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自体条件血清治疗膝关节骨性关节炎的动物模型

BMC研究笔记体积15，文章号:277（2022）引用本文

摘要

客观的

作为一种进行性慢性疾病，骨关节炎(OA)会引起严重的疼痛和损伤。分泌性促炎细胞因子是参与骨关节炎病理生理的重要介质。在这方面，自体条件血清(autologous conditioned serum, ASC)的临床有效性已通过其注射到OA组织中得到证实。本研究旨在评估纳米碳玻璃微珠生产的ACS组分的有效性和浓度水平。

每只新西兰公兔通过10毫升注射器静脉注射全血，注射器中含有33个医用级纳米碳涂层玻璃微珠。孵育6-8 h后(37℃，5% Co2)，然后离心。然后将ACS注射到OA兔体内，以评估其功能。

结果

纳米碳包被玻璃珠制备的ACS，诱导大量细胞因子和生长因子的产生。纳米碳镀膜玻璃微珠刺激可提高抗炎细胞因子和促炎细胞因子的浓度水平。ACS可缩短OA兔的恢复时间，改善OA兔的功能和活动能力。

我们发现ACS能改善OA家兔的功能和活动能力，并缩短恢复时间。建议进一步的研究评估这种有效性。

简介

骨关节炎(OA)是一种常见的退化性关节软骨疾病，可导致关节稀释、肥厚性骨改变、疼痛、不适和残疾[1]，从而对医疗系统造成重大压力[2，3.］．根据最近的估计，到2030年，近6700万18岁以上的美国人将被诊断患有OA，医疗费用超过1000亿美元[4］．关节疼痛是骨性关节炎最常见的表现，最常受影响的关节是髋关节、手部、背部和膝关节。患骨性关节炎的风险随着年龄、肥胖和过去的创伤而增加[5，6］．骨性关节炎的药物治疗选择很少，包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、镇痛药和关节内注射透明质酸或类固醇[7，8］．不幸的是，对于骨性关节炎没有明确的治疗方法。现代OA治疗的主要目标是减轻疼痛和改善关节功能[9］．

这种使人衰弱的疾病背后的发病机制和病因还不是很清楚。白细胞介素-1 (IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF) α、蛋白酶等分解代谢因子与胰岛素样生长因子(IGF) I、II等合成代谢因子之间的相互作用影响软骨基质发育与分解之间的复杂平衡[6］．在这方面，局部细胞因子的产生是导致透明软骨及其基质降解的主要分子病理之一[10］．流行病学试验证明炎性滑膜和胫股软骨损伤的发生与存在之间存在直接联系[11，12］．因此，分泌的促炎细胞因子是骨性关节炎相关关节组织分解代谢增加的重要中介。参与OA发病的主要促炎细胞因子有IL-1β、IL-6和TNF [9］．在这方面，IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)理论上可以调节IL-1的内部网活动，从而作为一种自然发生的调节因子调节疾病过程[13，14］．

内源性il - 1ra富集的自体条件血清(ACS)是20世纪90年代中期设计的一种用于OA治疗的新型注射物质。梅杰等人。[15]报道了几种抗炎细胞因子的快速激发，如IL-1ra, IL-4和IL-10，这是将血液暴露于玻璃珠的结果。单核细胞活化后，IL-13的水平也增加，导致IL-1Ra和IL-1β的产生受到阻碍[16］．将血液暴露于玻璃微珠还有助于提取血液液相中的多种生长因子，包括转化生长因子-β (TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)和IGF-1 [17］．本研究旨在评价纳米碳物质包覆玻璃珠制备的ACS对OA兔的宏观和微观效应。此外，还比较了抛光玻璃微珠和纳米碳镀膜玻璃微珠产生的细胞因子和生长因子的浓度水平。

主要内容

材料与方法

动物

新西兰公兔(2.2±0.2 kg)购自伊朗德黑兰的牧场研究所，并在大不里士医学科学大学干细胞研究中心22±1°C中饲养。在一个代谢笼中，每只动物都可以自由地获得食物和水。实验是按照国家标准进行的，并得到了当地伦理委员会的认可。用胶原酶在家兔膝关节发生骨性关节炎。OA动物被分为acs处理组和正常盐水处理组。

ACS的准备

从每只兔子身上，用含有33个直径为2.5毫米、表面积为21毫米的医用级纳米碳涂层玻璃微珠的注射器抽取10毫升全血(不含抗凝血剂)2．在无菌条件下，全血在37°C和5% CO下孵育2然后，回收血清，1000g离心10分钟。制备的ACS保存在−20°C下直到使用。对照血清立即离心，不进行任何孵育，并保存在−20°C直到使用。

血清ACS安全性试验

外部认证的临床实验室评估了注射器产生的血清中微生物污染物(细菌、真菌和支原体)的存在和血清学标准。

ACS酶联免疫吸附试验

通过酶联免疫吸附试验(ELISA)评估ACS细胞因子和生长因子水平。使用10只不同兔子的血液样本，根据制造商的说明进行ELISA测试，分析碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、表皮生长因子(EGF)、PDGF-AB、IGF-1、TGF-β、IL-1Ra、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-13 (MyBioSource, San Diego, California)。

ACS效应的宏观评价

将兔子放在2平方米的面积内，以评估兔子膝盖跛行程度的改善。两名不了解动物健康的物理治疗师对动物的屈曲、步态、伸展和旋转进行了评估，为期28天，为期30分钟。使用膝关节位置比较量表对健康伸展和灵活的膝关节进行比较。损伤膝关节有不正常的、不能负重的伸展和柔韧性。当家兔的膝关节伸展度和柔韧性恢复到正常水平时，将其作为膝关节恢复时间。宏观评估软骨退变情况。为了评估膝关节的大体形态变化，对家兔进行麻醉，并切除膝关节。

ACS影响的显微和组织学评价

采用苏木精-伊红(H&E)染色法对兔膝关节软骨损伤进行显微分析。为此，使用10%的中性缓冲福尔马林固定单独的骨样本。然后用20%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，石蜡浸泡。然后用微tone法制备5 μm切片，用H&E染色。样本由病理学家评估，没有任何关于干预组和对照组的信息。在研究结束时，为了避免对动物的进一步骚扰，我们开始对它们实施安乐死。为此，动物静脉注射过量戊巴比妥≥150 mg/kg。

统计分析

采用SPSS 15.0版本(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行数据分析。采用配对t检验比较acs处理(抛光玻璃微珠和镀膜玻璃微珠)与基线的平均水平。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

纳米碳玻璃微珠可改善ACS患者细胞因子和生长因子的产生

ELISA检测结果显示，与抛光玻璃珠相比，ACS生产的镀膜玻璃珠中抗炎细胞因子(IL-1Ra、IL-4、IL-10和IL-13)或促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和IL-8)的浓度有所提高(图。1和附加文件1)．抛光玻璃刺激的抗炎细胞因子IL-1Ra、IL-4、IL-10和IL-13的浓度分别为8028±3269、7.11±4.12、24.99±8.05和92.92±26.36，纳米碳包埋玻璃微珠刺激的抗炎细胞因子浓度分别为12953±4090、12.3±5.47、32.14、32.14±9.948和95.47±23.33。虽然抛光玻璃微珠可诱导IL-1β、IL-6和IL-8等促炎因子，但纳米碳包被玻璃微珠诱导的促炎因子浓度较高，分别为61.19±43.06、59.76±19.14和34.16±10.80。此外，与单独抛光玻璃微珠相比，暴露于纳米碳镀膜玻璃微珠的ACS中b-FGF、EGF、PDGF-AB、IGF-1和TGF-β等生长因子的浓度显著升高。纳米碳镀膜玻璃微珠的生长因子浓度分别为2.577±1.085、31.44±7.007、40.71±10.20、164.5±47.09和177.1±66.54，抛光玻璃微珠的生长因子浓度分别为1.673±0.73、24.57±6.24、33.74±12.49、129.8±47.41和164.3±89.84(图)。2和附加文件1)．

图1
图1

纳米碳刺激或抛光玻璃微珠的细胞因子水平。数据以均数±标准差(SD)表示。P < 0.05为差异有统计学意义

全尺寸图像
图2
图2

纳米碳刺激或抛光玻璃微珠中生长因子的浓度水平。数据以均数±标准差(SD)表示。P < 0.05为差异有统计学意义

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ACS改善了软骨宏观和跛行状态

acs治疗组在第14±2天，正常盐水治疗组在第20±4天，损伤膝关节无负重减轻，膝关节柔韧性和伸展恢复正常，两组差异有显著性意义。对膝关节进行宏观评价，ACS组膝关节破坏程度低于对照组。ACS治疗组软骨表面不规则较少。此外，与生理盐水治疗组相比，该组观察到更多的细胞生长和更大的再生。3.a - c)。

图3
图3

大体形态和组织学样本用苏木精和伊红染色。一个第一天实验，B生理盐水组第28天;C自体条件血清组第28天;D第1天的实验中,E生理盐水组第28天F自体条件血清组第28天

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ACS改善了软骨退变的显微和组织学状况

总体软骨退变评分的结果评估显示，与正常盐水治疗组相比，acs治疗组的评分较低。此外，与正常盐水处理组相比，acs处理组在过渡区和径向区显示出正常的细胞结构，并且前者的软骨细胞克隆更好。3.D-F)。

讨论

骨关节炎与多种功能和生物学障碍有关。滑膜细胞分泌的细胞因子和关节内环境生长因子，以及活化的免疫细胞，在一定程度上介导骨性关节炎相关的软骨退化[18，19］．这导致产生破坏性和促炎症的细胞内因子，促使透明软骨进一步退化[20.］．促炎细胞因子IL-1β通过触发炎症和分解代谢级联过程在OA进展中发挥核心作用。关节软骨基质的恶化受IL-1β和TNF控制。除了IL-1β和TNF，其他因子如LIF、IL-21、IL-18、IL-17、IL-15、IL-8和趋化因子也参与了OA的发病[9，21］．IL-1ra是一种具有I型和II型IL-1关系的竞争性IL-1拮抗剂[22］．

20世纪80年代初，有人提出IL1抑制剂可用于某些疾病的治疗[23，24］．禁止IL-1生物学功能的策略包括使用可溶性形式的IL-1受体、IL-1Ra和细胞因子IL-4、IL-10和IL-13 [9］．在动物模型和人体临床试验研究中，向受影响组织注射ACS也证明了预防骨关节炎、椎间盘脱出、腰椎狭窄和肌肉损伤的治疗效果[17］．目前，许多欧洲国家的患者都可使用这种治疗方法，而且仍更常用于马骨性关节炎[25］．Baltzer等人[26]的研究表明，ACS可以有效预防疼痛性膝关节骨性关节炎。与之前的研究相似，我们的研究也证明了纳米碳玻璃珠刺激的ACS能够改善OA兔的柔韧性和伸展性，并减少总软骨退变和缩短恢复时间。

ACS的分泌反复增加生长因子(TGF-β、IGF-1、bFGF和PDGF-AB)和抗炎细胞因子(IL-10、IL-1Ra和IL-1β)的体积[17］．2010年的另一项研究表明，注射ACS后，抗炎细胞因子(IL-1Ra和IL-10)和促炎细胞因子(IL-1β， IL-6和TNF-α)的数量增加;然而，血清调节似乎对软骨代谢没有净影响[21］．已有研究表明，血源性ACS富含IL-1Ra、IL-4、IL-10和IL-13 [15］．此外，ACS还可分别促进和阻碍IL-1Ra和IL-1β的产生[15，16］．我们的研究结果表明，血液暴露于纳米碳镀膜玻璃微珠可促进许多抗炎(IL-1Ra、IL-4、IL-10和IL-13)、促炎(IL-1β、IL-6和IL-8)细胞因子和生长因子(EGF、bFGF、IGF-1、PDGF-ab和TGF-β)的合成迅速而有力地改善。

足够水平的IL-1Ra对于关节内可用性是必要的。由于已知IL-1β在低水平时具有功能，因此需要相对大量的IL-1Ra来抑制IL-1β的作用[27］．体内研究表明，在最后一次注射ACS后近35天，马滑液中IL-1Ra水平升高[25］．测定关节IL-1/IL1Ra比值为1:170。对于IL-1抑制，所需的IL-1/IL-1Ra的最小比例为1:10 [19］．因此，ACS注射液可强烈抑制IL-1的生物活性[22］．此外，我们的研究结果显示，与抛光玻璃珠相比，纳米碳玻璃珠制备的ACS中IL-1Ra浓度更高。此外，镀膜玻璃微珠刺激ACS时，所有细胞因子和生长因子的浓度水平均明显高于单纯玻璃微珠刺激。

结论

制备的纳米碳包被ACS含有大量的生长因子和细胞因子，表明对细胞有较高的刺激作用。ACS可改善OA家兔的功能和活动能力，缩短恢复时间。建议今后的研究方向是开展能够证实临床试验结果的随机对照试验，并研究ACS的作用机制。

限制

虽然已经发现ACS的制造过程会持续提高IL-1Ra和其他变量，但调节影响的方法尚不完全清楚。观察到的临床影响可以用大量的协同活性治疗分子来解释，但其长期持久性则更难解释。

数据和材料的可用性

原始数据由大不里士医科大学提供。支持本研究结果的衍生数据可根据要求从通讯作者处获得。

缩写

ACS:

自体条件血清

b-FGF:

碱性成纤维细胞生长因子

ELISA:

酶联免疫吸附试验

表皮生长因子:

表皮生长因子

EDTA:

乙二胺四乙酸

):

苏木精和伊红

IL1-Ra:

IL-1受体拮抗剂

IGF:

胰岛素样生长因子

IL:

白介素

生活:

白血病抑制因子

非甾体抗炎药:

非甾体类抗炎药

办公自动化:

骨关节炎

PDGF:

血小板衍生生长因子

TGF -β:

转化生长因子

肿瘤坏死因子:

肿瘤坏死因子

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下载参考

确认

作者感谢伊朗大不里士医科大学干细胞研究中心(批准号66350)对本项目的财政支持。

资金

目前的研究得到了伊朗大不里士医学科学大学干细胞研究中心的支持(批准号:66350)。

作者信息

作者及隶属关系

  1. 大不里士医科大学干细胞研究中心，邮箱:6446-14155，伊朗大不里士

    Alireza Pishgahi, Leila roshanar, Milad Afkham-Daghdaghan, Behzad Pourabbas和Mehdi Yousefi

  2. 伊朗戈纳巴德医科大学传染病研究中心联合医学院医学检验科学系

    Majid Zamani

  3. 伊朗大不里士医科大学血液学和肿瘤研究中心

    量化这些活动Amir麦迪扎德

作者
  1. 此前Pishgahi
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  2. Majid Zamani
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  3. 量化这些活动Amir麦迪扎德
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  4. 莱拉Roshangar
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  5. Milad Afkham-Daghdaghan
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  6. 将核技术Pourabbas
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  7. Mehdi Yousefi
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贡献

AP撰写稿件，参与研究设计，进行实验室测试，负责ACS注射和照顾动物，MJ撰写部分稿件，参与ACS制备，进行实验室测试，照顾动物，MAD和LR调查动物微观和宏观恢复状态，BP参与数据分析，AM编辑稿件并提交论文，MY设计并批准研究方案，论文投稿期间的全部通信，处理修改和重新提交修改稿，直至稿件被接受。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Mehdi Yousefi．

道德声明

伦理批准并同意参与

大不里士医学科学大学伦理委员会批准了这项动物研究的伦理。IR.TBZMED.VCR.REC.1399.409)。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者声明没有利益竞争。

额外的信息

出版商的注意

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补充信息

附加文件1:表S1。

自体条件血清中细胞因子和生长因子的浓度。

权利和权限

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引用本文

Pishgahi, A.， Zamani, M.， Mehdizadeh, A.。et al。自体条件血清治疗膝关节骨性关节炎的动物模型。BMC Res Notes15， 277(2022)。https://doi.org/10.1186/s13104-022-06166-1

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关键字

  • 骨关节炎
  • 自体条件血清
  • 细胞因子
  • 生长因子

BMC研究笔记

ISSN: 1756 - 0500

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