一只或两只幼崽是普通夜行雌性的最佳繁殖策略

背景

动物繁殖的成功受到能量消耗和死亡率之间的权衡的影响，这与当前和未来的繁殖尝试有关。欧洲食虫蝙蝠的生殖策略不同于常见的哺乳动物标准，由于使用延迟受精。蝙蝠繁殖的物候学，包括怀孕的长度，在不同纬度的同一物种中可能不同，在同一地点的不同年份之间或在一个群落内的个体之间可能不同，都受到生态条件的影响。为了评估影响妊娠过程的因素，我们评估了20只雌性普通夜蝠的血液孕酮水平Nyctalus noctula．这些蝙蝠被单独标记，并随机分为冬眠终点不同的两组(即对照组和冬眠时间延长一周的治疗组)。从冬眠中醒来后，蝙蝠被关在一个温度稳定在22°C的木箱里。

结果

大多数雌性只生一个新生儿(65%)，但有一只雌性在其他雌性成功分娩前2天流产了她的幼崽。基于孕激素浓度的发展，我们能够定义许多不同的繁殖策略，即单胎或双胞胎的雌性，以及假设吸收一个胚胎的雌性(植入发育中的受精卵后的胚胎死亡率)。在怀孕初期和出生后，有两个胚胎的女性孕激素水平要高得多。孕酮水平在妊娠中期达到最高，怀一个或两个胎儿的女性之间没有差异。两组妊娠期差异显著，冬眠(治疗)时间较长的组妊娠期短约2天。

结论

女n noctula能够控制产仔数量，以平衡当前和未来的繁殖成功率。估计妊娠长度约为。49天似乎是标准n noctula，雌性会优化它们的体温调节行为，以使妊娠期尽可能接近标准。

哺乳动物的生活史特征往往随着体型的大小而变化，小型哺乳动物通常有大量的幼崽，这些幼崽生长和成熟迅速，但寿命短，而大型哺乳动物的幼崽和幼崽生长和成熟缓慢，但繁殖寿命长[1］．蝙蝠不同寻常，因为它们是小型哺乳动物，生活史缓慢，大多数品种每年产下一胎，一胎或两胎幼崽，在相对较长的妊娠期中缓慢发育[2］．在温带地区，适当的繁殖时机起着非常重要的作用。生活史理论的一个关键概念是当前生殖所产生的能量消耗和死亡风险与未来生殖尝试的潜在成功之间的权衡[3.］．雌性哺乳动物可能通过阻止植入、吸收胚胎、打掉胎儿或停止哺乳来终止成功几率低并威胁未来生殖的生殖尝试[4］．

普通的夜蝠Nyctalus noctula是一种常见和广泛分布的古北物种，母系群落主要分布在其活动范围的北部地理区域。这些体型巨大、飞行速度很快的食虫蝙蝠全年都居住在捷克共和国。它的繁殖受冬眠的温带蝙蝠延迟排卵的规律支配[5]，在冬眠期间，存活的精子被储存在子宫角中。排卵发生在3月下旬至4月中旬，视乎当时的天气情况而定[6，7］．一般认为，蝙蝠的妊娠期长不是固定的，这是由于冬眠期长变异的普遍存在。同一季节内同一物种的个体之间的分娩时间也可能有所不同[8，9，10]，视纬度而定[11，12，13，14，15，16，17]，或在不同气候年份之间[18，19，20.，21，22］．当从冬眠中醒来时，雌性已经处于妊娠早期，在食物供应波动期间，很难弥补能量消耗[23］．为了在不可预测的环境条件或缺乏食物的情况下生存，蝙蝠可能会进入一段麻木期[24］．另一方面，进入麻木期会延迟某些生理过程，包括胎儿发育[25］．雌性可能会采取体温调节行为，以优化幼崽的发育[26］．温带地区的幼蝙蝠必须学会飞行、制造和处理回声定位呼叫、捕捉猎物和储存脂肪，为冬眠做准备;因此，尽早分娩是有利的，以便使生育后的雌性和幼崽有最大的时间为冬天做准备[27］．在自然界中,n noctula在六月底至七月初生一至两个新生儿[7，28]，相当于约73天的妊娠期[29］．Pikula等人也记录了类似的妊娠期[28]在模拟自然温度波动的小气候条件下被圈养。在实验室条件下，食物不受限制，环境温度有利而稳定，妊娠期可接近49天[11］．

妊娠期由反映性腺活动的性激素的浓度维持[30.］．在雌蝠类中，黄体酮的浓度仅在六个物种的雌性中有报道，即墨西哥无尾蝙蝠Tadarida取代巴西橡胶树［31]，即普通的枢齿Pipistrellus Pipistrellus［25，小棕色蝙蝠鼠耳蝠lucifugus［32，33，古尔德的垂肢蝙蝠Chalinolobus gouldii［34，阿拉法特拉大足蝠鼠耳蝠mollucarum［35和Schreiber的长指球棒Miniopterus schreibersii［36］．这种研究的数据采集是困难的，因为血液必须进行侵入性采样，因此收集的材料数量很少。此外，由于食虫蝙蝠体型较小，不可能在短时间内对同一个体进行重复采样[37］．

最近，我们有一个难得的机会来监测女性的怀孕情况n noctula在将20只蝙蝠从一栋正在重建的建筑中救出来送进兽医护理后，他发现了这些蝙蝠的孕激素水平。为了更好地了解雌性蝙蝠的生殖生理，我们操纵了一些蝙蝠停止冬眠的时间点，提供了两组不同7天的出孕率，使我们能够专注于影响单个雌性蝙蝠怀孕过程的因素。我们假设:1)雌性会根据冬眠后可用的能量资源(这里用体重表示)来优化繁殖策略;2)由于胎儿发育过程中生态影响(如天气条件、食物供应)的变化较小，两个实验组的妊娠期大致相同。

孕激素模式及三种生殖策略的确定

两组的大多数女性(n= 7, 65%)只生了一只新生儿，而对照组中的一只雌性在其他雌性第一次成功分娩的2天前流产了幼崽。k -均值聚类最终将7名年轻且具有标准孕酮模式的女性聚类分开，即在妊娠开始和出生后浓度低，在妊娠中期浓度最高(图2)。1)．另外两组由孕激素水平下降的单身年轻女性或双胞胎女性组成。因此，根据聚类分析结果，可以定义三种策略:1)生单胎的女性，2)生单胎但具有典型的双胞胎孕激素模式的女性，3)生双胞胎的女性。

析因方差分析证实三组孕酮浓度存在差异;然而，治疗(即冬眠时间)的影响不显著(表1)．孕激素浓度仅在妊娠中期(阶段2)没有显著差异，事后比较表明，生单胎的女性在阶段1时孕激素浓度最低，生双胞胎的女性在分娩后孕激素浓度最高(阶段3;无花果。2)．此外，孕激素浓度仅在第1阶段与雌性冬眠后体重呈正相关(r= 0.462,p= 0.040)。

决定三种繁殖策略的参数

虽然上述三种女性策略在对照组(分别为4名、3名和4名女性)和治疗组(分别为3名、3名和3名女性)中均匀分布，但年龄结构并不平衡。6只亚成年雌性正在繁殖，除一只外，其余都只生了一胎(其中两只怀疑有胚胎吸收)。唯一的例外是双胞胎，在第一次正常分娩前2天流产。因为我们发现成年女性和亚成年女性之间没有大小差异(前臂长度或体重)2)，这些数据被收集起来供日后分析。

标准化体重仅在冬眠结束时(2020年4月14日)存在差异，当时蝙蝠被分为两个实验组，正是这些体重，而不是冬眠长度，决定了雌性随后的最佳繁殖策略(表14)3.)，最轻的女性生单胎(策略1)，最重的女性总是生双胞胎(策略3)，中等体重的女性最初发育两个胎儿，其中一个在妊娠期间被吸收(策略2)。胎儿吸收期发生在2020年4月27日至5月27日，此时策略2的女性标准化体重发生显著变化(表2)4)．在第一次实验测量(2020年4月27日)时，假设吸收的女性的中间体重与其他两组(策略1和策略3)没有显著差异，但在第二次测量(2020年5月27日;LSD事后测试结果)。拥有双胞胎的女性体重显著较高的情况持续到分娩后1个月(2020年7月29日;表格4)．在策略2组(假设再吸收)，我们还观察到对照组和实验组之间的前臂长度有显著差异(t =−4.275，p= 0.013)，尽管绝对差异不显著(t =−1.519，p= 0.204)或标准化(t =−0.430，p= 0.689)体重。假设的再吸收发生在对照组中比策略3的女性(双胞胎)更大(前臂更长)但更轻的女性中，在实验组中比策略1的女性(单身年轻)更小(前臂更短)但更重的女性中(图2)。3.)．

两个实验组的妊娠期有显著差异，冬眠时间较长的雌性(治疗组)妊娠期缩短约2天。事后比较表明，对照组的妊娠期有显著差异，有双胞胎的女性比单胎的女性妊娠期短(图2)。4)．

由于繁殖受到严重的生态和生理限制，温带蝙蝠通常每年只繁殖一只后代[6］．然而，一些蝙蝠，包括n noctula，都能在一胎中产下双胞胎后代[7］．由于繁殖是生命历史上最昂贵的特征，在自然条件下不超过20%的雌性倾向于生双胞胎[38]，尽管人工饲养时这一比例可能会增加88% [28］．在我们的研究中，双胞胎的比例也高于自然界(35%的女性)，这很可能是由于稳定的小气候条件和稳定的食物来源。最大的繁殖力，即双胞胎的分娩，取决于雌性在冬眠后早期的状态和怀孕期间的状态维持。当前生殖产量(最大繁殖力)的任何增加都可能以未来存活率或未来生殖产量为代价，即女性面临着投资双胞胎(实际繁殖成功)或单一后代(未来可能更高的繁殖成功)的决定。根据孕激素浓度模式定义的第二组很可能代表了假定吸收单个胚胎的女性。

雌性的繁殖策略主要取决于冬眠后的脂肪储备(即体重)。39，40]，因为这会影响她投入胚胎发育的能量，也会影响黄体酮的浓度，黄体酮是维持妊娠的激素。在这种情况下，利用冬眠策略以保持最大的脂肪储备，便可确保成功繁殖的最佳条件(参见“雌性节俭假说”)，[41]以及从冬眠中醒来的最佳时间。成人m . lucifugus例如，在冬季，雌性进入冬眠时脂肪储备较高，消耗这些储备的速度也比雄性慢，这可能是为了使它们能够以良好的状态从冬眠中醒来并开始怀孕[42］．在我们的研究中，最重的雌性无论冬眠的时间长短都能生下双胞胎，并最大限度地提高了她们的实际繁殖成功率。与此同时，我们发现，由于冬眠时间较长，体重较重但体型较小的雌性没有观察到双胞胎的出生(治疗组的策略2雌性;cf,无花果。3.)．年末出生导致骨骼生长减慢，幼崽死亡率高，长期生存潜力差[43，44］．而女性m . lucifugus条件最好的雌性比雄性更早出现，可能是为了利用母性栖息地更多变但可能更温暖的小气候，以及偶尔温暖的春夜觅食[45］．这些因素可以加速妊娠并支持幼崽的存活[25，46］．

在我们的研究中，体重较轻、冬眠时间较短的雌性(对照组)很可能会吸收一个胚胎，以降低它们的实际繁殖成本。通常情况下，雌性哺乳动物会终止成功概率很低并威胁到未来繁殖的繁殖尝试。蝙蝠胚胎死亡的情况可因身体条件差而发生，导致卵子着床受阻、胚胎吸收或胎儿流产[27］．如果流产与子宫排出妊娠产物无关，则随之而来的子宫积脓可导致妇女死亡[47］．在大棕色蝙蝠里Eptesicus fuscus在美国，已经有5个胚胎被植入，但没有一个被研究的雌性产下了两个以上的后代。在同一物种中，右子宫角出现发育中的胎儿，左子宫角出现吸收的胚胎也已证实[48］．然而，在野生动物中终止妊娠仍有争议，因为压力和其他外部生态条件，如食物剥夺、食物质量低、种群密度高和/或遗传缺陷，也可以发挥重要作用[4］．

脂肪储备是产生孕激素的重要基础物质[39］．在一些哺乳动物中，血液中孕激素的含量反映了胚胎的数量[49］．我们发现妊娠早期(第1阶段)孕酮浓度与冬眠后体重呈正相关。我们还能够描述妊娠期间孕激素发育的两种不同模式，使我们能够区分不同的繁殖策略，即雌性在假设胚胎吸收后怀上单胎、双胎或单胎。另一方面，血孕酮的最大浓度(在500 - 700 ng/ml之间;cf,无花果。1)在三种策略之间没有差异，这表明这代表了成功妊娠所必需的生理价值。树栖动物体内孕激素浓度高n noctula可能反映了由于妊娠期间外部条件变化的高影响，需要更强的生理保护来防止胚胎流产。孕酮浓度m . lucifugus，它们把建筑物用作夏季产妇窝巢[50]，在妊娠后期才达到200 ng/ml [32，33]，而多发期的热带阿拉弗拉大足蝠体内的孕激素浓度甚至更低鼠耳蝠moluccarum,澳大利亚c . gouldii或南非的人口m . schreibersii［34，35，36］．

我们的研究结果表明，在麻木状态下(治疗组)多呆7天的雌性比对照组平均晚4天生育后代。这表明，他们将妊娠期缩短了两到三天，以便让幼崽在拥有丰富食物资源的最佳夏季发育得更久。大马蹄蝠Rhinolophus ferrumequinum，越早出生的幼崽越有可能存活，增加了尽早生育幼崽的选择压力[43］．雌性蝙蝠控制妊娠期长短的能力已经为人所知有一段时间了[51]，现在已记录了广泛的妊娠长度[13，18，28］．事实上，我们自己在标准实验室条件下获得的49天的估计，在无限量食物和适宜的温度下，与[11］．妊娠期长短的估计主要取决于两个因素，即从冬眠唤醒的时间(如上所述)和随后的环境条件[52］．另一方面，由于蝠蝠使用精子储存和延迟排卵，很难准确地确定它们的自然排卵时间。在本研究中，我们简单地将妊娠期定义为从冬眠结束(转入圈养)到分娩日期之间的天数(见[25，53])。不幸的是，这一估计可能存在偏差，因为我们不知道蝙蝠在3月底从被破坏的冬眠栖息地转移之前的生活史。例如，在温暖的夜晚，雌性可能已经离开了冬眠地，在规定的冬眠结束之前就已经排卵了。

蝙蝠在欠佳的栖息条件下或在恶劣的天气下，每天发作的麻木会延长妊娠期和推迟分娩时间[25，51，54]，尽管哺乳动物的妊娠期长短因物种而异，且相对稳定[55］．使用日常麻木和怀孕通常被认为是相互排斥的过程，然而，它们同时发生在越来越多的哺乳动物物种中[56］．在怀孕p . pipistrellus，研究显示，在怀孕的不同阶段，诱导麻木可延长平均妊娠期，而这种延长与麻木期是一致的[51，57］．雌性会在怀孕期间采取这种体温调节行为，以促进幼崽的发育[26］．怀孕的雌性亦会陷入较浅及较短的麻木状态，并维持较高的体温[58，59，60］．在我们自己的研究中，在条件有利的情况下(稳定的环境温度和食物供应)，雌性根本不需要利用冬眠和或社会体温调节。因此，我们假设估计妊娠长度是标准的n noctula雌性会优化自己的行为，以使妊娠期尽可能接近最佳长度。

在活动季节，正确的繁殖时机对温带动物至关重要，包括蝙蝠。事实上，蝙蝠的情况更加复杂，因为它们使用延迟排卵和整个冬季的麻木期。作为低出生率的长寿动物，雌性蝙蝠必须在当前的繁殖和潜在的未来繁殖之间取得平衡。我们发现n noctula雌性利用三种繁殖策略，一种是胚胎吸收，使它们能够控制窝的数量，即生单个后代或双胞胎，最可能的是最大限度地提高它们的整体适应性。我们还估计妊娠期约为49天，并提出这是一个物种特有的标准，可能会受到外部条件的影响。最后,n noctula雌性优化它们的体温调节行为，以保持妊娠长度尽可能接近最佳。

动物及圈养管理

共有22名女性n noctula在3月底医院大楼重建后获救(Velký Týnec;49.5519731 N, 17.3375533E)，并提交兽医护理，在人工冬眠室中，在6°C的稳定温度下保存2周。这一实验前阶段允许在实验开始时唤醒之前标准化冬眠条件。2020年4月14日，每只蝙蝠都被称重和衰老，并测量了它们的前臂，之后每只蝙蝠都被单独识别(用不同颜色的指甲油标记)，然后使用随机数生成器随机分为两组。对照组冬眠时间较短，放置在环境温度为22℃的木盒中，而治疗组恢复人工冬眠，一周后，即2020年4月21日放置在同一木盒中，模拟更长时间的冬眠。4只和12只雌性在圈养期间死于不明原因，治疗组只剩下9只蝙蝠。活跃的动物被喂食粉虫Tenebrio莫利托和/或superwormsZophobas morio在日常基础上，结合兽医饮食犬/猫康复支持混合(皇家犬，法国)。此外，每周两次使用免疫增强复合复合维生素膏(H. von Gimborn GMBH，德国)补充矿物质元素。水是免费提供的。

抽血和孕酮分析

从每只蝙蝠身上采集血液三次，分别代表1)怀孕的初始阶段(冬眠结束后7天)，此时受精卵发生排卵和筑巢(4月-第一阶段);2)怀孕后期(5月-第二阶段);3)分娩后不久(6月至第三期)。从尿路血管抽血，详见[61］．简单地说，采集部位用酒精消毒，然后在皮肤上涂抹约2 μl的肝素，用无菌针刺穿血管。使用带有无菌肝素化尖端的自动移液管收集血液样本，并将其放入准备好的试管中。这种方法可以提供高达200 μl的血液，即安全采集大小为的哺乳动物的最大容量n noctula蝙蝠(37］．采集后，用一滴可吸收的外科组织胶(Surgibond, SMI AG, Belgium)压缩穿刺部位，并给予动物补充葡萄糖的食物。血浆通过离心分离，并储存在−20°C的冷冻室中，直到进一步分析。孕酮浓度使用孕酮酶联免疫吸附测定试剂盒(Enzo生命科学公司，美国)，按照制造商说明进行测定。

统计分析

采用Shapiro-Wilk检验检验变量的正态分布。除妊娠长度外，其余变量均为正态分布，随后对妊娠长度进行对数变换。妊娠期长度计算为从冬眠结束到出生日期之间的天数。采用t检验和方差分析比较两年龄组和治疗组之间的体型(前臂长度和体重)。虽然对照组和治疗组在前臂长度上没有差异，但他们在分为实验组时的体重上存在差异(2020年4月14日);因此，每一组的体重通过除以特定的子样本平均值来标准化。我们在孕酮数据上使用k-means聚类方法定义了研究中女性的聚类，并根据不同的孕酮模式进行计算，即单胎和/或双胞胎和胚胎吸收。采用主效应方差分析(Main Effects ANOVA)比较上述三种类型组之间孕酮浓度和标准化体重以及冬眠时间的差异，并采用Fisher LSD检验进行事后比较。同样，使用主效应方差分析(Main Effects ANOVA)评估治疗的影响和出生的幼崽数量(单胞胎vs双胞胎)，比较了拥有一只或两只幼崽的雌性之间的妊娠长度。使用Pearson相关系数评估体重与孕酮浓度之间的关系。 For analysis was used software Statistica for Windows®13.5 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA).

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。关于妊娠长度、标准体重和孕酮浓度的日志转换数据随此发表的文章作为附加文件表S1．

感谢Kevin Roche博士对英文文本的修正和改进。

本研究得到了布尔诺兽医科学大学IGA 209/2020/FVHE项目的支持。资助者在研究设计、数据分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

作者及隶属关系

1. 布尔诺兽医科学大学动物园动物、动物、鱼类和蜜蜂生态与疾病系，Palackého tsar。1946/ 1,612 42，捷克共和国布尔诺

   Katerina Zukalova, Veronika Seidlova, Vladimir Piacek, Monika Nemcova, Michal Pribyl和Jiri Pikula

2. 捷克科学院脊椎动物生物学研究所，Květná 8, 603 65，布尔诺，捷克共和国

   Jan Zukal

3. 马萨里克大学植物和动物学系，Kotlářská 267/ 2,611 37，布尔诺，捷克共和国

   Jan Zukal

贡献

JZ、KZ和VS构思并设计了该研究;JZ, KZ, JP收集材料，VP, MN, MP支持;KZ和VS进行实验室分析;JZ分析了数据;KZ和JZ起草了手稿，所有作者都贡献了批判性的评论。作者阅读并批准最终的手稿。

相应的作者

对应到(Katerina Zukalova．

伦理批准并同意参与

根据捷克第CZ01341号和CZ04344号合格证书(法令第246/1992 Coll.§17)，所有团队成员都被授权处理野生蝙蝠。实验程序由Brno兽医科学大学伦理委员会(博士)批准。不。MZP / 2021/630/966)。在捷克共和国，捕捉蝙蝠符合关于自然和景观保护的捷克第114/1992号法律，并以奥洛穆茨地区管理局(Doc.)签发的许可证为基础。不。郭鹤年/ 55979/2021 / OŽPZ / 9063)。这项研究是按照reach指南进行的。此外，所有方法都是根据捷克共和国适用的关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/EU进行的。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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