细胞化学和比较转录组分析阐明了姜科三种花粉外壳的形成及其生态适应性

背景

开花植物花粉华丽的表面因其多样性一直令进化生物学家着迷和困惑。每个花粉粒都包含在由内壁和外壁组成的花粉壁中，外壁上覆盖着脂质花粉皮。花粉壁内、外壁组分发育的细胞学和分子生物学特征相对较好。然而，人们对赋予物种特异性的花粉外壳知之甚少。我们展示了姜科植物的三种类型的花粉被，一种是粘液状的花粉被，一种是口香糖状的花粉被，还有一种是被子植物的花粉被。采用细胞学、RNA-seq和正选择分析相结合的方法，研究了三种花粉外壳的形态差异及其形成的相关分子机制。

结果

与“典型的”花粉外壳相反，在具有粘液状(Caulokaempferia coenobialis(Cco)或口香糖状(Hornstedtia hainanensis双细胞花粉(BCP)发育阶段仍有花药室液存在。然而，这些物种之间存在显著差异:在BCP阶段，Hhn的花药室液含量远低于Cco的花药室液，其多糖含量较少，但脂质含量较高。Cco中特异性高表达(SHE)基因组在“多糖代谢过程”注释项中富集，而SHE- hhn中“脂肪酸降解”和“萜类和多酮类代谢”注释项显著富集。

结论

细胞学和比较转录组学分析表明，不同类型的花粉外壳取决于BCP阶段花药室液的残留量和成分。参与“多糖代谢”和“运输”的基因在粘液样花粉外壳的发育过程中，参与“脂质代谢”和“运输”的基因在口香糖样花粉外壳的发育过程中，可能都是在正选择的情况下进化的。我们认为开花植物从典型的花粉被向胶状或粘液状的花粉被转变是对高湿度和传粉媒介稀缺的栖息地的适应。

花粉粒是种子植物的小配子体，产生有性生殖所需的雄配子[1]。每个花粉粒都包含在由内壁和外壁组成的花粉壁中，外壁上覆盖着脂质花粉皮[2，3.]。花粉壁发育是一个复杂的过程，开始于小孢子的四分体阶段，当时小孢子周围的胼胝质被花药内绒毡层分泌的愈伤组织降解[4]。在这个阶段，年轻的小孢子形成主要由纤维素组成的原胺，它作为外叶前体沉积的精心模板[5，6]。孢粉素随后在绒毡层中合成并运输形成外壁;之后，由小孢子产生主要由果胶、纤维素和半纤维素组成的内质层[7，8，9]。成熟花粉粒的外壁通常被花粉皮覆盖，这是在花粉发育的最后阶段形成的[4，10]。遗传途径，SPL/出处-DYT1-TDF1-自动对盘及成交系统-MS188/MYB80-MS1，有人提出调节花粉壁的形成[11，12，13，14]，据报道，许多调节外周和内周发育的基因[9，15，16，17]。然而，很少有研究关注花粉外壳的发育[18]，花粉壁的一种多样化成分。

花粉皮是指花粉粒表面的粘附物质[19，20.，21]，如花粉基、tryphine和弹性粘素，它们都是由花药绒毡层的分泌和退化产生的[22，23，24]。花粉基，在双子房和单子房中最常见，是疏水性的，主要由花药绒毡层的质体(膨松体和/或球粒体)形成[10，23，25]。特里菲碱是十字花科植物中发现的一种由亲水性和疏水性物质混合而成的物质，它是由毡层的部分退化及其残留的细胞质内容物产生的[23，26]。弹性粘蛋白是一种黏性更强的物质，存在于兰科和芦花科中，它是在绒毡层细胞的细胞质中产生的，没有质体的参与[22，27，28]。实际上，花粉碱和弹性粘素都是花粉基的一种特殊形式，这三种花粉皮并没有太大的区别[22]。花粉皮最重要的功能被认为是它的黏合剂[10，29，30.，31]:它将花粉粒保存在花药中直至弥散，使二次花粉呈现，并在弥散前保持花粉粒成簇，促进花粉粘附到传粉者和柱头上。此外，花粉外壳还可能在授粉时吸引传粉者、识别和亲和性以及花粉水化和萌发等方面发挥重要作用。[qh]10]。虽然对花粉外壳类型的功能和多样性已经有了较详细的分类，但对花粉外壳发育的细胞学形态和相关分子机制的了解还很有限。

一般来说，花粉外壳主要由复合脂类、蜡酯类、类胡萝卜素、类黄酮和蛋白质组成[10，32]。尽管花粉外壳的成分各不相同，但脂质始终是主要成分[33]，而多糖很少被报道，例如在Tylosema esculentum(34]和三种单子叶海草，Thalassia hemprichii，Halophila stipulacea和Thalassodendron ciliatumsome(35]。由此可见，参与长链脂肪酸(LCFA)代谢和运输的基因对花粉被的形成至关重要。四种类型ECERIFERUM（CER)基因，包括CER1(36]，CER3(37),三CER2-LIKE基因(38),CER6(39，40]，被认为参与花粉外壳形成过程中的LCFA代谢;这些基因的突变导致花粉外壳形成缺陷和雄性不育。此外，有7个基因参与花粉皮生物合成，AtPKSA / B(2，41]，AtTKPR1/2(42]，AtLAP3(43),lac 1/4(44]，也参与外周和角质层蜡的生物合成，已经发现其突变体表现出异常的花粉外壳和外周形成，并伴有雄性不育。此外，由于绒毡层在花粉被前体的形成和运输中起着至关重要的作用，一些基因，特别是在绒毡层发育中起重要作用的ABC转运蛋白，也可能影响花粉被形成相关物质的运输。例如,ABCG9和ABCG31在绒毡层中高度表达，并参与花粉皮沉积[45]。的损失ABCG1和ABCG16功能导致绒毡层细胞的细胞结构异常(如绒毡体和脱质体，它们在花粉被成分的运输中起作用)和代谢异常，特别是影响与花粉被物质相关的过程[46]。然而，上述所有基因的信息主要来自于各自雄性不育突变体的分子遗传学和生化或细胞生物学研究，而不是来自于花粉外壳发育和形成的具体研究。人们对花粉外壳的化学性质及其生物合成和转移到花粉表面的途径知之甚少[24，47]。

姜科，由大约50属和1300种组成[48]，是一种天然的单系群体[49，50]。然而，这个科的成员表现出广泛的授粉和繁殖系统，包括专性异族通婚、兼性异族通婚和自婚;它们也由许多不同的动物授粉，如蜜蜂、太阳鸟和其他脊椎动物、甲虫和飞蛾[51，52，53，54，55，56，57]。从2002年开始，我们在中国热带和亚热带地区进行了十多年的野外调查，发现姜科植物的花粉外壳有三种类型。这些是1)大多数生姜品种的典型花粉外壳，例如;姜nudicarpum方丹(图)1一)和Pyrgophyllum yunnanense(Gagnepain)吴廷龙，陈志勇(图)1B)，这与大多数被子植物，如水稻和拟南芥，花粉粒有少量的花粉包皮，分布单一;2)胶状的花粉皮姜黄和Hornstedtia,例如,c . kwangsiensis和h . hainanensis吴廷亮，陈少杰(图)1C)，其中花粉粒被一种类似口香糖的物质覆盖;3)发现于Caulokaempferia coenobialis(汉斯)K.拉森(图)1D)，其中花粉粒被粘液包裹着[54，55，58]。因此，姜科植物是研究花粉外壳形成和发育及其进化意义的理想系统。随着下一代测序技术(NGS)的快速发展，RNA-seq技术变得更加高效和廉价，越来越多地被用于揭示在非模式植物的环境适应和器官发育中具有潜在作用的候选基因[59，60，61，62，63，64]。

本文选取了具有3种花粉外壳的4种姜，分别为:c . coenobialis(粘液样花粉皮);h . hainanensis(像口香糖一样的花粉外壳)和两个我们称之为“典型”花粉外壳的物种(云南木，云南木)，研究不同花粉外壳发育的细胞学形态及相关分子机制。我们采用细胞学、RNA-seq和阳性选择分析(使用PAML)等综合方法来阐明三种类型花粉被发育的差异。目的是探讨:1)三种花粉外壳的细胞学形态和化学性质的差异;2)分析不同类型花粉被膜的形成可能与哪些差异表达基因有关，确定参与花粉被膜发育的候选基因;3)不同类型花粉被的生态适应意义。这些结果可为了解姜科植物花粉外壳的发育、进化和适应对传粉策略和生境的响应提供基础。

不同花粉发育阶段的细胞学分析

细胞学观察表明，4种姜的花药均为四聚体。在MMC(小孢子母细胞)时期的横切面(图2)。2A, e, i;无花果。1A) 4种姜的小孢子母细胞呈椭圆形或角状，排列紧密。小孢子囊内未见腔室积液。

在TET(四元体)阶段(图。2B, f, j;无花果。1B)， 4种姜的花药室增大，房室液开始形成。单倍体小孢子四分体被胼胝质包膜包裹，房室液充满花药室。此外，在所有四分体的壁和所有四种姜的室液中都积累了大量的红色pas阳性物质，表明它们都含有胼胝质和多糖。至单核小孢子期，胼胝质降解，存在大量房室液，房室内有红色pas阳性物质，并包围着单核小孢子(图2)。2C, g, k;无花果。1C)。

在BCP(双细胞花粉)后期(图2)。2D, h, l;无花果。1D)，花药室进一步扩大，导致双细胞花粉粒之间有大量的空间。在Cco (Caulokaempferia coenobialis)，室室液(含高水平的多糖但低水平的脂质)的数量保持不变，并包围着双细胞花粉粒。与Cco相比，Hhn (Hornstedtia hainanensis在BCP晚期，胞液量及其多糖含量明显下降，而脂质(苏丹黑B阳性物质)明显检测到并积累到较高水平。相比之下，Pyn (Pyrgophyllum yunnanense)和Znu (姜nudicarpum)在BCP阶段。

基因注释与功能分类

Illumina测序共获得103500 ~ 174594个单基因，平均长度在682 ~ 763 bp之间。4种的N50值在1098 ~ 1213 bp之间。详细的从头组装结果总结在表S中1。长度在200-500 bp之间的Unigenes占总数的57%以上(Cco为60.16%，Hhn为57.21%，Pyn为61.34%，Znu为64.98%)。少于8%(分别为7.30%、7.76%、6.61%和7.16%)的单一基因长度超过2000 bp(图2)。3.一个)。

序列组装完成后，通过NCBI NR和NT、KEGG、SwissProt、PFAM、GO和KOG 7个功能数据库进行比对，对不同基因进行标注。NR数据库和SwissProt数据库的蛋白质匹配度分别为26.53 ~ 39.37%和22.70 ~ 32.48%。其中，4102 ~ 9979个unigenes(3.17 ~ 5.71%)被全部7个数据库成功注释，40660 ~ 96876个unigenes(38.56 ~ 55.48%)被至少一个数据库成功注释(表5)2）.在物种相似度方面，NR数据库中Cco的匹配序列比例最高的来源于穆萨acuminata(71.1%， 25681个)。其他物种的匹配率不超过5.5%，包括Elaeis guineensis(槟榔科)，含5.5%凤凰dactylifera(槟榔科)，占4.6%(图。3.B)。其他三种姜，Hhn, Pyn和Znu，给出了类似的结果(图2)。3.B)。

为了了解组装的单基因的潜在功能，使用了KOG(真核同源群)功能注释系统。kog注释的推测蛋白被划分为25类，其中“翻译后修饰、蛋白转换、伴侣蛋白”是最大的一类，分别占Cco、Hhn、Pyn和Znu的13.55%、12.48%、13.80%和14.23%，其次是Cco和Hhn的“一般功能预测”，Pyn和Znu的“翻译、核糖体结构和生物发生”。在所有四种姜中，最小的组是“细胞运动性”。表5给出了四个物种的推测蛋白的KOG注释的详细信息3.。

使用基因本体赋值对预测基因的功能进行分类，结果发现22.56-29.02%的单基因被赋值到至少一个GO项(表5)2）.BLASTable (E-value < 1e-6)基因分为生物过程、细胞组分和分子功能三大类。在4个生姜花药转录组谱中，3个氧化石墨烯类别的构成基本一致(图5)2）.此外，在KEGG数据库中对组装的单基因进行了注释(e值< 1e-10)，以确定4种生姜花药发育的生物学途径。在KEGG数据库中，共有9.28-15.68%的unigenes被映射(表5)2）.排在前三位的KEGG分类是“碳水化合物代谢”、“翻译”和“折叠、分类和降解”。这一特征在所有四个花药转录组中非常相似(表5)4）.

四种姜的转录本差异表达鉴定

4种姜在3个发育阶段的表达单基因数分别为82046 ~ 137234 (MMC)、76438 ~ 139559 (TET)和70013 ~ 152028 (BCP)。FPKM值变化很大，在0.3 ~ 400286之间(大于0.3的FPKM值被认为是确定表达)，其中在MMC、TET和BCP阶段检测到的高表达单基因数量分别为19098 ~ 34310、19111 ~ 34904和17504 ~ 38007。进一步的GO和KEGG功能分析集中在这些高表达基因上(图2)。4）.

细胞学结果表明，影响花粉外壳类型的主要事件发生在BCP期。因此，所有四种姜在BCP阶段的特异性高表达基因(SHE)(图2)。4C)，以了解不同类型花粉外壳的遗传基础:SHE-Cco是指与Pyn和Znu相比，仅在Cco中高表达的基因;SHE-Hhn是指与Pyn和Znu相比，仅在Hhn中高表达的基因;SHE-Pyn是指与Cco和Hhn相比，仅在Pyn中高表达的基因;而SHE-Znu是指与Cco和Znu相比，仅在Znu中高表达的基因。基于GO和KEGG注释的SHE基因集功能分析(图2)。5表55)显示，根据GO数据库，BCP阶段SHE-Cco单基因在“果胶分解代谢过程”、“多糖分解代谢过程”和“半乳糖酸代谢过程”等方面显著富集。根据KEGG分析，这些独特基因在“半乳糖代谢”、“碳水化合物代谢”和“内吞作用”等方面也显著富集。根据GO分析，SHE-Hhn单基因在“己糖代谢过程”、“还原性戊-磷酸循环”和“细胞氨基酸代谢过程”等方面显著富集。将SHE-Hhn集合分类为KEGG功能基团，发现在“半乳糖代谢”、“脂肪酸降解”和“萜类和多酮类代谢”等方面的独特基因显著富集(图2)。5表55）.根据KEGG分析，SHE-Pyn基因涉及“蛋白质家族:信号传导和细胞过程”、“转运体”和“其他次生代谢物的生物合成”等。5表55）.对于SHE-Znu组合，KEGG分析显示“其他次生代谢物的生物合成”、“苯丙类生物合成”和“碳水化合物代谢”以及“转运体”高度富集(图2)。5表55）.除了SHE-Znu中的“次级代谢过程”外，SHE-Pyn和SHE-Znu的单基因在与有机代谢相关的任何氧化石墨烯方面都没有显著富集。然而，根据KEGG分析，这两组基因都富含“转运蛋白”。

花粉外壳发育相关候选基因的鉴定

使用OrthoFinder，通过比较四个生姜转录集，共鉴定出2605个假定的同源词。这些直连词，和答:芥，其中花粉壁发育的基因已被很好地研究，并用于随后的进化分析。

为了估计Cco和Hhn分支与其他两个分支相比的谱系特异性进化率，我们使用了分支模型，该模型允许ω比率在系统发育树((Znu, Cco)， Pyn, Hhn)的分支之间变化，该模型由OrthoFinder中的iqtree模块生成。似然比检验结果表明，共有18个同源基因(10个同源基因)答:芥)和23个同源基因(12个同源基因)答:芥)在Hhn谱系中经历了正向的选择压力(表5)6）.在Cco家族中答:芥正交c74617_g1 (AT3G53510 /ABCG20)需要合成木素和完整的花粉壁，而c73851_g1 (AT3G02850 /SKOR)， c74617_g1 (AT3G53510 /ABCG20)和c16484_g2 (AT1G23090 /AST9)与传输函数有关。在Hhn支路中，c39068_g1 (AT1G12500)， c45170_g2 (AT3G02850 /SKOR)， c19830_g2 (AT4G02700)2 / SULTR3;)和c55055_g1 (AT1G64780 /AMT1; 2)具有物料输送功能，c120589_g1 (AT4G00360 /ATT1)与角质素的生物合成有关[65]， c15019_g1 (AT5G06090 / GPAT7)参与了cdp -二酰基甘油和木参素的生物合成[66]。

为了检测特定谱系中少数密码子的正选择，我们使用了优化的分支位点模型[67]。总共，我们确定了524(230)个同源词答:芥)和604(279个同源词)答:芥) Cco和Hhn谱系的psg(表5)7）.功能富集(图2)6表58)分析表明，根据KEGG数据库，在Cco谱系中鉴定的PSGs中，参与“凝集素”、“各种类型的n -聚糖生物合成”、“糖胺聚糖结合蛋白”和“运输”的基因显著富集。在Hhn谱系中，psg显著富集于”“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解”，“甘油脂代谢”和“丙酸代谢”基于KEGG分析。根据氧化石墨烯数据库，Cco和Hhn中的psg在运输和定位方面都显著丰富，术语包括“胞质运输”、“细胞内运输”、“有机物运输”、“逆行运输、内体到高尔基体”、“细胞大分子定位”和“细胞蛋白质定位”。特定于单一谱系的术语包括Cco的“囊泡介导转运”、“胞外过程”和“细胞分泌”，Hhn的“脂质转运”和“脂质定位”。

根据花粉外壳材料和先前报道的与花粉壁发育相关的基因，我们确定了59个和72个候选psg，它们可能参与Cco和Hhn的花粉外壳发育，主要与脂质代谢、碳水化合物代谢和运输有关(表5)9）.

双细胞花粉期花药室液的残留量和成分决定了不同种类的姜花粉被

在被子植物中，花粉在被绒毡层包围的封闭室中发育。在花粉发育过程中，花粉粒浸没在由绒毡层分泌的房室液(营养液)中，房室液将孢子体中的营养物质传递给发育中的花粉[68，69]。房室液被认为在二分体-四分体阶段开始形成，在花粉发育的不同阶段房室液的成分发生变化[23，69];我们在四种姜的细胞学观察中证实了这一点。2）.先前的研究表明，花粉发育早期的房室液主要含有多糖、果胶和蛋白质[69，70，71]，然后主要是花粉有丝分裂到花期的脂质[69]，然后在花粉几乎成熟时通过再吸收、蒸发或两者兼而有之的方式消失，使花粉得以传播[72，73]。最终，在几乎所有被子植物中，绒毡层都会退化并产生粘稠物质(即花粉被)，使花粉聚集在一起[73]。同样，我们用PAS和苏丹黑B染色的细胞学分析显示，在TET阶段，所有四种生姜的花药室都充满了含有大量多糖和少量脂质的液体(图2)。2）.在大多数被子植物中，包括百合属植物(69),拟南芥(32]，在Pyn和Znu的花粉发育的最后阶段，房室液体消失(“典型”花粉外壳)(图2)。2)，可能是通过再吸收，使花粉扩散。

但与以往研究不同的是，Cco(粘液样花粉被)在BCP后期仍有大量含有大量多糖和部分脂质的房室液，Hhn(口香糖样花粉被)仍有少量含有大量脂质和部分多糖的房室液(图2)。2）.因此，胶状花粉外壳(如Cco)和胶状花粉外壳(如Hhn)的发育不同于大多数被子植物(如水稻、答:芥,Pyn和Znu)。换句话说，与大多数被子植物不同，具有粘液状和胶状花粉外壳的物种从花粉有丝分裂到开花一直保持着花粉室液。SHE单基因集的功能注释也表明，具有“典型”花粉外壳的物种(Pyn, Znu)在BCP阶段富含“转运蛋白”，而具有口香糖样花粉外壳(Hhn)或粘液样花粉外壳(Cco)的物种则没有。然而，后两种类型的花粉外壳中室室液的数量和组成是不同的。与胶状花粉被(Cco)相比，胶状花粉被(Hhn)的房室液和多糖数量在BCP后期明显减少，脂质积累(图2)。2）.这也与SHE-Cco和SHE-Hhn基因的注释结果一致。SHE-Cco基因在“多糖代谢过程”和“果胶代谢过程”中富集，而SHE-Hhn基因中“脂肪酸降解”和“萜类和多酮类代谢”显著富集(图2)。5）.

在花粉发育的BCP阶段，花药室液的数量和成分决定了不同类型的花粉外壳。在花粉发育的后期，当花粉室液消失时，将形成一层“典型的”花粉外壳。但是，当花粉有丝分裂到开花期间房室液的量保持恒定，且房室液中含有大量的多糖和少量的脂质时，就会形成一层粘液状的花粉外壳。最后，在BCP后期，当房室液和房室液中所含的多糖数量均明显减少，但脂质含量积累时，形成胶状花粉。尽管胶状(Cco)、胶状(Hhn)和典型的(Pyn, Znu)花粉外壳在粘度和组成上有所不同，绒毡层在形成过程中的退化方式也有所不同，但它们是同源的，因为它们都是由花药绒毡层的最终降解产生的[23，24]。

姜科植物胶状和胶状花粉外壳发育的潜在基因

花粉发育已被广泛研究拟南芥和水稻，得到的结果表明一个保守的途径[9，15，16，17，74，75]。遗传途径，SPL/出处-DYT1-TDF1-自动对盘及成交系统-MS188/MYB80-MS1，有人提出调节花粉壁的形成[11，12，13，14]。迄今为止，已经确定了许多与绒毡层或花粉壁发育有关的基因。例如,TDF1(AT3G28470)在绒毡层的分化和功能中起重要作用[76]并在MMC阶段高度表达。的同系物分析TDF1在4种姜中表达谱相同(表5)10）.AtSUP(AT5G52560)被认为参与内部发育，并在BCP阶段高表达[77]。的同系物AtSUP在BCP阶段，4种姜中也有高表达(表5)10）.因此，四种姜的花粉壁发育可能涉及相同的保守途径拟南芥和米饭。

然而，在植物进化过程中，参与花粉发育的同源基因的功能可能在物种之间发生了多样化[15]，由于花粉壁结构的形态差异。因此，姜黄科的花粉壁由明显缩小的薄(膜状)外壁和非常厚(2-4层)且精细的内部结构组成[78，79，不同于拟南芥和米饭。在这种情况下，我们可以预期它们的同源基因的表达模式不同于拟南芥这是有数据支持的。例如,LAP3(AT3G59530),LAP5(AT4G34850),LAP6(AT1G02050)和ABCG26(AT3G13220)在拟南芥在胞外合成过程中，是胞外生产所必需的[2，43，80]。然而，在这一时期，它们在四种姜中的同源物完全没有表达。此外,TKPR1(AT4G35420)，其中拟南芥参与孢粉素单体生物合成途径，也是胞外素生产所必需的[42]，在MMC期和TET期高表达。相比之下，在研究的姜种中，除了Hhn外，在相同的发育阶段，同源基因的表达量相对较低(0.81-14.44)(表S)10）.的峰值表达TKPR1Hhn的同源基因(283.54)延迟到BCP阶段，表明Hhn的孢粉素生物合成被阻断，一些中间产物被保留，可能参与了胶状花粉外壳的合成。这些基因的功能还需要进一步的实验研究，但以上可以解释为什么姜科花粉具有显着减少的薄外皮。

功能富集分析表明，Cco和Hhn中可能参与花粉外壳发育的psg在转运和定位注释项上显著富集。这似乎是合乎逻辑的，因为在花粉发育过程中，营养液(房室液)由绒毡层分泌并运送到发育中的花粉中[68，69]，然后随着花粉的成熟最终被重新吸收和/或蒸发掉[73]。这些过程可能需要许多主要参与运输和定位的酶的参与。然而，Cco和Hhn的房室液体不会在开花时消失，这与大多数被子植物形成“典型”花粉的情况相反，例如Pyn和Znu。因此，参与黏液样(即Cco)和胶状(即Hhn)花粉外壳发育的运输和定位的基因可能是在正选择压力下进化而来的。此外，我们的研究结果表明，在“各种类型的n -聚糖生物合成”、“糖胺聚糖结合蛋白”、“囊泡介导转运”、“胞外过程”和“细胞分泌”等术语中显著富集的psg是Cco所特有的，而在“甘油脂代谢”、“脂质转运”、“脂质定位”等术语中显著富集的psg是Hhn所特有的。6）.这一结果与PAS和苏丹黑B染色的细胞学分析以及SHE-Cco和SHE-Hhn的富集分析(图2)一致。2）.上述结果表明，在粘液样花粉外壳(Cco)发育过程中参与“多糖代谢”和“运输”的基因，以及在胶质样花粉外壳(Hhn)发育过程中参与“脂质代谢”和“运输”的基因，可能是在正选择的作用下进化而来的。此外，Cco psg在“囊泡介导的运输”、“胞外过程”和“细胞分泌”方面显著富集，这可能与花粉发育过程中室内液体量保持不变有关。需要进一步的功能基因实验研究来澄清这些问题。

据我们所知，59个Cco和72个Hhn候选psg中只有2个被报道参与花粉外壳的形成。的拟南芥这些基因的同源物是AT1G68530 (AtCER6)及AT2G38110 (GPAT6）.第一个过程涉及到长链脂肪酸的合成，这是花粉外壳的组成部分;的确，花粉cer6突变株的花粉外壳减少，脂滴较少[39，81]。GPAT6在绒毡层和花粉被的内质网组装中起着至关重要的作用gpat6突变体负载不足[82]。除了这两个例子，其他候选psg在花粉外壳发育中的作用尚未阐明。这些表现出正选择特征的基因将为进一步研究花粉外壳在分子和表型水平上的特征提供基础。未来涉及实验和功能基因组学的研究可以为植物适应环境提供见解。

姜科植物的胶状和胶状花粉外壳是对高湿度和传粉媒介稀缺的生境具有显著生态适应性的例子

被子植物的花粉粒可以通过各种生物和非生物机制以单细胞或成群的形式运输到柱头[24]，花粉结构与之相适应[83，84]。花粉皮的主要功能是将单个花粉粒粘在一起，粘附在传粉者的身体上[10，提高授粉效率。在大多数被子植物中，花粉通常只有有限数量的花粉外壳，当花粉必须粘附在传粉者的光滑表面时，花粉外壳不足以完成粘附功能[85]，如鸟类光滑的喙和鳞翅目的下颌骨。对于生长在缺乏传粉媒介的栖息地的植物来说，这可能是一个问题，比如高湿度的森林栖息地和高山栖息地。在这种情况下，大量的花粉被变得很重要[86]，因为它提供了一种高粘性的液体，附着在传粉者身上，以提高传粉效率[87]。这是Cco和Hhn在我们的姜科研究中的情况，姜科是一种天然的单系植物，发现于热带和亚热带[48，49，50]。蜜蜂传粉被认为是姜科植物的传粉途径，但随后经历了许多独立的转变，从蜜蜂传粉到脊椎动物、太阳鸟、甲虫和飞蛾传粉[88]。Hhn和Cco都生长在亚热带森林山谷溪流附近的高湿度栖息地。我们的实地观察表明，Hhn和Hornstedtia scottiana共用相同的花朵图案(图2)。1G)和胶状花粉包膜的花粉粒，两者都表现出延迟自花传粉机制，包括花冠筒的伸长[51当由于缺乏传粉者而无法发生异花授粉时。然而,h . scottiana主要由热带溪岸的蜜水(一种太阳鸟)传粉[51这表明，从蜜蜂传粉到太阳鸟传粉的过渡可能会产生一层类似口香糖的花粉外衣。然而，在5年的田野调查中，我们没有观察到Hhn的传粉媒介。对于Cco来说，粘液状的花粉外壳在自花授粉过程中起着至关重要的作用，在自花授粉过程中，一层花粉膜通过液化的花粉外壳从花药(花粉囊)中运输出来，花粉外壳沿着花柱横向滑动，进入个体自身的柱头[54]。虽然凤仙花是自花授粉，但它保留了蝴蝶传粉花的特征。1H) (58]。这表明，粘液状的花粉外壳可能是由蜜蜂传粉过渡到飞蛾传粉，然后再过渡到自花传粉以保证生殖安全的结果。

本文认为，姜科植物从“典型”的花粉被转变为胶状或粘液状的花粉被是对高湿度和传粉媒介稀缺的栖息地的一种适应。类似的，但在进化上独立的转变可能发生在其他被子植物群中，如Souroubea guianensis马葛科[89]，Symphonia globulifera菊科植物[90),Chamelaucium钩骨桃金娘科[91]。在高湿度和缺乏传粉者的栖息地，大量粘稠的花粉外壳可以将花粉粒保持在花药中，在授粉过程中使花粉粒保持在一起，并保护它们在传粉者，特别是“低梳理”传粉者(例如鸟类和鳞翅目)到访之前不被冲走。[90，92]。此外，大量粘稠的花粉皮有利于更多的花粉附着在鸟类或鳞翅目光滑的表面，从而提高授粉效率。

本文首次获得了姜科植物花粉发育的基因组资源，为不同类型花粉外壳发育的细胞学形态和分子机制提供了新的见解。细胞学和比较转录组学分析表明，不同类型的花粉外壳取决于BCP阶段花药室液的残留量和成分。与大多数被子植物具有“典型”的花粉外壳不同，在BCP后期，Cco(粘液样花粉外壳)仍有大量含有大量多糖但脂肪含量很少的房室液，而Hhn(口香糖样花粉外壳)仍有少量含有大量脂肪的房室液。在粘液样花粉外壳(Cco)的发育过程中参与“多糖代谢”和“运输”的基因，以及在胶质样花粉外壳(Hhn)的发育过程中参与“脂质代谢”和“运输”的基因，可能在这两种情况下都是在正选择下进化的。我们认为姜科植物从典型的花粉外壳向胶状或粘液状的花粉外壳的转变代表了对高湿度和传粉媒介稀缺生境的适应。

花粉发育不同阶段的种类、样品制备及细胞学分析

Caulokaempferia coenobialis(Hance) K. Larsen (Cco)是一种多年生落叶草本植物，高可达50厘米，是中国南方特有的植物，生长在潮湿的悬崖上，通常沿着季风森林的溪流生长。该植物五月至八月开花(图。1H)，花粉粒悬浮在粘液状的花粉皮上，帮助花粉向柱头滑动，实现自花授粉[54，55，58]。Hornstedtia hainanensisT. L. Wu & S. J. Chen (Hhn)是一种巨大的常绿根茎草本植物，高可达2.5米，花序短，侧向，深红色，可半嵌入地面，这也是中国南方特有的，主要生长在山谷或湿润季风森林溪流旁的山坡上。该植物三月至五月开花(图。1G)，花粉粒被花药中的一层胶状的花粉外壳包裹，直到花冠筒伸长以实现延迟自花授粉，类似于Hornstedtia scottiana(51]。Pyrgophyllum yunnanense(Gagnepain) T. L. Wu & Z. Y. Chen (Pyn)是一种多年生落叶草本植物，高度可达55 cm，根状茎和块茎较短，生长于海拔1300-2800 m的开阔森林或散布乔灌木的生境中;它是中国西南地区特有的。这种植物从7月到9月开花。1F)并以各种异交授粉综合征为特征;它的花很少有昆虫光顾，因此大多是自花授粉的[53，55]。姜nudicarpum方丹(Znu)是一种多年生常绿草本植物，最高可达2.5 m，主要分布于中国南方、越南和泰国，常生长在山地边缘的阔叶常绿林中。该植物五月至七月开花(图。1E)并且通常由寄生蜂授粉[93]。虽然Pyn和Znu的生境和授粉机制不同，但它们的花粉粒都含有有限数量的花粉外壳(即“典型”花粉外壳)，并且是单一分布的。的植物标本馆券c . coenobialis(WYQ-HHDBJ-5),h . hainanensis(WYQ-06-1),p . yunnanense(LGH-BYJ-2)和z nudicarpum(WYQ-14-24)保存于华南师范大学生命科学学院标本室。该物种由华南师范大学生命科学学院的王应强教授鉴定。野外工作许可证由白冲省自然保护区管理局、鼎湖山国家级自然保护区管理局和南昆山省级自然保护区管理局颁发。样本收集工作和分子实验符合当地立法、国家和国际准则，不涉及受保护物种。我们也遵守《濒危野生动植物种贸易公约》。

从生长于自然生境的植物上采集了四种不同发育阶段的新鲜花蕾。在双目显微镜下仔细切除花药，根据花药的长度和花粉发育阶段进行测量和分类。在蔡司AX10光学显微镜(Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Germany)下，测定了四个发育阶段，即小孢子母细胞(MMC)期、四分体(TET)期、单核小孢子期和双细胞花粉(BCP)期。

为了准确地确定花粉发育过程中的形态学和组织学事件，对4种姜的花药进行了半薄切片细胞学检查。半薄切片用2.5%戊二醛在0.1 M KH下固定花药₂阿宝₄缓冲液(pH 7.2)。样品在缓冲液中洗涤，用1% OsO后固定₄隔夜，用丙酮系列脱水，包埋在Epon 812树脂中，60℃固化。采用Leica Reichert Ultracut S超微切片机(Leica, Austria)，用玻璃刀切割半薄(1-2 μm)切片。采用周期性酸-希夫(PAS)染色法检测多糖，切片在0.3%硝酸中0.5%周期性酸氧化10分钟，在流水中冲洗1-2分钟，最后在蒸馏水中冲洗，在希夫试剂中染色60分钟，在0.5%偏亚硫酸钠中洗涤3次，每次2分钟，在流水中冲洗5分钟，然后转移到蒸馏水中。为了检测脂质，切片在70%乙醇中冲洗1 - 2分钟，用新鲜的1%苏丹黑B在70%乙醇中60℃染色10分钟，在70%乙醇中冲洗1分钟，然后转移到蒸馏水中[94]。切片检查和拍摄使用蔡司AX10研究显微显微镜(卡尔蔡司显微成像有限公司，耶拿，德国)。

RNA提取与测序

通过转录组分析，获得4种不同花粉外壳类型姜的全基因组基因表达谱。采用RNAprep Pure (DP441)软件(TIANGEN, Beijing, China)提取小孢子母细胞、四分体和双细胞花粉期花药的总RNA。使用Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies, CA, USA)的RNA Nano 6000 Assay Kit评估RNA完整性。利用聚t寡聚磁珠从总RNA中纯化mRNA。在Illumina Novaseq平台上对双链cDNA进行测序，得到150 bp的成对末端reads。这些实验由北京诺创基因有限公司(https://www.novogene.com(中国北京)。

从头组装和注释

fastq格式的原始读取首先通过内部Perl脚本处理。在这一步中，通过从原始数据中去除包含适配器、包含poly-N的读取和低质量读取来获得干净读取。同时计算洁净数据的Q20、Q30和GC含量。所有下游分析均基于高质量的干净数据。转录组组装使用Trinity [95min_kmer_cov默认设置为2，其他参数默认设置为default。根据与NCBI非冗余蛋白数据库(NR)、Swiss-Prot蛋白数据库(Swiss-Prot，http://www.expasy.ch/sprot)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、http://www.genome.jp/kegg/) ［96，97]，同源群数据库(COG)，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、基因本体(GO)数据库和NCBI核苷酸数据库(NT)。通过Cuffdiff软件估计每个基因的表达量(每千个外显子模型千碱基片段数/百万个映射片段数，FPKM)。特异性高表达基因(FPKM≥第3四分位数，用于定义高表达基因的标准)和阳性选择基因(psg)的GO和KEGG富集分析由clusterProfiler R包实现[98]及TBtools [99]。

同源基因鉴定及Ka/Ks分析

利用OrthoFinder v2.3.11软件对姜科四种植物进行同源蛋白群推断[One hundred.]，截止e值设为1e⁻⁵。仅保留一对一的正交物以供进一步分析。使用MAFFT v7.313 [101]，密码子对齐模式。利用IQ-tree内置的OrthoFinder自动参数生成物种树;1000次启动重复用于评估分支可靠性。

非同义(Ka) /同义取代(Ks)率(ω = Ka / Ks)是选择压力的度量，ω > 1、= 1和< 1分别表示正选择、中性选择和净化选择。ω比值的估计使用基于密码子的最大似然(ML)模型，该模型实现于PAML 4.9 [j]中的codeml程序中。102，103]。在我们对每个基因的分析中，我们使用了一个广为接受的四个物种的系统发育作为输入树。使用分支模型和分支站点模型，并估计每个模型的ML分数。在PAML中，Cco或Hhn为前景分支，另外两个物种(具有“典型”花粉外壳)为背景分支。这些分析使用LMAP v1.0.2 [104]。我们使用BLAST v2.2.28 + (e-value = 1e)⁻⁵)寻找他们的同源基因拟南芥对这些生姜同源物进行功能分析。为了便于比较4种姜的单基因表达，所有的单基因也被转化为同源基因答:芥。

测序结果已提交给NCBI SRA，可通过NCBI BioProject登录号PRJNA793275 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA793275/）.

BCP:

双细胞的花粉

英国石油公司:

生物过程

Cco:

Caulokaempferia coenobialis

FPKM:

每千个碱基外显子模型的片段数每一百万个映射片段数

走:

基因本体论

Hhn:

Hornstedtia hainanensis

卡:

产生的替换

KEGG:

京都基因和基因组百科全书

Ks:

同义替换

MMC:

小孢子母细胞

MSP:

小孢子

病人:

花粉粒

Pyn:

Pyrgophyllum yunnanense

她:

特定的高表达基因

师:

毯

春节:

四分体

Znu:

姜nudicarpum

我们感谢黄蓉和肖美华的现场协助。感谢白冲省自然保护区管理局、鼎湖山国家级自然保护区管理局、南昆山省级自然保护区管理局允许我们采集植物样本。

国家自然科学基金与广东省人民政府联合基金项目(No. 1132@qq.com)资助;国家自然科学基金(No. 30770376、30570116)、广东省自然科学基金重点项目(No. 7117864)资助。

作者指出

1. 吕国辉和许家玲对这项工作也有同样的贡献。

作者及单位

1. 华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物技术重点实验室，广州510631

   卢国辉，徐家玲，钟曼祥，李东丽，陈敏，李克婷，王应强

2. 华南师范大学生命科学学院，广州亚热带生物多样性与生物监测重点实验室，广州510631

   吕国辉，王应强

贡献

王永强构思研究，设计实验，进行田野调查，分析所有数据，并撰写手稿;吕g.h.进行田野调查，进行解剖和分子实验，分析所有数据，并撰写稿件;徐建立，李德立，钟明祥，李坤涛。进行解剖实验;陈先生进行了部分实地考察和分子实验;所有作者都收集了现场样本，并参与了稿件的修改。作者阅读并批准了最后的手稿。

相应的作者

对应到Ying-Qiang王。

伦理批准并同意参与

研究符合当地和国家有关植物使用的规定。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

伟德体育在线施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议，该协议允许以任何媒介或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您适当地注明原作者和来源，提供知识共享许可协议的链接，并注明是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可协议中，除非在材料的署名中另有说明。如果材料未包含在文章的知识共享许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超过允许的用途，您将需要直接获得版权所有者的许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。创作共用公共领域免责声明(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据，除非在数据的信用额度中另有说明。

转载及权限