METTL3以m6A-YTHDF1依赖的方式促进非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖和集落形成

背景

n6 -甲基腺苷(m6A)是最常见的RNA修饰，在肿瘤发生发展中起着关键作用。在这项研究中，我们评估了m6A甲基转移酶METTL3在fras1参与的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的细胞增殖和集落形成中的作用。

方法

细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力和菌落形成情况。通过M6A RNA免疫沉淀(IP)、核糖体免疫沉淀(Ribosomal immunoprecipitation, RIP)、RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)验证METTL3、FRAS1与YTHDF1的关系。拯救实验证实METTL3-FRAS1的调控机制通过协同YTHDF1通过CDON促进NSCLC细胞增殖。

结果

我们发现FRAS1与NSCLC患者的不良预后相关，其中转录本经过METTL3调控的m6A修饰。METTL3沉默降低了NSCLC细胞HCC827和NCI-H1975的细胞活力，可通过FRAS1过表达恢复。YTHDF1能够识别FRAS1的m6A修饰。FRAS1沉默或YTHDF1沉默可挽救METTL3过表达诱导的NSCLC细胞增殖、集落形成和肿瘤生长升高。

结论

我们的研究揭示METTL3-FRAS1通过协同YTHDF1调控CDON在NSCLC细胞增殖、集落形成和肿瘤生长中发挥重要作用。

n6 -甲基腺苷(m6A)修饰已被证实在肿瘤发生中发挥重要作用[1，2，3.］．m6A异常修饰被报道与胶质母细胞瘤(GBM)、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌等有关[4，5，6］．现有研究表明m6A修饰在癌症中起着双重作用。然而，m6A在肺癌中的作用、机制和临床价值尚不清楚。

M6A修饰由特定的甲基转移酶(称为“写入器”)、M6A识别蛋白(称为“读取器”)和去甲基化酶(称为“擦除器”)调控。METTL3是第一个被鉴定的甲基转移酶，它负责m6A修饰。越来越多的证据表明METTL3在肿瘤发生中起多种作用[7，8］．例如，METTL3通过m6a依赖的方式调节SOCS2表达来促进肝癌进展[9］．在胃癌(GC)中，METTL3通过增强m6A修饰和稳定性促进胃癌细胞增殖和肝转移HDGF［10］．据报道，METTL3通过诱导m6A修饰的蛋白来加速结直肠癌的进展GLUT1激活mTORC1信号[11］．METTL3还被发现通过调节Bcl-2促进乳腺癌肿瘤的发生[12］．最近的研究表明METTL3在肺癌中上调[13］．mettl3诱导lncRNA ABHD11-AS1 m6A甲基化可促进NSCLC细胞增殖和Warburg效应[14］．这些研究表明，mettl3调节的m6A mRNA甲基化在包括肺癌在内的人类肿瘤中起着至关重要的作用。

YT521-B同源性(YTH)结构域含蛋白(YTHDFs) YTH可以识别和调控RNA m6A修饰的作用。YTHDF2是第一个报道的m6A阅读器，研究表明YTHDF2促进多种癌症的肿瘤发生[2］．例如，YTHDF2可以通过保持胶质母细胞瘤的稳定性来促进胶质母细胞瘤生长MYC而且VEGFA依赖于m6a的转录本[15］．在肝细胞癌(HCC)中，一项研究表明YTHDF2表达与HCC进展呈正相关[16]而另一项研究报告YTHDF2通过加速抑制HCC肿瘤生长表皮生长因子受体mRNA降解[17］．除YTHDF2外，YTHDFs家族还包括YTHDF1、ythd3、YTHDC1。据报道，YTHDF1在多种癌症中发挥肿瘤启动子的作用，如胃癌[18]， HCC [19，20.]，非小细胞肺癌[21］．迄今为止，YTHDF1在NSCLC中的作用尚不清楚。

Fraser细胞外基质复合物亚基1 (FRAS1)已被报道对胚胎上皮-间充质完整性至关重要[22］．近期研究表明FRAS1参与了NSCLC的恶性表型[23]、胃癌[24]、结直肠癌[25］．

在本研究中，我们探讨了FRAS1在NSCLC中的作用及其潜在的分子机制。我们的数据表明m6A甲基转移酶METTL3诱导FRAS1m6A修饰和蛋白稳定性，从而加速NSCLC细胞增殖。

数据分析

FRAS1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的总体生存分析使用在线生存分析工具Kaplan-Meier绘图仪(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=background) [26]，内载非小细胞肺癌患者的临床资料(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=lung) [27］．根据FRAS1的中表达将NSCLC患者分为两组。曲线上标注95%置信区间(ci)的危险比(HR)和log rank p值。分析使用FRAS1 (220910_at)的JetSet探针集。通过Pearson相关分析，鉴定与METTL3和YTHDF1相关的共表达基因，并将|Pearson R|> 0.3和PTCGA-LUAD&LUSC数据集< 0.05;根据METTL3的相关系数大于0.6,YTHDF1的相关系数大于0.45,P值小于0.001，筛选出交集基因，列在附加文件中1:表S1。

人体组织和细胞系

本研究采用来自太空中心医院的五对肺腺癌组织。这项研究的伦理批准来自太空中心医院(20,200,511-JJJHZ-01)。获得每位患者的书面知情同意书。4株NSCLC细胞株(A549、NCI-H1299、HCC827、NCI-H1975)和人支气管上皮细胞株HBEC均来自中国武汉普耐尔生命科技有限公司。A549细胞在DMEM (High glucose, Gibco, Grand Island, NY, USA, 11,965-092)中培养，加入10% FBS (Gibco)和1%青霉素/链霉素(P/S, Procell)。NCI-H1299、HCC827和NCI-H1975细胞在rmi -1640培养基(Gibco)中培养，含10% FBS (Gibco)和1%青霉素/链霉素(P/S, Procell)。HBEC细胞在支气管上皮生长培养基(BEGM, Lonza, CC-3170)中培养。所有细胞在37℃5% CO中培养₂孵化器。

稳定细胞系

shMETTL3、shYTHDF1、shFRAS1和shScramble由中国广州RiboBio公司合成，克隆到载体pLKO中。1雪茄烟。通过感染这些相应的慢病毒，产生了shMETTL3、shYTHDF1、shFRAS1、shscramble等稳定细胞系。感染后2 d，加入嘌呤霉素(1 μg/mL)。shRNA序列见表1．

定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)

使用Trizol (Beyotime，上海，中国)分离总RNA，使用EasyScript®第一链cDNA Synthesis SuperMix (Transgen，北京，中国)进行反转录。采用TransStart®Green qPCR SuperMix (Transgen)进行实时荧光定量PCR分析。用标准2分析各基因的相对表达量^−ΔΔCt方法(28]并归一化为GAPDH。qPCR引物序列见表2．

免疫印迹

使用低温裂解缓冲液裂解细胞并提取蛋白质。等量蛋白质用6%或10% SDS-PAGE分离后转移到硝化纤维膜上。用5%脱脂牛奶在室温下阻塞1小时后，用相应的一抗在4℃下孵育过夜。然后用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育该膜，并用增强化学发光(ECL)底物(Beyotime, Shanghai, China)进行检测。一抗为:anti-FRAS1 (#ab240583;Abcam，剑桥，英国)，反mettl3 (#ab195352;， anti-YTHDF1 (#ab252346;Abcam)， anti-RPL-22 (#ab77720;)， anti-CDON (#ab227056;)， anti-CCND1 (#ab16663; Abcam), anti-β-actin (#ab8226; Abcam), anti-α-tubulin (#ab7291, Abcam) and anti-GAPDH (#ab8245; Abcam).

CCK-8和菌落形成

使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8, Beyotime)分析细胞活力。细胞接种于96孔板(2 × 10^3./well)培养不同时间(0、1、2、3、4、5天)。用10 μL CCK-8溶液培养细胞1 h，用多模平板阅读器检测450 nm处的吸光度。

对于菌落形成实验，细胞以4 × 10的密度被镀^3./孔在6孔板与完整的介质。2周后用多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色。菌落图像是用相机确定的。

EDU公司

用聚d -赖氨酸和基质包被载玻片。将HCC827和NCI-H1975细胞分别接种于载玻片上。第二天，用si-CDON或si-NC质粒转染细胞。转染48 h后，EDU加入4 h后固定。细胞与固定液孵育15分钟，渗透20分钟。然后将反应混合物用于EDU荧光标记30分钟。细胞进行DAPI染色30分钟。之后，使用荧光显微镜、ImageJ软件和GraphPad Prism 8.0分析EDU阳性细胞。使用EDU染色增殖试剂盒(Abcam, ab222421)将EDU纳入。

RNA免疫沉淀(RIP)

使用EZ-Magna RIP rna结合蛋白免疫沉淀试剂盒(Millipore, Billerica, MA)进行RIP。用特制的RIP裂解缓冲液裂解细胞。细胞裂解液与所示抗体与混合蛋白A/ g珠一起在4℃下孵育过夜。采用qRT-PCR检测沉淀RNA。

RNA稳定性分析

用放线菌素D (5 μg/mL, Sigma)处理HCC827或NCI-H1975细胞0、2、4、6 h, TRIzol提取总RNA, qRT-PCR分析。

m6A RNA免疫沉淀试验(MeRIP)

用TRIzol (Beyotime)分离总RNA，然后超声处理成RNA片段。然后，RNA片段与抗m6A抗体(ab208577, Abcam)和蛋白A珠一起在4℃孵育10 h。蛋白-RNA复合物洗涤后用蛋白酶k处理，采用qRT-PCR检测免疫沉淀RNA。

核糖体免疫沉淀反应

用RPL22-Myc转染具有稳定shYTHDF1或shscr的HCC827或NCI-H1975细胞(Origene, Beijing, China)。48小时后，用RIPA缓冲液裂解细胞，然后用抗myc抗体(Abcam)与蛋白A珠混合在4℃下孵育8小时。以正常小鼠免疫球蛋白G (IgG)作为对照。蛋白-RNA复合物经蛋白酶k清洗处理后，采用qRT-PCR检测免疫沉淀RNA。

异种移植瘤模型

BALB/c裸鼠20只，6-8周龄，购自北京视固生物科技有限公司。小鼠随机分为四组(每组5只)。用慢病毒(Gene Pharma, Shanghai, China)感染并构建NCI-H1975/Vector + sh-NC、NCI-H1975/METTL3 + sh-NC、NCI-H1975/METTL3 + sh-YTHDF1、NCI-H1975/METTL3 + sh-FRAS1稳定细胞。各组采用皮下注射约1 × 10的方法建立异种移植⁶每只老鼠的细胞。每7天测量一次肿瘤体积。肿瘤体积计算为1/ 2 ×长×宽²．接种28 d后记录肿瘤重量。

统计分析

所有实验都独立重复至少三次。使用GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA)分析数据。采用Student's t检验分析组间差异。通过starbase RNA-RNA模块检测FRAS1与CDON表达的相关性(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)．P< 0.05为有统计学意义。

n6 -甲基腺苷(m6A)修饰和蛋白水平FRAS1在NSCLC中上调

利用TCGA-LUAD/LUSC数据库分别对METTL3和YTHDF1进行相关基因分析。FRAS1被鉴定为非小细胞肺癌(NSCLC)中与METTL3和YTHDF1最相关的基因，如图所示。1(R_METTL3= 0.730, r_YTHDF1= 0.452,P< 0.001，附加文件1:表S1)。接下来，我们发现了一个有趣的表型，在106对NSCLC肿瘤组织中，FRAS1的mRNA水平明显低于相应的正常组织(图2)。1B)而Kaplan-Meier绘图仪分析显示FRAS1高表达与NSCLC患者较短的总生存期相关(log rankP= 7 e-04,https://kmplot.com/analysis/,无花果。1C)，提示FRAS1可能是NSCLC的危险预后生物标志物。我们想知道是否有m6A的修饰FRAS1肺癌中的mRNA。的表达式求值FRAS1以及我们收集的LUAD样本中的m6A水平。根据公共数据库的分析，FRAS1与正常组织相比，肿瘤组织中mRNA水平降低(图;1D).然而，m6a水平和蛋白水平FRAS13例肿瘤组织明显高于配对的正常组织(图;1E, F).在NSCLC细胞系中也观察到类似的结果。FRAS1与人支气管上皮细胞HBEC相比，NSCLC细胞株A549、HCC827、NCI-H1975和NCI-H1299的mRNA水平下降(图;1G).的m6A水平和蛋白水平FRAS1在NSCLC细胞系中的表达高于HBEC(图。1H, I).这些结果表明m6A修饰FRAS1mRNA及其蛋白水平在NSCLC肿瘤组织中明显升高。

METTL3诱发FRAS1mRNA m6A修饰

新兴研究表明，m6A在信使RNA (mRNA)中发挥着重要作用，通过调控mRNA的加工、翻译或衰变[3.］．例如，m6A可以加速mRNA前体的处理时间，促进mRNA在细胞中的转运和成核速度[29，30.］．目的:探讨m6A修饰的调控机制FRAS1mRNA，我们关注m6A“作者”METTL3。我们观察到，与正常组织相比，METTL3在NSCLC肿瘤组织中高表达(图2)。2A).的m6A修饰位点FRAS1mRNA表达量用条带预测(http://www.cuilab.cn/sramp/) [31]，其中一致母题在终止符附近(图;2B).验证的存在FRAS1mRNA m6A甲基化，我们使用m6A抗体进行m6A免疫沉淀。采用qRT-PCR检测免疫沉淀RNA片段，如图所示。2C和2D。的m6A修改FRAS1在HCC827和NCI-H1975细胞中均检测到mRNA的表达。2此外，与shscr组相比，shMETTL3细胞(HCC827和NCI-H1975)的m6A甲基化水平显著降低(图。2D)。通过qPCR和western blot验证，shMETLL3的敲除效率为80%(图。2E).综上所述，这些结果表明METTL3可以促进FRAS1转录本m6A修改。

METTL3沉默导致FRAS1蛋白表达和细胞增殖下降

探讨mettl3调控的生物学功能FRAS1m6A修饰后，我们生成了两个稳定的mettl3沉默细胞(HCC827和NCI-H1975)。与shscr细胞相比，shMETTL3细胞的METTL3蛋白水平有效降低，FRAS1蛋白水平表达降低(图2)。3.A).对的改变没有影响FRAS1METTL3敲低后的mRNA(图;3.B)。此外，随着放线菌素D (ActD)治疗时间的延长，FRAS1蛋白水平不再降低，这表明METTL3依赖于m6A方式调节FRAS1的表达，但对FRAS1蛋白没有直接影响(图。3.C). CCK-8分析显示，稳定的mettl3沉默的HCC827和NCI-H1975细胞增殖下降(图。3.D)，与菌落形成结果一致(图;3.E).这些结果表明，METTL3改变FRAS1蛋白水平，但不影响mRNA水平，对细胞增殖有抑制作用。

YTHDF1在m6a修饰的FRAS1表达中起作用

M6A修饰的rna可以被M6A阅读蛋白识别并传递到下游通路。YTHDF1在NSCLC增殖中起关键作用[21在本研究中，我们通过UALCAN发现，与正常组织相比，YTHDF1在NSCLC肿瘤组织中高表达(图2)。4A)，表明YTHDF1可能在m6a调控的FRAS1表达中起关键作用。RIP实验验证了YTHDF1可以与FRAS1信使rna(无花果。4B).研究YTHDF1在m6a修饰调控中的作用FRAS1，我们构建了稳定的ythdf1沉默的HCC827和NCI-H1975细胞。qRT-PCR分析显示，YTHDF1在shYTHDF1细胞中表达明显下调FRAS1mRNA无明显变化，但蛋白水平明显下降(图;4C)。此外，我们进行了核糖体免疫沉淀，分析了ythdf1沉默对m6A修饰的核糖体占用的影响FRAS1信使rna。结果表明，核糖体占用FRAS1与对照细胞相比，ythdf1沉默细胞的mRNA水平降低。4D)。FRAS1YTHDF1缺失后，用ActD处理后mRNA的稳定性没有改变，说明YTHDF1不参与FRAS1RNA合成。接下来，为了研究YTHDF1是否参与FRAS1蛋白稳定性的调控，我们用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞。我们观察到，即使在MG132处理下，ythdf1沉默的细胞中，FRAS1蛋白仍然减少。4E)，表明YTHDF1可以调节FRAS1蛋白的稳定性，而不依赖于蛋白质降解途径。这些结果进一步表明，m6A阅读蛋白YTHDF1可能识别通过METTL3增加的FRAS1的m6A修饰。

METTL3诱导FRAS1 m6A修饰调节CDON表达

通过在线生物信息学分析，我们发现细胞粘附相关，癌基因调控(CDON)与FRAS1有很强的正相关。pearson分析显示，在NSCLC中，CDON与FRAS1的相关性最强(R = 0.61，图。5A). Starbase在线数据库显示，在526对NSCLC样本中，FRAS1和CDON之间存在很强的相关性(r = 0.505，P< 0.001，图;5B).此外，FRAS1过表达可以挽救shMETTL3细胞中的CDON蛋白水平(图。5C). CCK-8分析和菌落形成分析显示，过表达FRAS1可逆转METTL3敲低导致的增殖下降(图5)。5D, E).这些数据表明METTL3通过FRAS1调节细胞增殖。

此外，我们还通过引入靶向CDON的siRNA实现功能缺失，初步探索了CDON在HCC827和NCI-H1975细胞中的生物学作用。如附加文件所示，在si-CDON转染的细胞中，CDON在mRNA和蛋白水平上的表达显著降低1:无花果。S1A和1B。CCK-8检测结果显示，CDON下调导致细胞增殖减少1:图S1C)。一致地，我们还观察到，当CDON被执行EDU合并敲低时，EDU阳性细胞减少(附加文件)1:图S1D)。这些结果表明CDON可能在HCC827和NCI-H1975细胞中起致癌基因的作用。

FRAS1是n6 -甲基ladenosine METTL3在NSCLC中的靶点

进一步探讨mettl3诱导FRAS1m6A修饰对NSCLC细胞增殖的影响，在稳定的ythdf1沉默、fras1沉默的细胞中过表达METTL3进行拯救实验。qRT-PCR结果显示，mRNA水平无明显变化FRAS1mettl3过表达组与sh-YTHDF1 + mettl3过表达组比较(图6A). mettl3过表达诱导的FRAS1和CDON蛋白水平上调可以通过沉默YTHDF1或沉默FRAS1来恢复(图。6B)。此外，我们还发现METTL3过表达引起的cyclin D1 (CCND1)表达升高可以通过敲低YTHDF1或敲低FRAS1来逆转。CCND1它属于高度保守的周期蛋白家族，在多种肿瘤中调节细胞周期G1/S转变，促进细胞增殖[32，33，34］．我们还在收集的5个肿瘤样本中检测到了CDON、METTL3和YTHDF1蛋白的表达，如附加文件所示1:图S2。结果显示，在T1、T2、T3、T5肿瘤组织中，CDON的表达较相应的正常组织(T4样本)上调。五种肿瘤组织中YTHDF1和METTL3蛋白表达均高于配对正常组织。功能研究表明，通过CCK-8和集落形成试验分析，沉默YTHDF1或FRAS1也可以挽救mettl3过表达诱导的细胞增殖升高(图2)。6此外，我们还验证了CDON、YTDHF1和METTL3在收集的NSCLC肿瘤样本中的表达情况。观察到CDON、YTHDF1和METTL3在癌组织中较正常组织高表达(附加文件1:图S2)，表明FRAS1、CDON与METTL3/YTHDF1之间存在正相关关系。总之，我们的数据表明FRAS1是METTL3调节NSCLC细胞增殖的主要靶点。

mettl3诱导的FRAS1促进体内NSCLC肿瘤生长

为了验证METTL3/FRAS1轴在体内的作用，我们利用异种移植瘤模型验证了其对肿瘤生长的影响。如图所示。7， METTL3上调诱导的肿瘤过度生长被FRAS1或YTHDF1下调阻断，包括肿瘤体积和肿瘤重量(图2)。7a - c)。同样，当FRAS1或YTHDF1沉默时，METTL3过表达引起的FRAS1表达增加减少。7D).综上所述，mettl3诱导的FRAS1促进了体内NSCLC肿瘤的生长。

肺癌被认为是世界上癌症相关死亡的主要原因。m6A修饰异常与各种肿瘤进展密切相关。m6A调控因子在多种肿瘤中的作用已被广泛报道。然而，我们对m6A修饰在肺癌中的影响还知之甚少。本研究探讨了METTL3/YTHDF1/FRAS1 m6A在NSCLC细胞增殖中的作用和功能。

在本研究中，我们发现了一个有趣的现象，采集的LUAD组织中FRAS1的mRNA和蛋白水平存在明显差异，这在NSCLC细胞系中是一致的。即在mRNA水平上无显著差异FRAS1而与正常组织相比，LUAD肿瘤中FRAS1蛋白水平上调。但我们的结果与TCGA分析不一致，其中肺癌肿瘤组织的mRNA水平低于正常组织。有三个可能的原因。第一个原因是我们收集的样本数量较少，只有5对样本。我们将收集更多的样本来鉴定的表达FRAS1肿瘤组织与正常组织之间的mRNA水平。第二，TCGA数据库中肿瘤样本与正常样本未配对。表达上的差异FRAS1肿瘤组织与正常组织之间的RNA水平不能准确反映。第三，肺癌TCGA数据库包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的数据。我们收集的样本均为NSCLC。肺癌的类型可能导致我们的研究结果与TCGA数据分析结果不一致。此外，FRAS1表达增加与NSCLC患者总生存期缩短有关。这些结果表明，FRAS1可能是NSCLC的肿瘤促进因子和潜在的预后因素。此前有报道称，FRAS1在发育过程中表皮基底膜粘附过程中起重要作用[35］．近期研究表明FRAS1与肿瘤转移有关[24，25，36］．FRAS1被报道通过激活EGFR和PI3K信号通路促进胃癌肝转移[24］．在NSCLC中，研究发现FRAS1敲低可以通过抑制FAK信号通路来抑制HCC827细胞的迁移和侵袭[23］．在HCC827和NCI-H1975细胞中，FRAS1过表达可以挽救METTL3敲除导致的细胞增殖下降。反过来，FRAS1沉默可以逆转NSCLC细胞中METTL3过表达引起的细胞增殖升高。这是首次确定FRAS1在肺癌中促进细胞增殖的作用。

我们发现在基因的终止密码子附近存在保守的甲基化位点FRAS1信使rna。METTL3被称为n6 -甲基转移酶复合物的关键成分，通过RNA甲基化介导肿瘤的发生[37］．在这项研究中，我们发现METTL3在NSCLC肿瘤中高表达。甲基化RNA免疫沉淀显示FRAS1mRNA存在METTL3介导的m6A修饰。据报道，METTL3在一系列肿瘤中具有致癌或肿瘤抑制作用。例如，METTL3通过ythdf2依赖的方式调节SOCS2促进肝癌进展[9］．METTL3依赖于m (6)A修饰，通过调节HDGF表达促进胃癌进展[38］．在甲状腺乳头状癌(PTC)中，METTL3通过m6A/c-Rel/ il -8介导的中性粒细胞浸润抑制PTC进展[39］．METTL3已被确定为肺癌的治疗靶点。YAP可促进mettl3 - m6a - ythdf3依赖性肺癌干细胞的生成[14]， METTL3可逆转β-榄香烯对非小细胞肺癌吉非替尼的耐药性[40］．由于其在肺癌中的重要性，研究其具体的机制至关重要。在本研究中，我们观察到MELLT3的下调抑制了NSCLC细胞系HCC827和NCI-H1975细胞的增殖和集落形成。这是关于FRAS1 m6A修饰与肺癌细胞增殖相关性的首次研究。

已知m6A修饰物以m6A方式影响肿瘤发生。例如，METTL3可以通过促进EGFR或TAZ转录本的翻译来促进肺癌肿瘤的生长和侵袭，而不依赖于其催化活性[13］．在本研究中，我们发现METTL3上调引起的细胞增殖升高可以通过FRAS1沉默或YTHDF1沉默来恢复，这表明METTL3以m6a依赖性的方式影响NSCLC细胞增殖。然而，如果进行更多的研究，以确定其他转录者(如METTL4)是否可能对FRAS1 mRNA产生相互作用，或者是否涉及其他转录者(如YTHDF2)，则会更加完整。

据报道，M6A读取器负责甲基化mRNA的命运。我们的数据首次验证了YTHDF1可以促进m6a修饰的翻译FRAS1信使rna。这些数据与之前的研究是一致的[41］．然而，METTL3、YTHDF1和CDON在细胞和组织水平表达的一致性尚未得到验证。此外，ythdf1促进FRAS1蛋白稳定性控制的进一步生物学功能值得进一步研究。

m6A修饰是动态可逆的，可以被“擦除”m6A去甲基酶去除，如FTO、ALKBH5和去甲基酶等。有报道称FTO可通过触发PKM2去甲基化促进肝细胞癌的发生[42］．一项研究报道ALKBH5可以通过维持FOXM1的表达来维持胶质母细胞瘤干细胞样细胞的致瘤性[43］．在本研究中，我们主要关注“Writers”和“Readers”对FRAS1 m6A的修饰。研究FTO等擦除酶对FRAS1修饰的可能调控机制将是我们未来项目的研究方向，丰富FRAS1在NSCLC中的调控机制。

CDON(细胞粘附相关，癌基因调节)是一种激活SHH信号通路的细胞表面蛋白，在内皮细胞完整性中起重要作用[44，45］．目前，CDON被证实参与肿瘤的进展。有报道称CDON参与前列腺癌肿瘤细胞的生长和侵袭[41］．在本研究中，METTL3/YTHDF1提高FRAS1蛋白表达，从而加速细胞增殖和肿瘤生长(集落形成)。同时，我们观察到FRAS1可以调节CDON的表达。mettl3过表达细胞中CDON表达的增加通过FRAS1沉默或YTHDF1沉默被逆转。这些发现与之前的报道一致，即CDON对NSCLC癌细胞增殖和肿瘤发生至关重要[41］．

综上所述，我们的研究首次证明了FRAS1在NSCLC中的肿瘤启动子作用，并通过METTL3提供了m6a依赖的调控机制。m6A甲基转移酶METTL3通过增强FRAS1 mRNA m6A修饰和FRAS1转录稳定性来促进FRAS1蛋白水平。“writer”METTL3、“reader”YTHDF1和“target”FRAS1的调控网络激发了对m6A依赖基因在癌症生物学中的调控机制的理解，这为m6A调控因子作为NSCLC中有前景的生物标志物提供了可能性。

在当前研究期间生成的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

m6A:

N6-methyladenosine

非小细胞肺癌:

非小细胞肺癌

LUAD:

肺腺癌

FRAS1:

弗雷泽细胞外基质复合物亚基1

CDON:

细胞粘附相关，癌基因调控

METTL3:

甲基转移酶3,n6 -腺苷-甲基转移酶复合物催化亚基

YTHDF1:

YTH n6 -甲基腺苷RNA结合蛋白1

知识产权:

免疫沉淀反应

撕裂:

RNA免疫沉淀反应

存在:

定量逆转录-聚合酶链反应

cd:

编码序列

人力资源:

风险比

置信区间:

置信区间

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

CCK-8:

细胞计数试剂盒

EDU:

5-Ethynyl-2的脱氧尿苷

N/A

N/A

作者指出

1. 窦学军和王志远这些作者对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

1. 中国北京航天中心医院胸外科

   窦学军，王志远，卢伟强，苗立斌，赵岳峰

贡献

XD和ZW:项目设计、文献研究、临床研究、数据分析、稿件撰写和修改。WL、LM、YZ:文献研究、临床研究、数据分析、稿件起草。所有作者均已阅读并批准稿件。

相应的作者

对应到Xuejun窦．

相互竞争的利益

作者声明没有利益竞争。

伦理批准并同意参与

本研究是按照相关的指导方针和规定进行的。空间中心医院伦理委员会伦理审定(20200511-JJJHZ-01)。获得每位患者的书面知情同意书。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

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