呼吸作用

二甲双胍对细胞线粒体代谢有深远的影响(图2)2，3.和4)。为了评估二甲双胍是否可以直接作用于线粒体，我们使用从小鼠骨骼肌中分离的线粒体测试了二甲双胍对分离线粒体悬液呼吸的影响(图2)5)或MCF10A和MCF7单元[参见附加文件]1、附加文件2:图S2和S3]。用RCR值来评估线粒体悬液的质量，RCR值是通过将线粒体积极合成ATP(状态3)时的耗氧量除以它们驱动质子泄漏反应(状态4)时的耗氧量得到的[39]。从小鼠骨骼肌中分离的线粒体悬液质量高，RCR值在10以上(图2)5A、B)。

为了探究二甲双胍对线粒体的影响，我们使用了与复合物I或II底物孵育的线粒体。比较二甲双胍对与复合体I或复合体II底物培养的线粒体呼吸速率的影响，可以确定二甲双胍是否作用于复合体I或复合体II，因为复合体III到V都参与复合体I和复合体II依赖的呼吸。二甲双胍降低了状态3和状态4呼吸，以及线粒体在复合体I底物上呼吸的最大呼吸量(图2)5C,E)，但当线粒体在复合体II底物上呼吸时，对这些参数没有显著影响(图2)5D, F)。最后，二甲双胍还能显著降低MCF7和MCF10A细胞分离线粒体中复合体i依赖性呼吸1、附加文件2:图S2和S3]。总之，这些结果表明二甲双胍可以直接作用于线粒体并限制复杂的i依赖呼吸。

二甲双胍降低了分离线粒体的柠檬酸循环活性

鉴于二甲双胍可以直接抑制分离线粒体中复杂i依赖的呼吸，我们评估了二甲双胍是否可以通过在完整细胞中观察到的柠檬酸循环影响底物的代谢(图2)4)。为了做到这一点，我们在分离的线粒体中进行了稳定同位素示踪实验[34]。线粒体用标记物孵育$\left[{\mathrm{U}}^{-13},\mathrm{C}\right]$丙酮酸盐(m + 3)和未标记的苹果酸盐(图6一个)。$\left[{\mathrm{U}}^{-13},\mathrm{C}\right]$丙酮酸(m + 3)生成m + 2个柠檬酸循环中间体(图2)6一个)。$\left[{\mathrm{U}}^{-13},\mathrm{C}\right]$鉴于乳酸脱氢酶与骨骼肌线粒体相关，丙酮酸(m + 3)也可生成乳酸(m + 3) [40]。二甲双胍降低了m + 2柠檬酸盐、α -酮戊二酸盐和琥珀酸盐的生成(图2)6C-E)，说明丙酮酸通过柠檬酸循环的代谢减少。在二甲双胍治疗期间，柠檬酸循环中丙酮酸用量的减少伴随着乳酸生成的增加(m + 3;数字6B)，证明丙酮酸从线粒体代谢中转移。因此，经过二甲双胍处理后，完整细胞中丙酮酸通过柠檬酸循环的代谢减少(图2)4)可以在分离的线粒体中捕获(图2)6)。

尽管二甲双胍广泛用于治疗II型糖尿病，并且正在研究其在癌症治疗中的可能效用，但其对细胞和线粒体代谢的影响尚不完全清楚。我们发现二甲双胍直接作用于线粒体，抑制复合i介导的线粒体呼吸和柠檬酸循环功能。与我们从分离的线粒体中获得的结果一致，二甲双胍处理的细胞通过柠檬酸循环显示葡萄糖代谢减少，此外还显示线粒体呼吸的总体减少，以及有利于解偶联反应的转变。因此，线粒体代谢变得能量效率低下，细胞通过增加有氧糖酵解来补偿ATP产生的这种限制(图2)7)。

我们的研究结果证实，线粒体是二甲双胍的关键靶点，尽管有报道称其在细胞质中起作用[11，13]。这与先前的证据一致，即复合物I具有抑制作用，同时线粒体基质内带正电荷的药物在膜电位驱动下积聚[14]。我们的数据反对二甲双胍对线粒体的间接作用[9]。当这篇手稿还在准备的时候，Chandel小组的一项研究表明，二甲双胍能够限制肿瘤的生长在活的有机体内取决于线粒体复合体I [41]。此外，Hirst小组的一项研究表明，二甲双胍可以限制纯化复合物I的活性[42]。这些论文支持我们的数据，显示二甲双胍对线粒体呼吸的直接影响。

有临床[43]和实验性的[44证据表明，与许多抗糖尿病药物相比，二甲双胍的使用与适度的体重减轻有关。这与我们观察到的二甲双胍导致线粒体代谢效率低下是一致的，正如不耦合呼吸的比例增加所证明的那样。经典解偶联剂也会导致线粒体代谢效率低下，并已被证明能显著减轻体重，但其毒性太大，不适合临床使用。45]。有趣的是，最近的临床前研究表明，将解偶联剂DNP靶向肝脏(由于口服给药后的药代动力学，肝脏是受二甲双胍影响最大的器官)可降低毒性[46]。然而，重要的是要认识到，尽管二甲双胍导致线粒体代谢效率低下，但不应将其视为经典的解偶联剂。

最近有研究表明，对低糖更敏感的癌细胞在氧化磷酸化(OXPHOS)调控上存在缺陷，对双胍类化合物更敏感[16]。由于细胞需要依赖由线粒体代谢的替代燃料来源，因此低糖条件对显示强大线粒体能力的细胞是有利的[38，47]。此外，由于双胍类药物抑制线粒体代谢，加剧了对低糖敏感的细胞的OXPHOS缺陷，这解释了它们在低糖条件下对二甲双胍更敏感的原因[16]。我们发现，在没有葡萄糖和有半乳糖的情况下培养的细胞显示出线粒体代谢增加，并且对二甲双胍的影响比在有葡萄糖的情况下培养的细胞明显更敏感。也有研究表明，在没有葡萄糖和谷氨酰胺存在的情况下生长的癌细胞比在有葡萄糖存在的情况下生长的细胞更受二甲双胍治疗的影响[48]。总之，这些数据支持二甲双胍抑制OXPHOS的观点，因此，被迫依赖OXPHOS的细胞更容易受到二甲双胍作用的影响。此外，这些数据表明，在抑制OXPHOS的情况下，癌细胞通过增加糖酵解来进行补偿。我们证明，当二甲双胍抑制OXPHOS时，无论是在分离的线粒体中还是在完整的细胞中，柠檬酸循环都被抑制，并接受更少的葡萄糖碳，从而有利于乳酸的产生。重要的是，如果这种补偿受到葡萄糖缺乏或抑制驱动糖酵解的癌基因的限制[29，49]，即使存在其他需要线粒体功能生成ATP的营养物质，细胞的生存能力也会受到威胁。

虽然使用二甲双胍在癌症中诱导能量应激的概念很有吸引力，但必须考虑药代动力学问题。传统的抗糖尿病剂量的二甲双胍在肿瘤组织中达到有效浓度是不清楚的。许多癌症表达细胞表面转运分子，如OCT1，这是细胞在低环境药物浓度下摄取所必需的，其水平远低于药物活性所在的肝脏。然而，一旦进入细胞，来自癌细胞的线粒体的更大的膜电位[50，51与来自未转化细胞的线粒体相比，线粒体应该促进二甲双胍的摄取。因此，尽管高剂量的二甲双胍有一些在活的有机体内抗肿瘤活性[8]，它可能被认为是药物动力学优化的“先导化合物”，可能应用于肿瘤学。

我们证明二甲双胍直接作用于线粒体以限制柠檬酸循环活性和OXPHOS，正如在分离的线粒体和完整细胞中所证明的那样。二甲双胍介导的线粒体功能下降伴随着糖酵解代偿性增加。因此，细胞对二甲双胍的敏感性取决于它们进行有氧糖酵解的能力。因此，双胍类化合物可以潜在地用于肿瘤学，利用癌细胞的代谢脆弱性。

BSA:

牛血清白蛋白

CAC:

柠檬酸循环

DMEM:

Dulbecco 's Modified Eagle Medium

EGTA:

乙二醇四乙酸

GC / MS:

气相色谱/质谱分析

玫瑰:

(4) - 2-hydroxyethyl 1-piperazineethanesulfonic酸

高能:

人表皮生长因子

中期:

质量同位素分布

10月:

有机阳离子转运体

OXPHOS:

氧化磷酸化

PBS:

磷酸盐缓冲盐水

软:

呼吸控制比

SIM卡:

单离子监测。

这项工作得到了加拿大卫生研究院(资助号为MOP-106603)和Terry Fox基金会(资助号为TFF-116128)的资助。我们感谢麦吉尔大学癌症综合研究培训计划(MICRTP)(给SA, M219196C0G)， Maysie MacSporran奖学金(给SA, F201699C10)， Canderel(给SPG)和qusamac - sant研究基金会(FRQS)(给JSP)的工资支持。我们还要感谢Erzsebet Nagy Kovacs在老鼠方面提供的技术帮助。

作者及单位

1. 麦吉尔大学古德曼癌症研究中心，加拿大魁北克省montracimal, H3A 1A3 Pine Ave. West 1160号

   Sylvia Andrzejewski, Simon-Pierre Gravel & Julie St-Pierre

2. 加拿大麦吉尔大学生物化学系，3655 Promenade, William Osler爵士，montr， QC, H3G 1Y6

   Sylvia Andrzejewski, Simon-Pierre Gravel & Julie St-Pierre

3. 麦吉尔大学戴维斯夫人医学研究所，3755 Côte-Sainte-Catherine, montrsamal, QC, H3T 1E2，加拿大

   迈克尔Pollak

4. 麦吉尔大学莫蒂默·b·戴维斯爵士犹太总医院癌症预防中心，3755 Côte-Sainte-Catherine, montracimal, QC, H3T 1E2，加拿大

   迈克尔Pollak

5. 加拿大麦吉尔大学肿瘤学系，546 Pine Ave. W.， montrsamal, QC, H2W 1S6

   迈克尔Pollak

相应的作者

对应到圣皮埃尔朱莉．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

SA, SPG, MP和JSP计划实验。SA进行线粒体分离、呼吸实验和细胞培养实验。SPG对细胞和分离的线粒体进行了稳定同位素示踪分析，SA、SPG和JSP对数据进行了分析。所有作者都对数据的解释和写作做出了贡献，所有人都阅读并批准了最终的手稿。

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