方法gydF4y2Ba
细菌和噬菌体菌株gydF4y2Ba
大肠杆菌gydF4y2BaBB/1是T3噬菌体的宿主。T3由F. W.研究员[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba].参考文献中描述了T3,并将其与相对的T7进行了比较。[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
大肠杆菌gydF4y2BaBB/1(1)在2xLB培养基中繁殖:20 g色氨酸,10 g酵母提取物,5 g NaCl, 1.0升Millipore/Sigma过滤水(Millipore/Sigma);(2)在2xLB培养基中,30°C,使用之前描述的程序[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].从自然裂解物中纯化噬菌体的方法是:(1)聚乙二醇沉淀,(2)稀释DNase I处理,(3)通过氯化铯阶梯梯度离心,(4)在氯化铯密度梯度中浮力密度离心,以及(5)对以下缓冲液进行透析:0.15 M NaCl, 0.01 M Tris-Cl, pH 7.4, 0.001 M MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba.详情见参考文献。[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
小鼠接种gydF4y2Ba
在实验室(~上午10:00)以100 μl 4.0 × 10的IP注射(也可用于噬菌体治疗)接种小鼠gydF4y2Ba12gydF4y2Ba在纯化的最后缓冲液中每毫升噬菌体T3(上一段)。在指定时间通过尾静脉抽取血液样本。未使用麻醉或镇痛。gydF4y2Ba
小鼠为野生型,幼龄(10-12周龄),体重约20克,雌性C57BL/6,无疾病,健康,购自Harlan,在作者所在机构的无菌室和无菌笼中,在22°C下,光照12小时/暗周期12小时。免费提供标准辐照鼠粮(Harlan Teklad-485)和水。每个笼子里有(1)不超过五只老鼠和(2)一个不锈钢棒盖和水瓶。只有训练有素的调查人员和穿着防护服(头具、口罩、长袍、手套和脚具)的工作人员才能进入设施。该大学提供了最先进的畜牧、兽医护理和管理支持。在噬菌体感染和血液取样后,研究人员观察小鼠的不良反应迹象。根据美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学卫生中心机构动物护理和使用委员会批准的协议(编号170074x)对小鼠进行处理和安乐死。该机构在NIH实验室动物福利办公室有一份动物福利保证文件:保证编号,A3345-01。动物的护理和使用符合2011年修订的NRC出版物“实验动物护理和使用指南”和其他适用的联邦法规。gydF4y2Ba
传染性试验gydF4y2Ba
感染噬菌体的滴度通过标准斑块形成程序获得[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]用0.7%的上层琼脂凝胶在2xLB培养基中,除非如下所示。用0.5 M NaCl, 0.01 M Tris-Cl, pH 7.4, 0.001 M MgCl稀释菌斑计数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,明胶1.0 mg/ml。37℃孵育;稀释调整,使滴度基于至少200个斑块,采样误差小于7%。gydF4y2Ba
天然琼脂糖凝胶电泳(AGE)gydF4y2Ba
在由以下两种低熔点琼脂糖制剂(Lonza)的熔融混合物(0.5% SeaPlaque + 0.5% SeaPrep)制成的上层凝胶铸模中形成斑块后,对斑块相关噬菌体颗粒进行AGE。将~ 10 μl凝胶置于狭窄的玻璃管(内径4.5 mm)中,在39℃下孵育1.0 h,每15 min涡旋一次,然后在0.045 M MgCl中加入1.1 μl DNase I (1.0 mg/ml)消化DNAgydF4y2Ba2gydF4y2Ba30°C孵育1.0 h。在AGE前,加入跟踪染料(200 μg/ml溴酚蓝)和中性增密度化合物(11.2%蔗糖),溶液为0.09 M Tris-acetate, pH 8.3。程序改编自参考文献[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
AGE在1.0%水平浸泡琼脂糖(Seakem LE;凝胶18.0小时,1.0 V/cm,电泳缓冲液:0.09 M Tris-acetate, pH 8.3, 0.001 M MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba.电泳(1)在样品加载1.0 h后开始,这一延迟是为了减少缓冲液的不连续,(2)在电泳开始1.0 h后,通过温控水浴进行缓冲液循环(> 100 ml/min)。凝胶温度为25±0.5℃。电泳后,用GelStar染色观察颗粒(1:25 000稀释的GelStar龙沙溶液;核酸特异性)和紫外线照明。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
噬菌体T3在小鼠血液中的寿命gydF4y2Ba
在IP注射T3噬菌体后,T3血滴度在前3-4小时内没有明显降低(图中填充的圆圈)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).随后滴度下降并持续8天(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).滴度每天下降约一个数量级。gydF4y2Ba
为了说明与噬菌体P22早期数据的巨大对比,P22的数据来自Ref. [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba图中为实线。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa.对比在后来的时间里继续存在(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).滴度标准误差小于7%。gydF4y2Ba
天然凝胶电泳gydF4y2Ba
我们做了以下工作,以快速确定T3是否经历了小鼠传代诱导的选择,足以导致其表面的遗传变化。我们进行了噬菌体的AGE,这些噬菌体在先前由不同时间采集的血液样本的传染性测定产生的斑块中繁殖。gydF4y2Ba
注射小鼠后,AGE在一个位置产生了一个单一的条带,该条带不随时间变化(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;时间[h]在车道之上);这个位置与接种体(I巷)的位置相同。AGE过程中的迁移速度随粒子尺寸(在本例中为半径)的增加而减小,并随平均表面电荷密度σ[的大小而线性增加。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba];σ为负。如果半径或σ有3%或更多的变化,带的位置就会发生变化[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
血液中T3含量高:一个可能的解释gydF4y2Ba
噬菌体T3的以下特征可能是其高持久性的原因。首先,T3是一种噬菌体。因此,所有祖先的T3 dna在被包装在细胞外噬菌体颗粒中时都经历了进化压力[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba].这意味着如果细胞外环境包括动物/人,则选择高持久性。相比之下,祖先的溶原噬菌体dna有时并没有被如此选择[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
第二,噬菌体T3几乎可以肯定是从粪便或污水中分离出来的[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba].这个起源意味着通过人类和/或动物。因此,T3确实可能因为高持久性而被选中。图的数据。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba说明在Fig的实验过程中,T3表面没有被选择进一步修饰。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
最后,有人怀疑T3的podovirus方面[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba是一个因素。绒毛病毒的尾巴和尾纤维相对较短[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba].因此,纠缠驱动的损失预计会比长尾噬菌体(即虹吸病毒和肌病毒)少。相对T3, T7,也有这些优点。gydF4y2Ba
T3 vs T7gydF4y2Ba
与T3相比,T7具有三种限制持久性的物理特性,这可能解释了文献中观察到的相对较低的T7小鼠持久性。[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba].(1) T7,而不是T3,具有AGE检测到的非感染状态(第二AGE带),进入和走出该状态可被环境诱导。采用这种非传染性状态可能会导致低持久性的表象或现实[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba].(2)在AGE过程中,T7能粘附在琼脂糖凝胶上,T3则不行,说明T7通常比T3“更粘”[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31gydF4y2Ba].这可能导致低持久性通过吸附T7到上皮细胞。与T3的粘性低于T7有关的可能是负T3 σ的绝对值较高,为1.28 × T7的负σ [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].(3) T7噬菌体的高温稳定性不如T3(未发表的观察结果),可能是因为基因组的排列更紧密[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
单斑块年龄(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)直接筛选性质(1)和(2)。以下数据表明,单斑块AGE还可以通过筛选负σ高的幅度来筛选高持久性。使用非噬菌体药物传递载体的经验表明,整体持久性随负σ增加,随正σ降低[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba],尽管某些先天免疫系统确实会清除σ为负的粒子[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
在噬菌体治疗中分离噬菌体的改进gydF4y2Ba
在这里发现的高持久性噬菌体表明,除了目前选择清晰的斑块形成噬菌体的做法之外[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba],在未来,菌血症靶向噬菌体应筛选高持久性。但是,重复Fig的实验。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba查找代理屏幕的时间已经够长了。前一节的讨论建议测试以下是高噬菌体持久性指标的可能性:与负σ相对较高的单个AGE带相关。单斑块AGE可快速获得σ值(图2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)透过两种或以上不同浓度的琼脂糖凝胶[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba].这可以在初始的单斑块纯化过程中完成。gydF4y2Ba
在单菌斑纯化过程中,也可实现快速、简单、部分的噬菌筛选。这是通过比较相对低浓度(例如,0.3%)琼脂糖支撑凝胶中的斑块直径与较高浓度(例如,1.2%)琼脂糖支撑凝胶中的斑块直径(例如[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba])。由于噬足菌通常比其他DNA噬菌体更小,因此噬足菌将优先通过斑块直径对支持凝胶浓度的低依赖性来识别。对先前发现的噬菌体建立了噬后体分类[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba对小鼠的噬菌体疗法最为有效gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba-菌血症及脑膜炎[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba].更广泛的数据似乎无法获得。gydF4y2Ba
为了改善噬菌体治疗菌血症,除了上述讨论的因素外,还可能涉及其他因素。但是,未来对噬菌体σ与噬菌体治疗效果相关性的测试是一个合理的开始。gydF4y2Ba